核酸提取方法对乙肝病毒定量PCR检测结果的影响

和 植物组 织 中 DN A
。我们在 K aneko 等人
[ 4]
的基础 上对碱裂 解法进 行改
良 , 提取慢性 乙 肝 病 人 血 清 HBV - DNA 并 应 用于 荧 光 定 量
作者单位 : 中南大学医学技术与情报学院医学检验系( 中国 湖南 410078) 作者简介 : 黄 王月( 1972 - ) , 女 , 湖南长 沙人 , 检验师 , 主要从 事医学 检验 工作。 通讯作者 : 徐克前。 长沙
行改良。 50 l 血 清中 加 入 50 l 0. 4 M N aOH, 80 7. 5) , - 4 贮存备用。
min 。 15 000 r 离心 30 s, 取上清 , 加入 25 l 0. 4 M T r isHCl( pH 酚氯仿抽提法 [ 5] : 备用血清 50 ml 加 消化 3 h。 入 0. 5% SDS 和蛋白酶 K( 终浓度为 100 g/ ml) 70
2. 1 HBV - DNA 荧光 定量的结 果 取的 DNA 含量 ( 9. 86
106 拷贝 数 / ml) 和 煮 沸 裂 解 法 ( 6. 32
表1
样本处理方法 碱裂解法 酚氯仿法 煮沸裂解法相似 , 明显低于酚氯仿法。
3 种样本处理方法对 HBV- D NA 的定量的影响
述如下 : 50 l 血清中加入等体积裂解液 , 煮沸 10 min。 15 000 r 离心 5 min, 然后取上清 , - 4 1. 2. 2 HBV - DNA 定量测定
718
实用预防医学
2004 年 8 月
第 11 卷
第4期
Practical Preventiv e M edicine, Aug. 2004, Vol 11, No. 4
文献标识码 : A 中图分类号 : R 373 2+ 1
碱裂解法所得 HBV - DNA 量 高于酚氯仿法和煮沸裂解法 ( P < 0. 05) , 并且 碱裂解法 所得结 果的重 复性好 于酚氯 仿 结论 碱裂解 法提取 HBV - DNA 简 单、 快 速 , 适用于 HBV - DNA
The Influence of Nucleic Acid Extraction f rom Serum on HBV DNA Detection by Fluorescence Quantitative PCR H UANG Yue, ZHANG Wei - hua, WANG Long - wu, et al. ( Xiangya School of Medicine, Central South University , Changsha, 410078 ) Abstract: Objective To develop a simple and rapid method for extracting nucleic aci d from serum on HBV- DNA de tection by PCR. Methods an Alkaline l ysis method was used to isolate serum HBV- DNA for fluorescence quantitative PCR and compared wi th conventional phenol- chl oroform extr action method and boiling lysis method. Results The HBVDNA quantitative values by PCR using the alkaline lysi s were hi gher than the phenol- chloroform extraction method and boi ling lysis method ( P < 0. 05 ) . Moreover, The HBV- DNA quanti tative values by PCR using the alkaline lysis were more repro ducible than the phenol- chloroform extraction method and boi ling lysi s method ( CV: 0 . 21, 0 . 28 and 0. 33 , respectively) . Conclusion The alkaline lysi s method i s simple, rapid and efficient for extraction of serum HBV- DNA and sui table for HBV - DNA quantitative PCR detection. Key words: HBV; DNA; E xtracti on; PCR 乙型肝炎病 毒 ( HBV) 感 染是 乙型肝 炎的 主要 病因。 