ppt 关于博奥定量RT-PCR
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2019年-BioRad定量PCR说明书-PPT精选文档
PCR仪 + 监测、分析系统 + 荧光标记
定量PCR仪应该具备的特点： 先进的光路设计----多孔样品同时检测
Fluorescence Detection
Emission Filtter
Light Source
Multiplexing----同时检测5色荧光
•无法对扩增反应实时检测
PCR: Theory vs. Reality
• C(t)s from 96 replicates are nearly identical, but the final fluorescence varies.
End Point
Cycle
Real-Time PCR
实时定量PCR技术，是指在PCR反应体系中 加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通 过Ct值和标准曲线对样品中的未知样品 的起始浓 度进行定量的方法。
采用多点温控和传 感技术，可以实现 梯度PCR功能
温度梯度选择可以 允许使用者在同一 次扩增中优化复性 温度。
定量PCR仪应该具备的特点： 消耗品成本低，样品容量大
同时扩增和检测96个样品
采用0.2ml的离心管, 排管和 96 孔PCR反应板。 降低消耗品成 本。
Introduction to Quantitative PCR
Reality vs. Theory
Amplification is exponential, but the exponential increase is limited:
A linear increase follows exponential
Eventually plateaus
Theoretical
定量PCR仪应该具备的特点： 先进的光路设计----多孔样品同时检测
Fluorescence Detection
Emission Filtter
Light Source
Multiplexing----同时检测5色荧光
•无法对扩增反应实时检测
PCR: Theory vs. Reality
• C(t)s from 96 replicates are nearly identical, but the final fluorescence varies.
End Point
Cycle
Real-Time PCR
实时定量PCR技术，是指在PCR反应体系中 加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通 过Ct值和标准曲线对样品中的未知样品 的起始浓 度进行定量的方法。
采用多点温控和传 感技术，可以实现 梯度PCR功能
温度梯度选择可以 允许使用者在同一 次扩增中优化复性 温度。
定量PCR仪应该具备的特点： 消耗品成本低，样品容量大
同时扩增和检测96个样品
采用0.2ml的离心管, 排管和 96 孔PCR反应板。 降低消耗品成 本。
Introduction to Quantitative PCR
Reality vs. Theory
Amplification is exponential, but the exponential increase is limited:
A linear increase follows exponential
Eventually plateaus
Theoretical
定量PCR技术35页PPT
定量PCR技术
36、如果我们国家的法律中只有某种 神灵， 而不是 殚精竭 虑将神 灵揉进 宪法， 总体上 来说， 法律就 会更好 。—— 马克·吐 温 37、纲纪废弃之日，便是暴政兴起之 时。— —威·皮 物特
38、若是没有公众舆论的支持，法律 是丝毫 没有力 量的。 ——菲 力普斯 39、一个判例造出另一个判例，它们 迅速累 聚，进 而变成 法律。 ——朱 尼厄斯
55、 为 中 华 之 崛起而 读书。 ——周 恩来
40、人类法律，事物有规律，这是不 容忽视 的。于困约 ，而败 于奢靡 。——陆 游 52、 生 命 不 等 于是呼 吸，生 命是活 动。——卢 梭
53、 伟 大 的 事 业，需 要决心 ，能力 ，组织 和责任 感。 ——易 卜 生 54、 唯 书 籍 不 朽。——乔 特
36、如果我们国家的法律中只有某种 神灵， 而不是 殚精竭 虑将神 灵揉进 宪法， 总体上 来说， 法律就 会更好 。—— 马克·吐 温 37、纲纪废弃之日，便是暴政兴起之 时。— —威·皮 物特
38、若是没有公众舆论的支持，法律 是丝毫 没有力 量的。 ——菲 力普斯 39、一个判例造出另一个判例，它们 迅速累 聚，进 而变成 法律。 ——朱 尼厄斯
55、 为 中 华 之 崛起而 读书。 ——周 恩来
40、人类法律，事物有规律，这是不 容忽视 的。于困约 ，而败 于奢靡 。——陆 游 52、 生 命 不 等 于是呼 吸，生 命是活 动。——卢 梭
53、 伟 大 的 事 业，需 要决心 ，能力 ，组织 和责任 感。 ——易 卜 生 54、 唯 书 籍 不 朽。——乔 特
RTPCR(共47张PPT)
大于0.99 真正的信号:荧光信号超过域值
实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值
Ct值的定义：
PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经 过的扩增循环次数
C(t) value
纵轴：荧光信号量
实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值的重现性
横轴：PCR反映循环数
Ct值的特点：
EXON 1 EXON 1
INTRON 2 EXON 2
EXON 2
DNA RNA
PRIMER PREMIER 5.0
上机操作
点击
运行程序
保存
结果分析
难以查找原因。
