第十章 重组DNA的构建、筛选及鉴定分析
dna重组实验报告
dna重组实验报告DNA重组实验报告引言：DNA重组是一种常用的实验技术，它可以将不同来源的DNA片段重新组合，用于研究基因功能、制备重组蛋白和构建转基因生物等。
本实验旨在通过DNA重组技术，将一个外源基因片段插入到宿主细胞的染色体中，以实现目标基因的表达。
材料与方法：1. 提取目标基因的DNA片段：通过PCR扩增方法，利用特异引物扩增目标基因的DNA片段。
2. 制备载体DNA：选择合适的载体，如质粒或噬菌体，提取并纯化载体DNA。
3. 限制性内切酶切割：使用适当的限制性内切酶对目标基因片段和载体DNA进行切割。
4. 连接反应：将切割后的目标基因片段与载体DNA进行连接反应，形成重组DNA。
5. 转化宿主细胞：将重组DNA转化到宿主细胞中，使其能够稳定复制和表达。
6. 选择性培养：利用选择性培养基筛选出含有重组DNA的宿主细胞。
结果与讨论：经过PCR扩增，我们成功获得了目标基因的DNA片段。
通过琼脂糖凝胶电泳分析，我们确认了目标基因片段的大小和纯度。
同时，我们也成功提取并纯化了载体DNA。
在限制性内切酶切割实验中，我们选择了适当的限制性内切酶，对目标基因片段和载体DNA进行切割。
通过琼脂糖凝胶电泳分析，我们验证了切割反应的成功。
在连接反应中，我们将切割后的目标基因片段与载体DNA进行连接。
这一步骤中，连接酶的选择和反应条件的优化十分关键。
我们进行了多次实验，最终成功地将目标基因片段与载体DNA连接起来，形成了重组DNA。
接下来，我们将重组DNA转化到宿主细胞中。
转化是将外源DNA导入宿主细胞的过程，可通过热激转化、电穿孔法或化学法等不同方法实现。
我们选择了适当的转化方法，并进行了转化效率的优化。
最后，我们在含有选择性抗生素的培养基上进行了选择性培养。
只有含有重组DNA的宿主细胞能够在这种培养条件下生长，形成菌落。
通过筛选，我们成功获得了含有重组DNA的宿主细胞。
结论：通过本次实验，我们成功地进行了DNA重组实验，将目标基因片段插入到宿主细胞的染色体中。
重组体筛选和鉴定PPT课件
标志基因筛选
免疫学筛选
利用载体上的标志基因对重组 体进行筛选，如利用lacZ基因进 行β-半乳糖苷酶活性检测。
利用抗体与目的蛋白的特异性 结合，通过免疫学方法对重组 体进行筛选。
荧光标记筛选
利用荧光标记的目的基因或蛋 白质进行筛选，通过荧光检测 仪检测荧光信号。
重组体在生物工程中的应用
生物制药
利用重组技术生产具有治疗价 值的重组蛋白、抗体或细胞因 子等生物药物。
基因工程菌构建
通过基因重组技术构建具有特 定功能的基因工程菌，用于工 业微生物发酵和物质转化。
农作物改良
通过基因重组技术改良农作物 性状，提高产量、抗逆性和品 质等。
重组体在医学中的应用
诊断试剂开发
剂的安全性。
05
重组体的未来发展
重组体技术的发展趋势
基因编辑技术的进步
随着CRISPR等基因编辑技术的不断完善，重组体的构建将更加高 效和精确。
人工智能与大数据的结合
人工智能和大数据技术的应用将有助于提高重组体筛选和鉴定的准 确性和效率。
细胞工厂的构建
利用重组技术构建细胞工厂，实现微生物生产的高效转化，为生物 制药等领域提供有力支持体的环境安全性评估
评估重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力，以及可能对生态环 境造成的影响。
重组体的食品安全性评估
对重组体作为食品或食品添加剂的安全性进行评估，确保其食用安 全。
重组体的安全性检测方法
02
01
03
生物学检测
通过生物学实验检测重组体的生物学特性、遗传稳定 性等。
环境适应性检测
检测重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力。
重组DNA转化及筛选实验报告
重组DNA转化及筛选实验报告引言DNA重组技术是现代生物学研究中不可或缺的工具之一，它可以将外源基因片段插入到宿主细胞的染色体中，从而实现特定基因的表达。
DNA转化是重组技术的关键步骤之一，通过电刺激或化学方法将外源DNA引入宿主细胞中。
本实验旨在通过DNA转化及筛选，构建宿主细胞中的重组DNA，并对成功转化的细胞进行筛选。
实验材料和方法材料：1. E. coli DH5α细胞2.外源质粒DNA3.LB琼脂培养基4.青霉素/链霉素抗生素5.离心管6.PCR仪7.恒温摇床方法：1.准备转化液：将50 mL LB琼脂培养基加入含有适量抗生素的离心管中，混匀。
2.取出青霉素/链霉素抗生素的冻存液，解冻后加入LB培养基中，使其浓度为最佳浓度。
3.取出冻存的E. coli DH5α细胞，放在冰上解冻。
4.加入转化液中的合适量DNA，比例为1:10（DNA:转化液）。
5.放入37℃恒温培养箱中孵育30分钟。
6.取出孵育后的细胞转化液，通过离心将细胞沉淀。
7.倒掉上清液，用适量的无菌去离子水悬浮细胞。
8.取一小部分悬浮液涂抹在含有抗生素的琼脂平板上。
9.将琼脂平板放置在37℃恒温培养箱中培养过夜。
10.检查平板上是否有菌落生长，记录结果。
11.选取生长菌落较大、菌落形态规则的菌落进行进一步筛选。
