第三章 基因工程制药

产物容易提取纯化。
宿主细胞分为两大类： 第一类为原核细胞：常用有大肠 杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；
第二类为真核细胞：常用有酵母、
丝状真菌、哺乳动物细胞等。
⒈ 原核细胞
⑴大肠杆菌
分子遗传学研究深入，生长迅速， 所以目前仍是基因工程研究中采用最 多的原核表达体系。
特点：
表达基因产物形式多样:细胞内不溶性表 达(包涵体)、细胞内可溶性表达、细胞 周质表达等。 大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品 多为胞内产物，提取困难。
分离得到含有目的基因的阳性克隆后，必须对 其作进一步的验证和鉴定，主要是进行限制酶
图谱的绘制、杂交分析、基因定位、基因测序
以及确定基因的转录方向、转录起始点等。 1985，PCR发明以后，RT-PCR得到了广泛的应 用。
二、化学合成法
较小的蛋白质或多肽的编码基
因可以用化学合成法合成。
必须知道目的基因的核苷酸顺
第二节 DNA的复制与表达
一、DNA的复制：
半保留复制
二、基因表达
⒈转录：在RNA聚合酶的催化下以DNA 为模板合成mRNA的过程。 转录后加工： 剪切：除去内含子 加帽：5’加m7Gppp 加尾：3’加poly（A）
二、翻译：以mRNA为模板,tRNA作为 运载工具,将活化的氨基酸在核糖体上 合成蛋白质的过程。 ⒈分为三个阶段： ①起始 ②延长 ③终止
来。洗脱方法是高浓度盐溶液使mRNA特异结合于寡聚dT，
2、cDNA第一链的合成
在逆转录酶的催化下，开始cDNA链的合成。在合成反应 体系中加入一种放射性标记的dNTP，在反应中以及反应 后可通过测定放射性标记的dNTP掺入量，计算出cDNA的 合成效率；在凝胶电泳后，进行放射自显影分析产物的
一般mRNA都带有3‘-polyA，所以可用寡聚dT作为引物，
DNA，因此用它可以切除发夹结构。发夹结构结构切除
后，双链cDNA分子的大小常用变性琼脂糖凝胶电泳进
行测定。
4、cDNA克隆
用于cDNA克隆的载体有两类：质粒DNA（如pUC、pBR322 等）和噬菌体DNA（如gt10、 gt11等）。根据重组后 插入的cDNA是否能够表达、能否经转录和翻译合成蛋白 质，又将载体分为表达型和非表达型载体。 pUC及gt11为表达型载体，在cDNA插入位臵的上游具有 启动基因顺序；而pBR322及gt10为非表达型载体。在 cDNA克隆操作中应该根据不同的需要选择适当的载体。 cDNA插入片段小于10kb，可选质粒载体，如大于10kb则 应选用噬菌体DNA为载体。 选用表达型载体可以增加目的基因的筛选方法，有利于 目的基因的筛选。
⑸应具有很强的终止子，只转录克隆的基
因，所产生的mRNA较为稳定。
⑹所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号
AUG和SD序列，以便转录后顺利翻译。
pBV220系统国内使用最多的载体,其组成: ①来源于pUC8多克隆位点 ②核糖体rrnB基因终止信号 ③pBR322第4225～3735位 ④pUC18第2066～680位 ⑤λ噬菌体cIts857抑制子基因及PR启动子 ⑥pRC23的PL启动子及SD序列
成仪所合成的寡核苷酸片段仅为 50～
60 bp，因此只适用于克隆小分子肽的
基因。
⒉遗传密码的简并使选择密码子困难， 用氨基酸顺序推测核苷酸序列，得到 的结果可能与天然基因不完全一致， 易造成中性突变。 ⒊ 费用高。
第四节
基因表达
基因表达是指结构基因在生物体中 的转录、翻译以及所有加工过程。 基因工程中基因高效表达研究是指 外源基因在某种细胞中的表达活动，即 剪切下外源基因片段，拼接到另一个基 因表达体系中，使其能获得原生物活性 又可高产的表达产物。
基因工程药物制药的主要程序
获得目的基因 组建重组质粒 构建工程菌（或细胞）
培养工程菌
产物分离纯化
除菌过滤
半成品检定
成品检定
包装
第三节
目的基因的获得
克隆真核基因常用方法：逆转录法 和化学合成法。
一、逆转录法
逆转录法就是先分离纯化目的基因 的 mRNA，再反转录成 cDNA，然后进 行 cDNA 的克隆表达。
⒈ 真核基因在原核细胞中表达载体必 须具备条件：
⑴载体能够独立复制。载体本身是 一个复 制子，具有复制起点。
⑵应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记， 以利于外源基因的克隆鉴定和筛选。 ⑶应具有很强的启动子，能为大肠杆菌RNA 聚合酶所识别。
⑷应具有阻遏子，使启动子受到控制，只
有当诱导时才能进行转录。从cDNA中分离特异的cDNA克隆，主要采用：
（1）核酸探针杂交法。用层析和高分辨电泳等技术纯 化微克量的目的蛋白质，根据目的蛋白质纯品的氨基酸 序列分析结果，人工合成鉴定法。在既无可供选择的基因表型特 征，又无合适探针的情况下，本法的表达产物，即以某种蛋白质的抗体寻找相应的 特异cDNA克隆。