• Buffer and dNTPs Ex：扩增效率
实时荧光定量PCR定义
• Template
cDNA
Real-time PCR
Real-time PCR
引物设计
• 总原则与普通PCR相同 –避免引物二聚体，避免二级结构 • 尽量小些 （70 - 300bp) • 目标区段位置：考虑目标剪接体 • 推荐做跨intron设计
实时荧光定量PCR法
染料法举例
SYBR Green法研究CDK6 在
肺癌组织标本中的表达差异
实验步骤
流程示意图
TaqMan法举例
材料准备
从正常肺组织中提取的总 RNA 从肺癌组织中提取的 总RNA
-Trizol 最常用 -裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸呱， SDS） -液氮
-RNA保存液
小心DNA污染！ -使用DEPC处理相关器材
TaqMan法
优缺点
25
实时荧光定量PCR原理 相对定量
以各自样本中内参（housekeeping）基因为标杆，
实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值
Ct值的定义：
PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经 过的扩增循环次数
C(t) value
纵轴：荧光信号量
实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值的重现性
横轴：PCR反映循环数
Ct值的特点：
EXON 1 EXON 1
INTRON 2 EXON 2
EXON 2
DNA RNA
PRIMER PREMIER 5.0
上机操作
点击
运行程序
保存
结果分析
难以查找原因。
• Buffer and dNTPs Ex：扩增效率
实时荧光定量PCR定义
• Template
cDNA
Real-time PCR
Real-time PCR
引物设计
• 总原则与普通PCR相同 –避免引物二聚体，避免二级结构 • 尽量小些 （70 - 300bp) • 目标区段位置：考虑目标剪接体 • 推荐做跨intron设计
实时荧光定量PCR法
染料法举例
SYBR Green法研究CDK6 在
肺癌组织标本中的表达差异
实验步骤
流程示意图
TaqMan法举例
材料准备
从正常肺组织中提取的总 RNA 从肺癌组织中提取的 总RNA
-Trizol 最常用 -裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸呱， SDS） -液氮
-RNA保存液
小心DNA污染！ -使用DEPC处理相关器材
TaqMan法
优缺点
25
实时荧光定量PCR原理 相对定量
以各自样本中内参（housekeeping）基因为标杆，
RTPCR实验报告课件
逆转录pcrrt-pcr）和及时为反转录rcr （ reverse transcription pcrpcr （ real time pcr）共同的缩写。
逆转录pcr ，或许称反转录pcr(reversetranscription-pcr, rt-pcr) ，是聚合酶链式反响 (pcr) 中，一条 rna 链被逆转录成为互补 dna ，再以此为模板经过的一种宽泛应用的变形。
在pcr 进行dna 扩增。
rt-pcr由一条rna 单链转录为互补dna(cdna) 称作“逆转录” ，由依靠rna 的dna 聚合酶（逆转录酶）来达成。
随后，dna 的另一条链经过脱氧核苷酸引物和依靠rna 的dna 聚合酶达成，随每个循环倍增，即往常的pcr 。
原来的rt-pcr的指数扩增是一种很敏捷的技术，于遗传病的诊疗，并且能够用于定量监测某种rna 模板被rna 酶 h 降解，留下互补dna 。
能够检测很低拷贝数的rna 。
rt-pcr宽泛应用rna的含量。
（检测基因表达的方法，拜见northern blot 法。
）rt-pcr 作“ 定量有时也会指代及时pcr ” (quantitative pcr)pcr(real-time pcr)。
为了与逆转录或许rtq-pcr(real-time quantitative pcr)pcr 相差别，往常被写。
及时pcr及时为基础进行pcr(real-time pcr)dna 的定量剖析。
，属于定量pcrreal time pcr（ q-pcr）的一种，以一准时间内dna 的增幅量的定量使用萤光色素，当前有二种方法。
一种是在ds dna 中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅dna 序列中特定寡核酸序列相联合的一种萤光探针（probe ）。
real time pcr 与reverse transcription pcr 相联合，能用微量的rna 来找出特准时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。
Bio-Rad定量PCR说明书.ppt
Introduction to Quantitative PCR
PCR仪 + 监测、分析系统 + 荧光标记
定量PCR仪应该具备的特点：杰出的温度控制
• 采用半导体加热和制冷 • 加热速度 3.3°C /秒 ，制冷速度
2°C/秒 • 升降温速度可调 • 控温准确性：±0.3℃
定量PCR仪应该具备的特点：梯度PCR功能
采用多点温控和传 感技术，可以实现 梯度PCR功能
温度梯度选择可以 允许使用者在同一 次扩增中优化复性 温度。
定量PCR仪应该具备的特点： 消耗品成本低，样品容量大
同时扩增和检测96个样品
采用0.2ml的离心管, 排管和 96 孔PCR反应板。 降低消耗品成 本。
Introduction to Quantitative PCR
•无法对扩增反应实时检测
PCR: Theory vs. Reality
• C(t)s from 96 replicates are nearly identical, but the final fluorescence varies.