12.取一小部分菌落涂抹在新的琼脂平板上进行单克隆分离。
13.重复步骤12，直至获得纯合阳性克隆菌落。
14.提取纯合阳性菌落中的质粒DNA，进行PCR验证。
结果与讨论经过上述实验操作，我们成功地进行了重组DNA的转化和筛选。
在配制转化液时，选择适量的抗生素浓度非常重要，它可以帮助筛选出成功转化的细胞。
通过在琼脂平板上培养过夜后，我们可以观察到菌落的生长情况。
有菌落生长的平板可以说明转化成功，而没有菌落生长的平板则说明转化失败。
选取生长较大、形态规则的菌落进行进一步筛选是为了确保筛选出的细胞是单克隆的。
通过单克隆分离，我们获得了纯合阳性克隆菌落。
DNA重组技术(Recombinant DNA)实验原理、用品和步骤
DNA重组技术(Recombinant DNA)实验原理、用品和步骤【实验原理】1．DNA重组技术重组DNA(Recombinant DNA)技术是遗传工程的核心技术，也是人类在基因和DNA分子水平进行操作的技术。
它包括以下几个步骤：1）重组DNA分子的构建：即将目的基因（DNA或cDNA片段）与载体DNA重组，应用TA 克隆方法,将PCR扩增产物快速克隆至质粒载体中。
该方法利用了PCR过程中使用的热稳定聚合酶(Taq酶)在所复制的双链分子末端加上单一脱氧腺苷酸(A),从而产生一A-粘性末端的性质,设计一种线性载体,使之含有一T-粘性末端,可直接插入PCR产物,在DNA连接酶作用下，目的DNA和载体DNA连接形成重组DNA分子。
2）将重组DNA分子转化宿主细胞。
3）克隆选择增殖：将转化后的液体涂布于琼脂培养基表面，培养基中含有宿主菌敏感的抗生素，重组DNA（TA克隆载体分子）含有相应抗生素的抗性基因，转化的细菌能在培养基上生长形成集落。
挑取菌落，置液体培养基中培养，得到大量含重组DNA的细菌。
4）收获扩增后的培养细胞，提取重组DNA分子（质粒），并纯化，获得某一基因或DNA片段的大量拷贝。
2．质粒DNA的小量制备常见的质粒DNA提取方法有简易一步提取法、碱裂解法和煮沸法。
本实验采用的是碱裂解法，碱裂解法的原理：在PH 12.0~12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒（CC）DNA仍为自然状态。
将pH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构。
大部分染色体DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态。
通过离心，将可去除大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用乙醇沉淀回收质粒DNA。
3．质粒DNA的限制性内切核酸酶（限制酶）切分析限制酶存在于原核生物体内，根据其结构和功能特性分为：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。
重组dna克隆子的筛选及鉴定注意事项
重组dna克隆子的筛选及鉴定注意事项嘿，宝子们！今天咱们来唠唠这个《重组DNA克隆子的筛选及鉴定注意事项》呀。
首先呢，咱得知道啥是重组DNA克隆子哇。
这可是生物技术里超重要的东西呢！在筛选的时候呀，有好多要注意的点呢。
一、筛选方面的注意事项1. 选择合适的筛选标记呀！哎呀呀，这可太关键了呢。
比如说抗生素抗性标记，常见的像氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性等等。
你得确保这个标记是准确有效的哇，不然怎么能筛选出咱们想要的克隆子呢？要是标记弄错了，那可就像大海捞针一样乱套了呀！在选择的时候，一定要根据你的载体和宿主细胞的特性来确定呢，可不能瞎选哦！2. 筛选条件要精确呢。
比如说使用抗生素筛选的时候，抗生素的浓度一定要控制好哇！浓度低了呢，那些没有成功重组的细胞可能也会生长，这就达不到筛选的目的啦；浓度高了呢，可能会把一些好不容易重组成功的细胞也给抑制住了呀，这多可惜呢！所以呀，要通过预实验来确定最佳的抗生素浓度呢，这个步骤可不能偷懒哦！3. 筛选的时间也很重要呢！哇，你可别以为把细胞放在筛选培养基里就不管了。
时间太短，可能那些非重组子还没有完全被抑制住；时间太长呢，可能会导致重组子因为营养缺乏或者其他原因生长受到影响呢。
所以要时刻关注细胞的生长状态，确定合适的筛选时间呀。
二、鉴定方面的注意事项1. 酶切鉴定要小心哦。
在进行酶切鉴定的时候呢，首先要选择合适的限制性内切酶呀。
这就像开锁要用对钥匙一样呢。
要是酶选错了，可能就切不出你想要的条带啦，那怎么能鉴定出正确的克隆子呢？而且呀，酶切反应的体系一定要准确无误呢。
各种成分的量，像酶的量、缓冲液的浓度、DNA的量等等，都要严格按照说明书来操作呢，不然很容易出现酶切不完全或者酶切失败的情况呢！2. PCR鉴定也有不少讲究呢。
引物的设计那可是重中之重呀！哇，引物要是设计得不好，可能就扩增不出咱们想要的片段呢。
要确保引物的特异性，不能跟其他非目标序列结合呢。
还有呀，PCR反应的条件也要不断优化呢。
基因工程-5-重组DNA构建与筛
重组DNA技术的应用领域
基因治疗
利用重组DNA技术对病变细胞 进行基因修饰，以达到治疗疾 病的目的。