最佳的基因表达体系：目的基因的 表达产量高、表达产物稳定、生物活 性高和表达产物容易分离纯化。
一、宿主细胞的选择
适合目的基因表达的宿主细胞 应满足以下要求: 容易获得较高浓度的细胞；
能利用易得廉价原料；
不致病、不产生内毒素；
发热量低、需氧低、适当的发酵 温度和细胞形态； 容易进行代谢调控； 容易进行DNA重组技术操作； 产物的产量、产率高，
因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不 溶性的包涵体，表达产物需经变性复性才 恢复活性。 蛋白质不能糖基化。 产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基。 其内毒素很难除去。
⑵枯草芽胞杆菌 特点：分泌能力强，蛋白质不形 成包涵体。产物蛋白质不能糖基化。 有很强的胞外蛋白酶对产物降解。
⑶链霉菌
作为外源性基因表达受到重视。 特点：不致病、使用安全、分泌能 力强、表达产物可糖基化。
第三章 基因工程制药
基因工程的基础知识
第一节 基因的概念与特性
一、基因的概念: DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷 酸序列,是遗传物质的最小功能单位。
早期认为遗传物质是蛋白质，1944年 Avery从肺炎链球菌转化实验证明是DNA。
A：S有夹膜致病菌，B：R突变非致病菌，C：加热杀死S菌，D：活R死S
5、将重组体导入宿主细胞
体外包装的噬菌体，感染感受态大肠杆菌形 成噬菌斑；或转化感受态大肠杆菌使质粒主要有抗性基因 失活法和菌落或噬菌斑颜色改变法。然后采用
凝胶电泳、分子杂交、DNA序列分析测定等方
法进行进一步筛选和鉴定。
7、目的cDNA克隆的分离和鉴定
基因工程克隆载体的特点： ①具有复制子 ②有单一限制内切酶切位点或多克隆 位点 ③有选择性遗传标记如抗药基因 ④拷贝数高 ⑤生物安全性好
目前使用的载体按特性可分为： ①质粒 ②λ噬菌体 ③黏性质粒 ④M13噬菌体 ⑤酵母 ⑥真核细胞病毒载体
细菌质粒的生物学特性
质粒的定义： 质粒是存在于细菌等微生物细胞染色 质以外的共价闭环的双股DNA分子，具 有独立自主复制和调控能力，可赋予 宿主细胞一定的生物性状。
细胞内含有3种以上的RNA，mRNA占细胞内总RNA总量的
2%~5%，相对分子质量大小很不一致，由几百到几千个
核苷酸组成。
在真核细胞中mRNA的3‘末端常常含有一多聚腺苷酸
polyA组成的末端，长达20~250个腺苷酸，可采用Oligo
dT-纤维素，以亲和层析法将mRNA从细胞总RNA中分离出
再以低盐溶液和蒸馏水将其洗脱，经过两次寡聚dT，可 得到较纯的mRNA。
目前使用最广泛的宿主菌是大 肠杆菌和酿酒酵母,已建立了许多 适合它们的克隆载体和DNA导入方
法。许多外源基因已获得成功表达。
二、大肠杆菌中的基因表达
载体
基因工程的目的和基本手段，是选用合 适的载体把供体DNA（外源基因）运载到 受体细胞内，从而复制扩增大量的目的 DNA分子或转录表达为相应的产物。
⒈mRNA的纯化 ⒉cDNA第一链的合成 ⒊cDNA第二链的合成 ⒋ cDNA的克隆 ⒌将重组体导入宿主细胞 ⒍ cDNA的鉴定 ⒎目的cDNA克隆的分离和鉴定
cDNA克隆示意图
mRNA 逆转录酶 ss-DNA DNA多聚酶I Klenow片段 逆转录酶
ds-cDNA
ds-cDNA
1、mRNA的纯化
分子大小，探索最佳反应条件。
一次好的逆转录反应可使寡聚dT选出的mRNA有5%~30%被
拷贝。H酶解的方法除去cDNA-mRNA杂交链中
的mRNA链，然后以cDNA第一链为模板合成第二链。由 于第一链cDNA链3‘末端往往形成一个发夹形结构，所 以，可以从这一点开始合成cDNA第二链。此反应是在 DNA聚合酶I催化下完成的。核酸酶S1专一性切除单链
pBV220系统优点：
①cIts857抑制子基因PL启动子同在一个载体上， 可以转化任何菌株，以便选用蛋白酶活性较低的 宿主细胞，使表达产物不易降解。 ②SD序列紧跟多克隆位点，便于插入带起始ATG的 外源基因，可表达非融合蛋白； ③强的转录终止信号可防止出现‚通读‛现象，
序或目的蛋白质的氨基酸顺序。
用化学法合成目的基因DNA不同部位的 两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为 两端形成粘性末端的DNA双链片段，然 后将这些双链片段按正确的次序进行退 火使连接成较长的DNA片段，再用连接 酶连接成完整的基因。
人工化学合成基因的限制有：
⒈ 不能合成太长的基因。目前 DNA 合
二、基因的一般特性： ①基因可自我复制， ②基因决定蛋白质结构， ③基因可突变。 基因按功能分为： ①结构基因 ②调控基因
三、DNA的结构与性能 ⒈DNA的结构：四种核苷酸（A T C G） 连接。 DNA二级结构双螺旋结构。 ⒉DNA的性质与功能 ①吸收光谱260 ②电场中泳动 ③变性 复性 杂交
基因工程载体分为： 克隆载体 转录载体 表达载体
克隆载体 转录载体 DNA DNA RNA 表 达 载 体