End Point
Cycle
Real-Time PCR
实时定量PCR技术，是指在PCR反应体系中 加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通 过Ct值和标准曲线对样品中的未知样品 的起始浓 度进行定量的方法。
Quantitative PCR /Real time PCR
▪ Quantitative PCR 或 Real time PCR 是确定样品中DNA (或 cDNA) 拷贝 数最敏感、最准确的方法
PCR: Theory vs Reality
《RTPCR技术原理》课件
RTPCR技术原理
RTPCR是一种常用的遗传学分析技术，通过在实验室中模拟自然界的PCR过 程，扩增DNA片段，从而实现对基因的分析和研究。
RTPCR技术原理
什么是RTPCR技术
RTPCR技术是一种基于PCR扩增原理开发而来的遗传学分析方法，可以高效地复制和研究 DNA序列。
RTPCR技术的优点
RTPCR技术具有高灵敏度、高特异性、高通量和快速等优点，成为现代分子生物学研究中 不可或缺的工具。
RTPCR技术利用PCR反应中的循环式 扩增机制，快速复制目标DNA序列， 从而使其在检测中能够得到可靠的结 果。
RTPCR技术原理
RTPCR技术的应用领 域
RTPCR技术在医学领域被 广泛应用于疾病诊断、遗 传性疾病筛查、药物研发 等方面。
RTPCR在食品安全领 域的应用
RTPCR技术可以用于检测 食品中的致病菌、转基因 成分、有害物质等，保障 食品安全。
RTPCR技术原理
1
RTPCR反应体系组成
2
RTPCR反应体系包括RNA、逆转录酶、
引物、酶、核酸酶和缓冲液等多种组
分，以保证反应的高效、特异性和稳
3
Байду номын сангаас
定性。
RTPCR流程介绍
RTPCR技术包括反转录和PCR两个基 本步骤，通过这两个步骤可以将RNA 转录为cDNA并扩增目标DNA序列。
RTPCR放大机制
2 RTPCR技术的发展趋势
RTPCR技术将更加智能化、快速化、低成本化，实现更高效的基因分析和诊断。
3 RTPCR技术的未来应用简述
RTPCR技术有望在个性化医疗、精准农业和环境污染治理等领域得到更广泛的应用。
RTPCR技术原理
RTPCR是一种常用的遗传学分析技术，通过在实验室中模拟自然界的PCR过 程，扩增DNA片段，从而实现对基因的分析和研究。
RTPCR技术原理
什么是RTPCR技术
RTPCR技术是一种基于PCR扩增原理开发而来的遗传学分析方法，可以高效地复制和研究 DNA序列。
RTPCR技术的优点
RTPCR技术具有高灵敏度、高特异性、高通量和快速等优点，成为现代分子生物学研究中 不可或缺的工具。
RTPCR技术利用PCR反应中的循环式 扩增机制，快速复制目标DNA序列， 从而使其在检测中能够得到可靠的结 果。
RTPCR技术原理
RTPCR技术的应用领 域
RTPCR技术在医学领域被 广泛应用于疾病诊断、遗 传性疾病筛查、药物研发 等方面。
RTPCR在食品安全领 域的应用
RTPCR技术可以用于检测 食品中的致病菌、转基因 成分、有害物质等，保障 食品安全。
RTPCR技术原理
1
RTPCR反应体系组成
2
RTPCR反应体系包括RNA、逆转录酶、
引物、酶、核酸酶和缓冲液等多种组
分，以保证反应的高效、特异性和稳
3
Байду номын сангаас
定性。
RTPCR流程介绍
RTPCR技术包括反转录和PCR两个基 本步骤，通过这两个步骤可以将RNA 转录为cDNA并扩增目标DNA序列。
RTPCR放大机制
2 RTPCR技术的发展趋势
RTPCR技术将更加智能化、快速化、低成本化，实现更高效的基因分析和诊断。
3 RTPCR技术的未来应用简述
RTPCR技术有望在个性化医疗、精准农业和环境污染治理等领域得到更广泛的应用。
RTPCR技术原理
定量RT-PCR原理 PPT课件
确定足够的样品数，保证可对PCR扩 增产物量间差异进行统计分析。
非竞争性RT-PCR
目前主要采用荧光实时RT-PCR， 放射性标记核苷酸的方法已基本淘汰。