农业生物技术
通过重组DNA技术改良农作物， 提高产量和抗性。
基因克隆
通过重组DNA技术将目的基因 插入到载体中，实现基因的克 隆和扩增。
生物制药
利用重组DNA技术生产具有特 定功能的蛋白质或抗体，用于 药物研发和生产。
重组DNA技术的发展趋势
随着科学技术的不断进步，重组DNA技术将不断发展和完善，有 望在疾病治疗、生物制药、农业育种等领域发挥更大的作用。
重组DNA技术面临的挑战
尽管重组DNA技术具有广泛的应用前景，但同时也面临着一些 挑战，如技术难度、安全性问题、伦理问题和法规限制等。
重组DNA技术的未来发展方向
重组DNA技术安全性评估标准
对重组DNA技术的安全性进行评估，需要遵循国际公认的安全性评估标准，如美国食品药品 监督管理局（FDA）和世界卫生组织（WHO）等机构制定的相关指南和规定。
重组DNA技术安全性评估内容
评估内容包括重组DNA技术的操作过程、使用的载体、宿主细胞、目的基因等，以及潜 在的基因突变、基因转移和基因表达等方面。
SUMMAR Y
01
重组DNA技术概述
重组DNA技术的定义
重组DNA技术是指通过人工手段将 不同来源的DNA片段进行剪切、拼 接和重组，从而构建出新的DNA分 子，实现基因的修饰、表达和调控。
该技术涉及基因克隆、载体构建、 DNA转化和筛选等多个环节，是现代 生物技术领域中的核心技术之一。
重组DNA技术的历史与发展
T4 DNA连接酶连接
将目的基因与载体进行连接，形成重组DNA分子。常用的 连接方法是T4 DNA连接酶连接法。
重组文库的构建与筛选讲义ppt课件
以噬菌体为载体，在体外将噬菌 体 DNA包装成病毒颗粒，使其 感染受lasmid）
是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA
分子。大小约为
数 千碱基对。常
有 1 ~ 3个抗药
性 基因，以利于
筛 选。
2（克隆载体）
• 为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性 繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 • 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成 多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
质粒DNA 噬菌体DNA
病毒DNA2019 重组DNA的构建与筛选 202019 重组的发现
三位科学家由于限制
性核酸内切酶的发现 及其在分子遗传学中 的应用，为遗传工程 的产生拉开了序幕而 获得1978年诺贝尔生 源——基因载体
• 重组DNA技术中广泛应用的噬菌体是大肠杆菌的温和噬菌体λ，它是在1951 年由美国学者E．莱德伯基物材料作为RNA分离的出发材料,有些甚 至要经过特殊的诱导处理以提高所需 DNA的丰度。
分： 质粒 基因载体 噬菌体 病毒
直接分离 cDN限制性内切酶
目的基因
接：
粘端连接
连接酶
平端连接 尾接法
重组体
转： 转化 转染 带重组体的宿主
2019 筛：
体外包装表型筛选重组 DNA的构建与筛选 电泳法核酸杂交
33
一
目的基因的制备
反转录--应用得最多的获 取目的基因的方法。前提 是目的基因的序列已知， 至少部分已知。 真核细胞 的基因多 数为单拷 贝，难 于 分离到足 够的目的 基因。
广义的遗传工程包括细胞水平上的遗传操作（细胞工程）和分 子水平上的遗传操作，即重组DNA技术（有人称之为基因工 程）,狭义的遗传工程则专指术(Transgene technology)
质粒的构建、转化、筛选和鉴定
重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定实验目的：1.学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
2.学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。
3.学习利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。
4.掌握利用Cacl感受态细胞的方法。
25.学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。
6.掌握α互补筛选法和PCR检测法筛选重组子的方法。
并鉴定体外导入目的DNA片段的大小。
7.学习和掌握PCR反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。
实验原理：外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。
重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。
将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。
