基因导入、加工、检测2009

第四章、外源基因导入受体的方法
• 一、微量注射法
1、仪器 2、原理 3、过程
1）受体细胞的制备
显微操作装置
动植物的卵细胞
2）针头的制备
＋ －
制针装置示意图
3）把外源基因注入细胞 4、优点 操作简单、导入率高、把握性大、盲目性小 5、缺点 对受体要求比较严格，仅限于体积比较大 二、PEG法 1、原理 PEG是一种细胞融合剂，分子量为1500－6000，水 溶性，pH4.6－6.8，可以使细胞膜和细胞膜，细胞 膜和DNA之间粘联，粘联之后DNA就可以进入细胞
五、花粉管通道法
经济、简单、导入率比较高、适 合所有的实验室 导入率低，经济 导入率低，经济
六、种子浸泡法 七、子房注射法 八、载体导入
Ti质粒载体 质粒载体 Ti质粒是 质粒是1974年由 年由Zeanen Schell 和 质粒是 年由 Van Larebeke从致瘤农杆菌中分离得 从致瘤农杆菌中分离得 到的，叫致瘤质粒（ 到的，叫致瘤质粒（tumorinducing plasmid)简称 质粒，记作 简称Ti质粒 简称 质粒，记作pTi 一、Ti质粒的发现 质粒的发现
pTi
T-DNA
转录
分解
冠瘿碱 冠瘿碱
翻译
致瘤物质
致瘤
农杆菌
冠瘿碱
植物细胞
二、Ti质粒的类型及结构功能 质粒的类型及结构功能 Ti质粒是存在于根癌农杆菌中的一种质粒， 质粒是存在于根癌农杆菌中的一种质粒， 质粒是存在于根癌农杆菌中的一种质粒 共价闭合环状DNA，200kb左右，根据诱导 ， 左右， 共价闭合环状 左右 合成的冠瘿碱种类的不同分为四类。 合成的冠瘿碱种类的不同分为四类。 章鱼碱型（ 章鱼碱型（octopine) 胭脂碱型（nopaline) 胭脂碱型（ 农杆碱型（ 农杆碱型（agropine) 琥珀碱型（ 琥珀碱型（succinamopine)
1977年Chiltion利用分子杂交技术证明植物肿 1977年Chiltion利用分子杂交技术证明植物肿 瘤细胞中存在一段外来DNA 这段DNA Ti质粒 DNA， DNA和 瘤细胞中存在一段外来DNA，这段DNA和Ti质粒 的一段DNA同源。认为：这段DNA来源于Ti质粒， 的一段DNA同源。认为：这段DNA来源于Ti质粒， DNA同源 DNA来源于Ti质粒 整合到了植物染色体上，把这段DNA DNA称为转移 整合到了植物染色体上，把这段DNA称为转移 DNA（ DNA)，简称T DNA。 DNA（transferred DNA)，简称T-DNA。
农杆菌能够专一地利用自己诱导 的冠瘿碱作为唯一的碳源和氮源
A农杆菌
B农杆菌 胭脂碱
章鱼碱
Kerr:农杆菌的致瘤能力可以在不同菌株中转移 农杆菌的致瘤能力可以在不同菌株中转移
B菌（不致瘤） 菌 不致瘤） A菌（致瘤） 菌 致瘤）
B菌（致瘤） 菌 致瘤） A菌 致瘤） A菌（致瘤）
1974年Zeanen和Schell从致瘤的农杆菌中分 1974年Zeanen和Schell从致瘤的农杆菌中分 离到一种质粒， 离到一种质粒，叫致瘤质粒 plasmid)简称Ti质粒 简称Ti （tumorinducing plasmid)简称Ti质粒
1907年Smith，由农杆菌诱发，原因不详 年 ，由农杆菌诱发， 1942年Braun 年 1.有的农杆菌能诱发，有的不能， 有的农杆菌能诱发， 有的农杆菌能诱发 2.冠瘿瘤组织能在无激素的培养基上无限制的生长， 冠瘿瘤组织能在无激素的培养基上无限制的生长， 冠瘿瘤组织能在无激素的培养基上无限制的生长 要农杆菌的存在， 不需 要农杆菌的存在，推测不是细菌直接诱发的 Braun：肿瘤是由肿瘤诱导因子诱导产生的，TIP，本质不详 ：肿瘤是由肿瘤诱导因子诱导产生的， ， 60年代 年代Movel，肿瘤 年代 ， 组织中含有大量的某 些特殊的氨基酸 章鱼碱： 章鱼碱：octopine 胭脂碱： 胭脂碱：nopaline 冠瘿碱： 冠瘿碱：opines
2、过程 1）制备原生质体 用纤维素酶和果胶酶水解组织细胞 2）转化 目的基因和原生质体混合后，加入PEG 3）收集原生质体，进行培养 3、优点 操作简单，十分经济 4、不足 导入率低 一般在10-5 －10 -6
三、电击法 • 1、仪器 电击仪
基因
受体细胞
2、原理 电击仪可以产生瞬时高压脉冲，电击原生质体 膜，出现瞬时的通道，可以使DNA进入细胞 3、过程 1）分离原生质体 2）加入DNA 3）电击 5）收集细胞、进行培养 4、优缺点 操作简单，经济，导入率低
含有Ti质粒的农杆菌能致瘤，不含Ti质 含有Ti质粒的农杆菌能致瘤，不含Ti质 Ti质粒的农杆菌能致瘤 Ti 粒的农杆菌不能致瘤，冠婴瘤是由Ti质粒控制的 粒的农杆菌不能致瘤，冠婴瘤是由 质粒控制的
作用：使植物细胞无限制的增长 作用：使植物细胞无限制的增长