实时RT-PCR
实时RT-PCR就是在PCR扩增的每一个循 环后分别检测其PCR产量，借助计算机数据 处理，可以描绘出PCR扩增循环过程中PCR产 物变化曲线。
主要内容
1. Taqman探针原理 2. CT值和阈值的确定 3. ROX内参比荧光的作用 4. IPC内对照的作用
退火，开始延伸
Forward 5’Primer
3’
5’
TaqMan®
R Probe Q
5’
3’ 5’
Reverse Primer
替换
Forward
R
5’Primer
3’
5’
Q
5’
未知样品 标准品：产生标准曲线
内参比（Internal Standard）－ROX 校正样品管和加样误差
内对照（Internal Control）： 校正扩增效率的误差
+/-对照：检验试剂和仪器的可靠性 6次重复：满足统计学要求
多色荧光技术
准确的荧光定量要求ROX校正和IPC校正 检材和对照最好在同一反应管中，误差最小 多重检测要求仪器有多种荧光检测能力 只有ABI的仪器才具有四色检测能力：
William P. Halford:
是否只有竞争性RT-PCR才能精确定量？
竞争性RT-PCR
PCR的终产物量取决于靶序列与竞争性 序列量的起始比例。
理想情况下，靶序列与参照物以相同 的效率扩增，在琼脂糖凝胶电泳中区别开 。
竞争性RT-PCR
参照物片段分两类: - 同源性片段——与靶序列只有微小差 别
非竞争性RT-PCR
目前主要采用荧光实时RT-PCR， 放射性标记核苷酸的方法已基本淘汰。
实时RT-PCR
实时RT-PCR就是在PCR扩增的每一个循 环后分别检测其PCR产量，借助计算机数据 处理，可以描绘出PCR扩增循环过程中PCR产 物变化曲线。
主要内容
1. Taqman探针原理 2. CT值和阈值的确定 3. ROX内参比荧光的作用 4. IPC内对照的作用
退火，开始延伸
Forward 5’Primer
3’
5’
TaqMan®
R Probe Q
5’
3’ 5’
Reverse Primer
替换
Forward
R
5’Primer
3’
5’
Q
5’
未知样品 标准品：产生标准曲线
内参比（Internal Standard）－ROX 校正样品管和加样误差
内对照（Internal Control）： 校正扩增效率的误差
+/-对照：检验试剂和仪器的可靠性 6次重复：满足统计学要求
多色荧光技术
准确的荧光定量要求ROX校正和IPC校正 检材和对照最好在同一反应管中，误差最小 多重检测要求仪器有多种荧光检测能力 只有ABI的仪器才具有四色检测能力：
William P. Halford:
是否只有竞争性RT-PCR才能精确定量？
竞争性RT-PCR
PCR的终产物量取决于靶序列与竞争性 序列量的起始比例。
理想情况下，靶序列与参照物以相同 的效率扩增，在琼脂糖凝胶电泳中区别开 。
竞争性RT-PCR
参照物片段分两类: - 同源性片段——与靶序列只有微小差 别
《RTPCR技术原理》课件
缺点
对操作人员要求较高
RTPCR技术的操作较为复杂，需要经过专 业培训的操作人员才能保证结果的准确性
。
成本较高
RTPCR技术需要昂贵的仪器和试剂 ，导致检测成本较高，可能限制其
在资源有限地区的普及。
A
B
C
D
可能出现交叉污染
在操作过程中，如果样品或试剂受到污染 ，可能会导致交叉污染，影响检测结果的 准确性。
《rtpcr技术原理》ppt课 件
目录 CONTENT
• RTPCR技术概述 • RTPCR技术原理 • RTPCR实验操作流程 • RTPCR技术的优缺点 • RTPCR技术的应用实例
01
RTPCR技术概述
RTPCR技术定义
实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）是一种在PCR反应过程中，通过荧光信号 检测DNA片段的扩增情况，并实时监测其变化的技术。
2000年
ABI公司推出高分辨率熔解曲线分析 技术，提高了SNP分型和突变检测的 准确性。
2004年
基于焦磷酸测序原理的实时荧光定量 PCR技术问世，提高了检测通量和灵 敏度。