1.重组子的构建酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA时不能得到完整的目的基因。
其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。
常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。
本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。
在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。
单酶切法简单易行单是后期筛选工作比较复杂。
DNA重组实验原理及步骤
实验十 DNA重组一、实验原理外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这种重新组合的DNA叫做重组子。
DNA在体外的连接重组是基因工程操作的核心技术之一，其本质是一个酶促反应过程。
即在一定的条件下，DNA连接酶催化两个双链DNA片段的5¹端磷酸和3¹端羟基之间相互作用，形成磷酸二酯键的过程。
常用的DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。
其中T4噬菌体DNA连接酶对底物的要求低，能更有效地连接DNA的平末端，应用更广泛。
T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分3步：①首先，ATP与T4噬菌体DNA连接酶通过ATP的磷酸与连接酶的赖氨酸的氨基形成酶―ATP复合物。
②被激活的AMP随后从赖氨酸残基转移到DNA一条链的5¹端的磷酸基团上，形成磷酸―磷酸键。
③DNA链3¹端的羟基被活化，取代ATP后与DNA5¹端的磷酸根形成磷酸二酯键，并释放出AMP，完成DNA之间的连接。
T4噬菌体DNA连接酶需要镁离子和ATP作为辅助因子，在一定的温度和pH条件下进行连接反应。
二、仪器及试剂：1. 仪器：台式离心机、移液器、吸头、恒温水浴锅等。
2. 试剂：T4 DNA连接酶、10×T4 DNA连接酶缓冲液、载体DNA、外源DNA。
三、操作步骤1. 外源DNA片段和载体DNA的连接取1只无菌Ep管、用微量进样器按下列顺序加入各成分。
10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5 ul酶切后的DNA片段 *1 约0.3 pmol酶切后的载体DNA *2 约0.03pmolT4 DNA Ligase 1ulddH2O 加至 25ul*1 DNA片段的摩尔数应控制在载体DNA摩尔数的3－10倍。
*2 相同末端的载体与DNA片段进行连接时，应首先将载体进行去磷酸化处理，以防止其自身环化。
2.盖好盖子，用手指轻弹Ep管数次，并于台式离心机离心2s 以集中溶液。
重组dna技术的主要步骤
重组dna技术的主要步骤重组DNA技术的主要步骤引言：重组DNA技术是一种革命性的生物技术，它使科学家能够通过改变生物体的遗传物质，创造出具有特殊功能的生物体。
这项技术在农业、医学和工业等领域具有巨大的潜力，可以解决许多现实世界的问题。
本文将介绍重组DNA技术的主要步骤，以及其在不同领域的应用。
一、DNA提取重组DNA技术的第一步是从生物体中提取DNA。
DNA可以从细胞核、线粒体或叶绿体等细胞器中提取。
提取DNA的方法通常包括细胞破碎、蛋白质消化以及DNA纯化等过程。
通过这些步骤，可以获得纯净的DNA样本，为后续的实验做好准备。
二、DNA切割DNA切割是重组DNA技术中的关键步骤之一。
科学家使用限制性内切酶来切割DNA，这些酶具有特异性，只能识别并切割特定的DNA序列。
通过切割，可以将DNA分成多个片段，为后续的重组提供更多的选择。
三、DNA连接DNA连接是将DNA片段重新组合的过程。
这一步骤通常涉及到DNA连接酶，它能够将DNA片段粘合在一起。
科学家可以选择连接同一生物体的DNA片段，也可以选择连接不同生物体的DNA片段，以创建新的组合。
四、DNA转化DNA转化是将重组DNA导入目标细胞的过程。
这一步骤可以通过多种方法实现，如电穿孔、热冲击和化学处理等。
转化后的细胞中将包含重组DNA，并且这些细胞将会成为新生物体的一部分。
五、筛选与鉴定在DNA转化后，科学家需要对细胞进行筛选和鉴定，以确定是否成功引入了重组DNA。
通常，这个过程包括筛选标记基因的表达、PCR检测和DNA测序等步骤。
通过这些鉴定方法，科学家可以确定重组DNA是否被正确引入，并对其进行进一步的研究。
六、应用领域重组DNA技术在多个领域具有广泛的应用。
在农业领域，它可以用于改良作物的抗病性、耐逆性和产量等特性。
在医学领域，它可以用于生产重要药物、疫苗的研发以及基因治疗等。
在工业领域，它可以用于生产生物燃料、酶和其他化学品等。
结论：重组DNA技术是一项强大的工具，它可以改变生物体的遗传特性，并为解决现实世界的问题提供了新的途径。
重组体的筛选和鉴定
二、利用插入序列提供的表型特征筛选
利用插入的外源基因的表达产物特性进行直 接选择。（只在特定条件下）。 一、原理： 1.弥补缺陷 转化进来的外源基因产物能够弥补受 体菌株的突变型缺陷。 受体菌： his外源基因： his+