能够合成冠瘿碱 能够合成冠瘿碱
冠瘿碱的合成和分解是Ti质粒控制的 冠瘿碱的合成和分解是Ti质粒控制的 Ti
三、T-DNA的转移 VirA VirG
酚类、糖类
B11、C2、D4、 E2、F1、H2
启动
激活
T-DNA
生长素
CON
VIR Ti质粒 质粒 分解基因
冠 瘿 碱 冠瘿碱
细胞分裂素
ORI 被分解
细胞增长
农杆菌
植物细胞
四、Ti质粒载体 质粒载体
1、分子量太大，200kb左右，操作困难 、分子量太大， 左右， 左右
oct Vir基因的基本结构与功能 基因 长度 基因数 表达方式 VirA VirB VirC VirD VirE VirF VirG VirH 2.8 9.5 1.5 4.5 2.2 1.0 1.0 4.2 1 11 2 4 2 1 1 2 组成型 诱导型 诱导型 诱导型 诱导型 诱导型 组成型 诱导型 功能 接受信号、 接受信号、激活蛋白 转录活化 T-DNA加工 加工 T-DNA加工 加工 T-DNA加工 加工 膜转运蛋白 T-DNA的运转 的运转 细胞色素P-450单氧化酶 单氧化酶 细胞色素
致瘤基因：生长素基因、 致瘤基因：生长素基因、细胞分裂素基因
生长素基因： 生长素基因：色氨酸单加氧酶基因 吲哚乙酰胺水解酶基因
色氨酸 色氨酸单加氧酶 吲哚乙酰胺 吲哚乙酰胺水解酶
吲哚乙酸
细胞分裂素基因： 细胞分裂素基因：编码异戊烯基转移酶
异戊烯基焦磷酸盐和AMP形成细胞分裂素 形成细胞分裂素 异戊烯基焦磷酸盐和
Mini质粒和辅助质粒 辅助质粒：去掉T-DNA的Ti质粒 no T-DNA
Vir 辅助Ti质粒 辅助 质粒
Con
Ori
Mini质粒 LB P E NOS R1 RB
Ti质粒载体 质粒载体 R2 Ori R1：植物中抗性基因（卡那霉素，-DNA LB Vir 辅助Ti质粒 辅助 质粒 Ori Con P E N R1 RB
其中A1、 其中 、B11、C2、D4、E2、F1、H2构成一个调 、 、 、 、 、 构成一个调 控子，负责T-DNA的加工与转移 控子，负责 的加工与转移
Con区：含有负责细菌间接 区 合Ti质粒转移的有关基因 质粒转移的有关基因
Ori区：负责Ti质粒的复制 区 负责 质粒的复制
冠瘿碱分解基因区： 冠瘿碱分解基因区： 负责分解冠瘿碱
这两类基因使植物细胞大量增殖，形成肿瘤，叫致瘤基因（ 这两类基因使植物细胞大量增殖，形成肿瘤，叫致瘤基因（noc) 注意： 注意：冠瘿碱合成基因与肿瘤形成无关
Vir区：不同的质粒长度及基因不同 区 章鱼碱型（ 章鱼碱型（oct)：Vir区 ： 区 长40kb，含有 个操纵子 ，含有8个操纵子 VirA、B、C、D、E、F、G、H 、 、 、 、 、 、 、
冠瘿瘤
NH=C(NH2)-NH(CH2)3-CH-COOH NH CH3-CH-COOH 章鱼碱 NH=C(NH2)-NH-(CH2)3-CH-COOH NH HOOC-(CH2)2-CH-COOH 胭脂碱 Petit：证明冠瘿碱的种类取决于菌株的种类， ：证明冠瘿碱的种类取决于菌株的种类， 与植物的种类无关， 与植物的种类无关，
3、转化体的选择
4、受体细胞应为分裂旺盛的细胞
优缺点 载体构建比较繁琐 整合率高
基因工程模式图
基因分离
a
基因转移
基因表达
a
A生物 生物 供体
目的基因 外源基因
B生物 生物 受体
B生物 生物 转基因生物
第五章、外源基因在受体中的表达
一、受体的选择 任何一个细胞都可以作为基因工程的受体
18000 12000 CAT 10000 4000
冠瘿碱合成基因，致瘤基因 生长素 细胞分裂素) 生长素、 冠瘿碱合成基因，致瘤基因(生长素、细胞分裂素 接 受 信 号 、 负 责 T D N A 转 移 LB T-DNA 农 杆 菌 的 接 合 RB
Ti质粒 VIR 200kb
CON
冠瘿碱分解 分解冠瘿碱 冠瘿碱
ORI Ti质粒的复制 质粒的复制
Ti质粒载体 Ti质粒载体 Ori R2
具体操作过程 1、mini质粒和外源基因连接 2、上述重组质粒导入大肠杆菌 3、上述重组质粒导入农杆菌 4、制备转化用农杆菌 5、受体制备 外植体：叶片、叶柄、子叶、胚轴、根、茎、芽、胚等 愈伤组织：愈伤组织、原生质体
5、转化：材料不同转化方法不同 注意： 1、诱导物的选择 乙酰丁香酮 AS、 羟基乙酰丁香酮 OH-AS 2、除菌 羧苄青霉素、头孢霉素
2、酶切点太多，连接基因困难 、酶切点太多，
3、T-DNA上有很多基因，致瘤基因使植 、 上有很多基因， 上有很多基因 物细胞无限制分裂，不能分化。 物细胞无限制分裂，不能分化。 4、Ti质粒不能在大肠杆菌中复制，转化 、 质粒不能在大肠杆菌中复制 质粒不能在大肠杆菌中复制， 农杆菌也困难
双元表达载体系统