RTPCR技术的应用领域
基因表达分析
突变检测
通过比较不同组织或不同处理条件下基因 的表达水平，研究基因的表达调控机制。
用于检测DNA序列中的点突变、插入和缺 失等变异，用于遗传病、肿瘤等疾病的诊 断和监测。
基因突变检测
总结词
RTPCR技术能够高效地检测基因突变，为遗传性疾病的诊断和治疗提供依据。
详细描述
基因突变是许多遗传性疾病的诱因，RTPCR技术通过对特定基因的扩增和荧光 检测，能够快速、准确地检测出基因突变位点及类型。这有助于遗传性疾病的 早期诊断和针对性治疗，为患者提供更好的医疗方案。
PCR技术简介-PPT课件
2 ul
4 ul 2 ul 0.4ul 0.4ul 0.4ul 3.8ul 1 ul 1 ul 5 ul
RT-PCR反应体系
两步法RT-PCR
Components
Volume(µ l)
Components
RNA 5xR.T.buffer dNTPs(10mmol/L)
Primer Rnasin(50U/µ l) AMV-RT((10U/µ l)
目的基因的克隆 基因的体外突变 生成大量DNA以进行序列测定 特异基因表达量分析
PCR反应体系
20ul；25ul；50ul
10× PCR Buffer Mg2+ dNTPs 引物1 引物2 模板 Taq酶 ddH2O
浓度
1.5mmol/L 200umol/L
10pmol 10pmol 0.1～2ug
PCR实验准备--仪器、耗材
PCR仪 移液器 吸头 200ul PCR管 反应程序
94
温
度 72
（℃）
55
22
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
DNA 2
形 成
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
1
2
3
4
时间（min）
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂 1.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系（通 常4 l/50 l ） Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、 PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特 异性
PCR实验准备—试剂
RTPCR常见问题分析ppt课件
精选版课件ppt
26
问题五：信号高于预期，在低 于预期的循环中即可检出产物?
1、 反应中加的样品太多：降低模板的浓度。 2、 模板或PCR残余污染：隔离污染来源，更换试
剂，使用专用的精致移液器。在无DNA区域准备 反应，使用抗气溶胶的吸头。
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27
问题六：电泳后出现意外的条带 RNA?
精选版课件ppt
19
1.引物和模版 的非特异性 退火
对策
1.避免引物3’端含有2 个到3个dG或dC’
2.在第一链合成中使用 基因特异性引物，而 不是随即引物或 oligo(dT)。
3.在开始几个循环使用 较高的退火温度，然 后使用较低的退火温 度。
4.使用热启动Taq DNA 酶进行PCR，提高反 应的特异性。
火的GSP;对于>1kb的RT-
PCR产物，保持反应温 度≤65℃。不要在高于 37℃时使用M-MLV;如 果不需要全长cDNA， 在第一链反应中使用
随机引物;
精选版课件ppt
13
7.引物或模板 对残余的RNA 模板敏感
8.靶序列在分 析的组织中不 表达
9.PCR没有起 作用
在PCR前用RNaseH处理。
30
问题九： 扩增产物滞留在加样 孔中
有可能是由于模板量过高而导致PCR结果产生了 高分子量的DNA胶状物。建议将第一链结果至少 稀释100倍再进行二次扩增。
另外，在二次PCR时使用的退火温度如果比引物 的Tm值低5℃，可以将退火温度适当增高或进行 热启动以提高特异性
精选版课件ppt
31
Thank You!