在不含组氨酸的 培养基中生长
2. 增加新性状 使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。
GFP 老鼠
GFP- Kac的狗
GFP Alba 發青綠光 芒的 兔子
①新霉素磷酸转移酶基因（NPTⅡ）抗新霉素、卡 那霉素、庆大霉素和G418等抗生素，成为筛选动 植物转化子的选择标记基因。 ②潮霉素磷酸转移酶基因（HPT）赋予转化子能抗 潮霉素，作为选择标记基因主要用于筛选动植物 转化子。潮霉素是致癌物质，操作时应慎重。 ③氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）也被用于筛选动 植物转化子的标记基因。
PstI酶切
外源DNA 黏性末端 连接酶 PstI酶切
pBR322 4363
重组子(ampstetr) 空载体(amprtetr) 插入子(ampstets)
导 入
黏性末端
重组子转化子(ampstetr) 空载体转化子(amprtetr)
影印在含Ap的平板上
涂布在含Tc的平板上
野生型的E.coli (ampstets)
缺点：需要电镜！
2. Northern blotting
用DNA（或RNA） 探针检测RNA样 品。 主要检测插入片 断是否被转录。 从宿主细胞中提 取RNA，再用探 针杂交。
Northern Blotting
Western Blotting
Southern和Western印迹法
32P-labled
重组体的筛选和鉴定
1975年，英国Southern创建
针对DNA的杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探 针进行检测的方法。
原理：将重组菌的基因组或质粒DNA提取出来，经合适的限制
性内切酶酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳分离，把定位在凝胶 中的DNA碱变性处理，使其双链DNA分开，再将凝胶中变性的 DNA转移到硝酸纤维素膜上，用制备的标记探针与其充分混合， 进行同源性DNA杂交。
为Tcr表型．而质粒为Tcs表型。
转化菌涂在Tc平板上，只有含有外源DNA插入片段
的阳性重组子的转化菌能生长成菌落。
16
（3）显色反应筛选：蓝白斑筛选
乳糖 -半乳糖苷酶 X-gal 半乳糖 + 葡萄糖 + 5-溴-4-氯靛蓝 α-互补 深蓝色 （酶活）
半乳糖
β—半乳 糖苷酶
α链（lacZα） ：四聚体装配
A
T T
表型筛选加酶切筛选
T A A T
38
二、目的克隆的鉴定
（一）核酸分子杂交(nucleic acid hybridization) 原理
具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下(适宜的温 度和离子强度)可按碱基互补的原则退火形成双链.
杂交分子可在DNA和DNA、DNA和RNA、RNA和RNA以及人工合
18
19
20
pUC18/19
5’
lacZ’
EcoRI SacI
EcoRI SacI
KpnI SmalI BamHI XbaI SalI
pUC18
PstI
SphI Hind III
ATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTG
重组dna的筛选和鉴定方法
重组dna的筛选和鉴定方法《重组DNA的筛选和鉴定：一场微观世界的“寻宝”之旅》嘿，你知道吗？重组DNA这玩意儿可太神奇了。
就像是在微观世界里搞一场超级特别的“拼接游戏”。
你把不同来源的DNA片段给组合到一块儿，就像搭积木一样，搭出一个全新的DNA组合。
可这搭完了，你怎么知道你搭得对不对呢？这就轮到筛选和鉴定方法上场啦。
我就有一次特别有趣的经历，和找东西有点像。
我有一个超级乱的抽屉，里面啥都有，小珠子、笔芯、还有各种小贴纸啥的。
我想在里面找一颗特定的珠子，那颗珠子是我朋友送我的，上面有个特别小的标记。
这就跟在一堆重组DNA里找我们想要的那个重组体差不多。
咱先说筛选方法哈。
有一种方法叫抗性筛选。
这就好比我在那堆抽屉杂物里，按照有没有某种特殊属性来挑东西。
在重组DNA的世界里呢，科学家会给载体加上抗性基因，就像给我们要找的那个特殊东西贴上一个特别的标签。
比如说，在含有氨苄青霉素的培养基里培养那些接受了重组DNA的细菌。
如果细菌能在这培养基里活下来，那就很有可能是我们想要的重组体啦。
为啥呢？因为这个重组体里带着抗性基因呢，就像那些带着特殊本领（能抵抗氨苄青霉素）的细菌，才能在这个“危险”的环境里生存。
还有一种筛选方法是蓝白斑筛选。
这就更有趣了。
想象一下啊，那些接受了重组DNA的细菌在培养皿里就像一群小居民。
正常情况下，有一种酶叫β - 半乳糖苷酶，它能让一种物质变色。
如果DNA重组成功了，这个酶的基因被破坏了，就不会变色。
就像我抽屉里有些东西，原本是亮闪闪的，要是被破坏了某个部分，就不再亮闪闪了。
在培养皿里，没重组成功的会变成蓝色的菌斑，而重组成功的就是白色的菌斑。
我当时在找那颗珠子的时候，也会根据一些类似的特征来区分东西。
比如说，我知道那颗珠子是不透明的，而其他一些珠子是透明的，我就可以根据这个来缩小寻找的范围。
那鉴定方法呢？PCR（聚合酶链式反应）就是个很厉害的鉴定手段。
这就像是拿着一个超级放大镜，去看那些特别特别小的细节。
重组子的筛选的原理
重组子的筛选的原理
重组子的筛选是指通过某种方法，从混合的DNA或RNA片段中分离出特定长度的重组子（或称为合成子、片段），以进一步进行研究或应用。
其原理主要基于两个关键步骤：构建DNA文库和筛选。
构建DNA文库：首先，通过随机切割或酶切等方法将目标DNA或RNA分子切碎成片段，然后将这些片段与载体DNA或RNA连接，创建所谓的“文库”。
这样一来，文库中就包含了大量不同长度的DNA或RNA重组子。
筛选：筛选是指从文库中筛选出特定长度（或特定的序列）的重组子。
这通常通过以下几个步骤完成：
1. 选择适当的筛选方法：根据实验目的，选择适当的筛选方法。
常见的筛选方法包括杂交筛选、PCR筛选、蛋白质互作筛选等等。
2. 筛选条件设定：根据筛选方法的要求，设置适当的筛选条件，如适当的温度、条件和试剂浓度等，以实现特定重组子的富集。
3. 筛选步骤：根据筛选方法，进行适当的筛选步骤，如杂交、PCR扩增、亲和性层析等操作。
通过这些步骤，特定长度或序列的重组子会得到放大或富集，从而分离出来。
4. 验证与鉴定：对筛选出的重组子进行验证和鉴定，例如使用测序技术验证其序列是否与预期一致，或进行功能分析等。
总的来说，重组子的筛选原理是通过构建DNA文库，并在条件和方法设定下，利用适当的筛选方法和步骤，从文库中选择和富集特定长度或特定序列的重组子。
重组子的筛选与鉴定
产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮 酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin） （蓝灰色）褪色。
2020/7/30
（1）四环素抗性插入失活
当外源DNA限制片段插入pBR322质粒的BamH I和Sal I位点时，抗 四环素基因失活，重组体转化子必定具有Ampr Tets表型。将转化 菌先涂布在含有Ampr的琼脂平板上并将存活的Ampr菌落原位影印 到另一个含有Tet的琼脂平板上，凡是在Ampr平板上生长，而不在 Tet平板亡生长的菌落，就必定是已经插入了外源DNA限制片段的重 组质粒2020转/7/3化0 子克隆。
2020/7/30
第二节 核酸分子杂交检测法 • 1 原理 • 2 核酸杂交检测方法
2020/7/30
• 利用碱基配对的原理进行分子杂交是核酸分析的重要手 段，也是鉴定基因重组体的常用方法。杂交的双方是待 测的核酸序列和由插入片段基因制备的DNA或RNA探针 。
• 这些方法都是通过一定的物理方法将菌落(噬菌斑)或提 取的DNA从平板或凝胶上转移到固体支持物上，然后同 液体中的探针进行杂交。菌落(噬菌斑)或DNA从平板或 凝胶向滤膜转移的过程称为印迹，故这些杂交又都称为 印迹(blotting)杂交。
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1、原理： 1.1 核酸杂交 重组克隆与探针杂交。 1.2 检测用的探针 与外源DNA插入片断互补的序列。 1.3 识别标记
-半乳糖苷酶 Xgal
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半乳糖 5-溴-4-氯靛蓝
载体上LacZ’的5’端有一段多克隆位点(MCS)区，本身 虽不干扰LacZ’的合成，但插入外源基因就会阻止 LacZ’的合成。不能互补。
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重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定解析
重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定实验目的：1. 学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
2. 学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。
3. 学习利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。
4. 掌握利用Cacl2感受态细胞的方法。
5. 学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。
6. 掌握α互补筛选法和PCR检测法筛选重组子的方法。
并鉴定体外导入目的DNA片段的大小。
7. 学习和掌握PCR反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。
实验原理：外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。