精选版课件ppt
32
精选版课件ppt
33
实时荧光定量PCR(qPCR,RT-PCR)的原理及应用ppt课件
内标（Endogenous Control） 通常是18S、28S、β-actin、GAPDH基因等看家基因
在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定， 受环境因素影响小 内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数 量
15
RT-PCR技术的数据分析
PCR分四个阶段
16
RT-PCR技术的数据分析如何定量？-ΔΔCt
实时荧光定量PCR技术 的原理及应用
（Real Time Quantitative PCR）
2013-11-26
1
实时荧光定量PCR目录 Contents
一、实时荧光定量PCR的定义 二、RT-PCR技术的原理及试验流程 三、RT-PCR技术的数据分析
四、RT-PCR技术的应用
2
实时荧光定量PCR的定义
RT-PCR技术的数据分析
21
RT-PCR技术的数据分析
相对定量分析方法 -ΔΔCt
前提:目标序列和内参序列的扩增效率接近100％ 且偏差在 5％以内 1、用目标基因的CT值减内参基因的CT值：
ΔCT（test)= CT （target, test) - CT （ref, test) ΔCT（control)= CT （target, control) - CT （ref, control)
2、用试验样本的ΔCT值减校准样本的ΔCT值：
ΔΔCT= ΔCT（test/control) - ΔCT（calibrator)
3、计算表达水平比率： 相对表达量RQ= 2 –ΔΔCT
22
RT-PCR技术的数据分析
SYBR Green 熔解曲线分析
23
RT-PCR技术的应用
• 临床疾病诊断：各型肝炎、艾滋病、禽流感等传染病诊断 和疗效评价；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断； 遗传基因检测实现遗传病诊断。
在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定， 受环境因素影响小 内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数 量
15
RT-PCR技术的数据分析
PCR分四个阶段
16
RT-PCR技术的数据分析如何定量？-ΔΔCt
实时荧光定量PCR技术 的原理及应用
（Real Time Quantitative PCR）
2013-11-26
1
实时荧光定量PCR目录 Contents
一、实时荧光定量PCR的定义 二、RT-PCR技术的原理及试验流程 三、RT-PCR技术的数据分析
四、RT-PCR技术的应用
2
实时荧光定量PCR的定义
RT-PCR技术的数据分析
21
RT-PCR技术的数据分析
相对定量分析方法 -ΔΔCt
前提:目标序列和内参序列的扩增效率接近100％ 且偏差在 5％以内 1、用目标基因的CT值减内参基因的CT值：
ΔCT（test)= CT （target, test) - CT （ref, test) ΔCT（control)= CT （target, control) - CT （ref, control)
2、用试验样本的ΔCT值减校准样本的ΔCT值：
ΔΔCT= ΔCT（test/control) - ΔCT（calibrator)
3、计算表达水平比率： 相对表达量RQ= 2 –ΔΔCT
22
RT-PCR技术的数据分析
SYBR Green 熔解曲线分析
23
RT-PCR技术的应用
• 临床疾病诊断：各型肝炎、艾滋病、禽流感等传染病诊断 和疗效评价；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断； 遗传基因检测实现遗传病诊断。
相关主题
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确认看家基因起峰的cycle数目不超过2
对照中的看家基因
处理中的看家基因
处理中的靶基因 对照中的靶基因
观点和认识：在设计RT-PCR引物的时候，是跨内含子的，能够根据 PCR产物的大小知道是否有基因组DNA的污染，因此没有必要把抽提 的RNA进行基因组DNA消化。 由于假基因的存在，用基因组DNA为模板进行PCR扩增时，一些常见 的看家基因常有不包含内含子的片段被扩增出来，因此上策还是先进 行基因组DNA的消化，并确认此消化是成功的。