重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。
将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。
1. 重组子的构建酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA时不能得到完整的目的基因。
其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。
常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。
本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。
在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。
单酶切法简单易行单是后期筛选工作比较复杂。
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cDNA 探针，首先需分离纯化相应mRNA，在逆转录酶
的作用下，就可以合成与之互补的DNA(即cDNA)， cDNA与待测基因的编码区有完全相同的碱基顺序，但 内含子已在加工过程中切除
寡核苷酸探针是人工合成的，与已知基因DNA互 补的，长度可从十几到几十个核苷酸的片段。如
仅知蛋白质的氨基酸顺序量，也可以按氨基酸的
基因枪法，又称微弹轰击法是利用高速运行的金属颗粒轰击细胞
时能进人细胞内的现象，将包裹在金属颗粒表面的外源 DNA 分子随
之带人细胞进行表达的基因转化方法。
宿主细胞
原核生物细胞 大肠杆菌 枯草杆菌 真菌细胞 植物细胞 动物细胞 酵母菌细胞
转化的目的
一是大量产生重组 DNA 在完成连接反应后，重组 DNA
短波紫外线交联法固定 DNA
与放射性同位素标记探针杂交 放射自显影后～确定阳性重组子
southern 印迹杂交
Northern 印迹杂交
该法主要针对 RNA 分子的检测 由于 RNA 分子与硝酸纤维素膜结合能力相对较差
一是防止单链 RNA 形成高级结构，故必须采用变性凝胶电泳； 二是电泳过程中始终要有效抑制 RNase 的作用
转译筛选法
杂交转译筛选法
六 亚克隆法
系指将DNA片段从某一类型的载体再克隆到另一 类载体中形成的克隆。是分子克隆中最常用的操作之 一。常用于将一大段DNA克隆经限制酶切成较小片段
而重新组成的新克隆，以便于对DNA片段作进一步研
究。
第三节 阳性重组子的验证与分析
一 阳性重组子的验证
酶切鉴定法 PCR鉴定法 表达产物鉴定法 印迹分析法
DNA序列分析
125 未结合的抗体后，再与 I
标记的第二抗体结合, 从而
找出带有放射性示踪信号的斑点, 进而找出对应噬菌斑, 克隆扩增, 提取DNA后经酶切可获目的基因。
五 DNA-蛋白质筛选法
翻译
原理： 外源DNA
蛋白质
能与某一特定DNA序列结合 作为探针与克隆群体杂交 转译筛选法是通过体外转译的手段鉴定阳性克隆的方法， 可分为杂交抑制转译和杂交选择转译两种方法
探针的制备
一般是通过分子克隆（molecular cloning）获得的。克隆是指用无性 繁殖方法获得同一个体、细胞或分子的大量复制品。当不完全水解，得到许多大小不等的随机片段，将这些片段体 外重组到运载体（噬菌体、质粒等）中去，再将后者转染适当的宿主 细胞如大肠肝菌，这时在固体培养基上可以得到许多携带有不同 DNA片段的克隆噬菌斑，通过原位杂交，从中可筛出含有目的基因 片段的克隆，然后通过细胞扩增，制备出大量的探针。
质粒载体抗性标记筛选
利用抗药性基因的筛选方法 b一半乳糖苷酶显色互补筛选
蓝-白筛选
β-半乳糖苷酶可被安慰诱导物IPTG（异丙基硫代半乳 糖苷，与乳糖结构类似但不能被β-半乳糖苷酶降解）诱 导的启动子调控之下
β-半乳糖苷酶能把培养基中无色的X-gal（5-溴-4-氯-3吲哚-β-D-半乳糖苷）底物分解成半乳糖和深蓝色的5溴-4-氯-靛蓝
逆转录
M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n 3’ M N TTTTTTTTTTTT 变性 5’
启动cDNA 第一链合成
M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n 3’ 3‘ 5‘ T12MN 3’锚定引物 退火 寡核苷酸随机引物
M N TTTTTTTTTTTT 5’ 随机结合到 cDNA链上
3‘
3‘ 5’
菌落（或噬菌斑）原位杂交菌落原位杂交技术
直接把菌落或噬菌斑印迹转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上， 不必进行核酸分离纯化、限制性核酸内切酶酶切及凝胶电泳分离 等操作，而是经溶菌和变性处理后使 DNA 暴露出来并与滤膜原
位结合，再与特异性 DNA 或 RNA 探针杂交，筛选出阳性菌落或
噬菌斑，即含有目的基因的重组子
DNA 探针
就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列，它可以包括整个 基因，也可以仅仅是基因的一部分