过表达基因
空白对照
可能的原因1：基因组DNA的消化 客户若是通过RT-PCR检测此基因是否表达，可能没有 消化基因组DNA，导致RT-PCR的假阳性。
mRNA
过表达基因
空白对照
可能的原因2：芯片没有检测到此过表达基因的检测 在设计芯片上的探针时，探针的序列往往靠近mRNA的 3’端，理由是？
mRNA 过表达基因
我们的分析过程： 1、客户进行分析的RNA和芯片的RNA是同一份RNA吗？若是来自 生物独立实验的RNA，基因表达完全有可能不吻合； 2、若是同一份RNA，则看客户的qRT-PCR过程 a 看客户是否有确认基因组DNA的消化步骤； b 看客户选择的看家基因在比较的样品中cycle数相差多 少？建议不能超过1.5个cycle。 c 需要看客户验证了几个基因，1、2个基因难以说明问 题，芯片和定量RT-PCR的吻合性有80％就是不错的结果。
microRNA qRT-PCRR实 验中，采用一对引物； 而miRNA qRT-PCR的 RT引物比较特殊，是茎 环结构的引物。
qRT-PCR和半定量RT-PCR的不同
定量RT-PCR
1
400 bp100 bp-
2
3
N C
4
5
6
7
N C
8
N C
-Thy-1
qRT-PCR检测具体流程：实例 qRT-PCR实验流程：
Total RNA 电泳质检
质量良好
消化基因组 DNA，纯化RNA PCR确认消化效果 RNA逆转录 qPCR 数据处理 PCR扩增 终产物电泳
定量RT-PCR和芯片方法对RNA的不同要求
质量好的 RNA样品 应该如此
qRT-PCR客户抱怨例子1：
Nature Biotechnology, 2006, September
qRT-PCR定量检测的技术重复
某些qRT-PCR实验，没有技术重复。实际上，严谨的qRT-PCR实验设计 是需要技术重复的。比如一次实验，用qRT-PCR方法检测对照和处理两 个样品某基因表达是否发生了变化，3次技术重复可能得到以下数据：
1Kb左右设计探针
Poly(A)+ mRNA 5’
完整RNA
ORF UTR
3’ AAAAA…
Untranslaiton region
Promoter
若正好芯片的探针设计在3’UTR区，则检测不到此外源导入基因的 表达情况，而检测到的信号是细胞内源基因的表达情况。
客户抱怨例子3： 在我们这里进行完芯片实验后，回去进行定量或者半定 量RT-PCR验证，发现芯片结果和PCR验证结果不吻合。
Extron Intron Extron Gnomic DNA 表达
mRNA
反转录 Extron，假基因 Gnomic DNA
qRT-PCR不是万能的
在有些情况下qRT-PCR的检测结果是不足为据的，例如MAQC项目中 的检测结果是不足为据的，例如 对qRT-PCR检测结果设定的标准：当进入对数的循环数大于35个循 PCR 环时，检测无效，认为基因没有表达；当进入对数的循环数在3235个循环时，需要有至少3个重复才能判断是否能检测到基因的表 达。
博奥生物公司关于基因qRT-PCR的过程
博奥生物有限公司 生物芯片北京国家工程研究中心
qRT-PCR定量检测原理
常用的qRT-PCR技术大致可以分为2类：一类是以SYBR 类：一类是以 Green为代表的非特异性荧光标记；另一类TaqMan为代 表的特异性荧光标记。
非特异性荧光标记：
1、 SYBR Green
特异性荧光标记：
2、TaqMan
SYBR Green法工作机理
SYBR Green能结合到双链DNA的小沟部位，只有当SYBR Green和双链DNA结合后才发荧光。 当DNA变性时，DNA双链解螺旋，无荧光信号；当DNA复 性和延伸时，形成双链DNA结构，SYBR Green插入DNA 而发荧光，因此必须在复性阶段采集荧光信号。
一客户把组织收获后，直接把组织冻在-80度，自己想 做RT-PCR的时候就取一点组织提取RNA，做RT-PCR 效果都不错，想扩增的基因都能得到扩增。 后来想做芯片分析，就把组织样品送给我们，我们抽提 后发现组织RNA降解，说不能用于芯片分析了。客户 抱怨说，怎么我用来做RT-PCR效果没问题，送到博奥 就不能用了呢？
M N C N C
N C N C N C
半定量RT-PCR
-β-actin