检测灵敏度高； 标记方法简单； 相对稳定，保存时间长； 特异的理化性质如光
探针的来源
一种来自基因组中有关的基因本身，称为基因组探针；
另一种是从相应的基因转录获得了mRNA，再通过逆转 录得到的探针，称为cDNA探针。与基因组探针不同的 是，cDNA探针不含有内含子序列。 在体外人工合成碱基数不多的与基因序列互补的DNA 片段，称为寡核苷酸探针。
人工改造实现平末端分子转化为粘性末端分子
2 粘性末端分子的连接
相同的粘性末端，在进行连接时，这两个 DNA 片段在 DNA 连接酶作用下就可以共价地连接起来，形成重组 DNA
三 重组DNA分子导入受体菌
转化是感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达 DNA 分子的基因转化方法 转导是指通过噬菌体将一个宿主的DNA转移到另一个宿主的细胞中而引起 的基因重组现象 显微注射技术是一种利用显微注射仪，通过机械方法把外源 DNA 直接注人 细胞质或细胞核的基因转化方法 电转化法也称为电穿孔法在细胞上施加短暂、高压的电流脉冲，结果在质 膜上形成纳米大小的微孔， DNA 能直接通过这些微孔，或者在膜孔自行修 复闭合时伴随膜组分的重新分布而进人细胞质中
M N TTTTTTTTTTTT 5’ 不同长度的 dNTP、Taq聚合酶 延长 PCR产物 M N TTTTTTTTTTTT 5’ M’N’AAAAAAAAAAA 3’ 变性、退火、延伸 电泳 显示 回收差异条带，再扩增， 克隆测序，同源比对
mRNA差别显示技术
在寻找新基因工作中起到积极的作用
第十章 重组DNA的构建、筛选及鉴定分析
1. 重组DNA导入宿主细胞 2. 重组子的筛选
3. 阳性重组子的T12MN(M为A、G、C， 5’ T12MN 3’ N为A、T、G、C) 锚定引物 5’ 3‘ 5’
M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n 3’ Poly(A) RNA
密码推导出核苷酸序列，并用化学方法合成
核酸探针标记
为了获得基因的杂交信号必须对目的基因进行
标记。标记方法有荧光标记法、生物素标记法、
同位素标记法等
四 免疫化学检测法
噬菌斑转印到硝酸纤维膜上，各种cDNA表达并呈 现在噬菌体表面的蛋白质便牢固地结合在膜上。然后将
膜放入含有特异抗体的溶液中进行免疫结合反应，洗去
发育机理研究 杂种优势机理研究
二 重组DNA的构建
重组 DNA 的概念将目的基
因（外源 DNA 分子）用
DNA 连接酶在体外连接到适 当的载体上，即 DNA 分子
的体外重组，这种重新组合
的 DNA 称为重组 DNA
重组DNA的构建方法 1 ．平末端分子的连接
① 连接效率还是很低； ② 连接常常破坏原有的限制性核酸内切酶识别序列，可能改变原有 DNA 的读码顺序； ③ 由于平末端分子两个末端都是平的，因而在连接反应中外源 DNA 分子在载体中的插 人方向有正反两种可能，增加了假阳性； ④ 由于都是平末端分子，可能出现多个平末端分子串联后再插人到载体中的多片段 “叠连”现象，增加了假阳性的概率
后转人缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中，在仅仅缺少亮 氨酸的基本培养基上筛选，只有能利用表达产物亮氨酸 的细菌才能生长，因此，获得的转化子都是重组子
二、快速裂解菌落鉴定重组DNA分子
DNA 分子由于外源目的基因片段插人到质粒载体上， 所以重组质粒的相对分子量一定比非重组质粒要大
核酸分子杂交检测法
往往只有纳克级的量，不易操作和进一步分析
二是对重组 DNA 进行纯化。在构建重组 DNA 过程中 很难保证体系中不污染其他的 DNA 分子
第二节 重组子的筛选
一、遗传表型筛选法遗传表型筛选法
利用抗药性基因的筛选方法 b一半乳糖昔酶显色互补筛
利用抗药性基因的筛选方法
抗性标记直接筛选法 载体 DNA 上携带有宿主细胞敏感
其基本原理是：具有一定同源性的两
条核酸（ DNA 或 RNA ）单链，在 一定的复性条件下，可按碱基互补原 则退火形成双链
分子杂交方法可分为固相液相杂交、液相分子杂交和原位杂交
固相液相杂交，亦称膜上印迹杂交
提取重物重组质粒 DNA 琼脂糖凝胶电泳分离 碱变性液浸饱 中和液漂洗 进行 DNA 印迹转移 80 ℃ 下烘烤 1 h 或
营养缺陷互补
营养缺陷型是指某菌株经突变后，丧失了合成某营养素
(氨基酸，维生素，核酸等)的功能，若在培养基上培养 必须添加相应的营养素才能生长 如果外源基因能够实现其功能的表达,重组 DNA 转化到 大肠杆菌宿主细胞之后，则它所表现出来的表型性状即
可作为重组子筛选的标记
当外源目的基因为合成亮氨酸的基因时，将该基因重组
的抗生素的抗性基因， pBR322 质粒载体，它上面含有的氨卞青霉素抗性基因 和四环素抗性基因
抗性基因插入失活筛选法
当用某种限制性核酸内切酶消化并在此位点插入
外源目的 DNA 时，抗药性基因不再被表达，称为基
因插入失活。因此，当此插人外源 DNA 的重组质粒 载体转化宿主菌并在药物选择平板上培养时，根据对 该药物由抗性转变为敏感这一特征，观察菌落生长状 况便可筛选出阳性重组子