qRT-PCR的具体流程：
总RNA抽提 确认基因 组DNA彻 底被消化
RNA甲醛变性胶检测
基因组DNA消化
以PolyA或 者特异引物 进行反转录 通过看家基 因归一化得 到靶基因的 变化趋势
确认不变的 看家基因
对测试基因进 行PCR扩增
定量RT-PCR
当有多个基因的定量RT-PCR结果，需要和芯片结果作一个相关 性散点图分析，就可以利用定量RT-PCR得到的变化倍数和芯片 结果的倍数作一个散点图进行相关系数R计算。数据引自 Patterson. T.A., et al, Nature Biotechnology, 2006, 24:1140-1151
22.5
重复次数 第一次反应 第二次反应 第三次反应 平均值
1 对照样品CP值 2 处理样品CP值 18.3 19.3 18.5 18.7 21.2 20.9 20.0 20.7
21.5 20.5 19.5 18.5 17.5 16.5 15.5 14.5 1
P=0.0133
2
实际CP值相差2倍，这个基因在处理样品中高表达，相差接近4倍。 若只进行一次qRT-PCR ，由于数据分布的随机性，有可能得到19.3和 20.0这2个数据，那样就可能得不到高表达的结论。
原因：降解RNA和完整RNA的引物差别
Poly(A)+ mRNA 5’
sense
完整RNA
3’ AAAAA… TTTTT...T7 Promoter
Poly(A)+ mRNA 5’
sense
有降解发生RNA
3’ AAAAA…
特异引物进行反转录
客户抱怨例子2：
一客户是进行基因功能研究，把某个基因在细胞中过表达。确认 这个基因表达后的细胞和对照细胞进行表达谱检测分析，但芯片 并没有检测到此基因的高表达，是为什么？
当验证的基因数目不多时，可以用柱状图来展示两种方法的吻 合度。尽管此图是比较Northern和芯片的结果，定量RT-PCR和 芯片的结果的比较可以类似体现。若芯片结果和定量RT-PCR都 有重复实验，则柱状图上可以加上误差线，科学性更强。数据 引自Amibon公司的TechNotes。
芯 片 结 果
与目标序列互补
每扩增一条DNA分子，释放一 个荧光信号，可以在环过程 中任一点检测荧光。
SYBR Green和TaqMan探针技术比较
SYBR Green方法检测的特异性由正向和反向的一对引 物决定，容易受到非特异性扩增影响。但该方法通用 性好，检测成本比较低。 TaqMan探针技术检测的特应性不仅由扩增引物决定， 还由TaqMan探针决定，因而对非特异性扩增的区分能 力更好。但TaqMan探针合成非常昂贵，一条探针都要 在千元以上，限制了其应用。 这两种检测方法都一般都需要每个检测进行3次技术重 复。 对于验证芯片结果，一般认为SYBR Green方法检测已 经可以满足要求。
定量RT-PCR：绝对定量法
另外，在文献上，可以看见一些报道作定量RT-PCR方 法先把基因的模板按照不同稀释度先作标准曲线，然后 按照标准曲线来确定基因的丰度，这种做法需要的反应 数非常多。 而利用所检测基因相对所选择的看家基因丰度来作就相 对简单，而对于验证芯片结果的可靠性是足够的，因此 这种做法也见于大量文献中。我们多选择相对看家基因 丰度的方法来作定量RT-PCR。
因此，在没有技术重复时，由于检测本身的波动性就可能导 致错误结论。
基 因 相 对 于 看 家 基 因 的 表 达 倍 数
0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0
X/Actin
P=0.000022
X
样本: C1 C2 C3 C4 C5 1
T1 T2 T3 T4 T5 2
在文章中写作，可以以柱状图的方式体现，例如朱玉贤 老师06年发表在plant cell上的定量RT-PCR数据格式；这 种体现方式适合定量RT-PCR数目不是很多，让人一眼就 感觉此定量RT-PCR结果是非常可靠的。
SYBR Green
TaqMan探针的工作原理
TaqMan探针：
TaqMan探针：5′端标记有报 告基团(Reporter, R) ，如 FAM、VIC等 ；3′端标记有 荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 若探针完整，R所发射的荧光 能量被Q基团吸收 ，无荧 光；若R与Q分开，发荧光。 Taw酶有 5′→3′外切核酸 酶活性，可水解探针，释放R 产生荧光信号。