目前 临床上对 HBV 的 检测 主要是 靠血 清学 方法 , 但 其检 测率 相对 较低 , 对 HBV 早 期 感 染 不能 有 效 的 检 测。而 聚 合 酶 链 反 应 ( PCR) 则由于其 特异性高、 快速、 灵敏 , 故在对 HBV 检测中迅速 得到应用。特别荧光定量 PCR 技术 , 能对 HBV - DNA 定 时定 量测定 , 在乙 型肝 炎 病人 的临 床 治疗 监测 中 具 有重 要 参考 价 值 , 是国内用于 HBV - DNA 定量测 定的 基本 方法。 建立 一种 重复性、 准确性好的定 量 PCR 检测方 法非常 重要 , 影响因 素除 PCR 扩增本身外 , 还有一个 重要环 节就是 样本处 理 , 即 HBV DNA 的提取 , 是 影响 PCR 测 定准 确 性和 重复 性 的重 要 因 素。 经典的 HBV- DN A 的提取是 采用酚氯仿法 , 但由 于操作繁 琐 , 临床测定较少采用。目前国内常用 HBV- DNA 测定的 PCR 试 剂盒均采用煮沸裂 解法 , 此 法具 有简 便、 快速 的特 点。强 碱溶 液 ( 如 N aOH 溶液 ) 能裂解细胞 膜和核膜 , 使 DN A 释放出来 , 并 使核酸酶变性失活 , 保持 DNA 一 级结构的 稳定性 法已广泛 用于 细菌 中质粒 DNA 的分离 的分离
黄
摘要 : 果 目的
王 月,
张卫华, 王龙武, 徐克前
方法 使 结
寻找简单、 快速地提取血清乙型肝炎病毒 ( HBV ) DNA 并 能应用于定量 PCR 测定的方法。
用碱裂解法、 酚氯仿法和煮沸裂解法同时 提取血清 HBV- DN A, 比较荧光定量 PCR 测定的重复性和测定值的差异。 法和煮沸裂解法 ( CV 分别为 0. 21, 0. 28 和 0. 33) 。 荧光定量测定。 关键词 : 乙型肝炎病毒 ; DNA ; 提取 ; PCR
, 故碱 裂解
加等体积的苯酚、 氯仿、 异戊醇混合物 ( 体积比为 25: 24: 1) 和 氯 仿 - 异戊醇混合物 ( 体积 比为 24: 1) 各抽 提 1 次 , 留 水相 , 加 入 1/ 10 体积约 3 mol/ L 醋酸钠和 2~ 2. 5 倍体 积的冰无 水乙醇 离 心沉淀 , 再用 70% 的乙醇洗 1 次 , 自然干燥 , 37 中溶解 , - 4 贮存备用。 下在 50 l T E 煮沸裂解法 : 按试剂盒说明操作 简 贮存备用。 取 20 份乙型肝炎患者血清 , 每
样本数 20 20 20 H BV- DNA( 拷贝数/ ml) ( x 9. 86 106 7. 24 106 3. 25 106 2. 24 106 s) 时间 < 15 m in 15 min > 3h
6. 32 106
3. 15 106
无需多次转移 , 降低了外源性 HBV - DN A 污 染的可能 性 , 从 而 2. 2 对 HBV - DNA 定量测定重复性的 结果 从 表 2 可见 , 同 耗 费极低 , 无需贵 重试剂和 特 一样本分别用 3 种方法各提取 10 次 , 碱裂解 法处理 样本 , 测定 HBV- DNA 的 重 复 性 ( CV: 0. 21) 明 显 好 于 酚 氯 仿 法 ( CV : 0. 28) 和煮沸裂解法 ( CV : 0. 33) 。
量测定重复性较差。碱裂解法提取 DNA, 虽然也没经过纯化 处 理 , 但强碱溶液可使 PCR 抑制物如血红素和其他一些蛋白质 变 性失活 , 从而解除对 T aq 酶的抑制 作用 [ 7] , 因而 HBV - DN A 荧 光定量测定重复性较好。我们的 结果也 表明 , 碱裂解 法处理 样 本后 , HBV - DNA 荧光定量测定的批内 CV 明显 小于煮沸裂 解 法和酚氯仿法。碱裂解 法提取 DNA , 一 是碱 裂解细 胞能 力强 , 二是基本在一个试管中进行 , 无多次 转移 , 避免了样 本 DN A 的 丢失 , 故 HBV- DN A 荧光 定量 测定敏 感性 和准 确性 较高。 我 们的研究也表明 , 碱裂解法处理标 本 , 测量 HBV - DNA 的含 量 明显高于酚氯仿法和煮沸裂解法。 K eneko 等 [ 4] 报道了从血清中提取 HBV - DNA 的试验并进 行了成功的扩增。我们在此基 础上做了 改进 , 发现当 NaOH 浓 度增大到 0. 4 M , 扩增效率 显著增 高 ; 当 裂解的 时间不 变 , 温 度 37 ~ 80 时 , 扩增效率较高 ; 当裂解温度 为 80 时 , 扩增 效 率最高 , HBV- DNA 定 量测 定重 复性 最 好。同 时裂 解温 度 为 80 , 提取 HBV- DN A 所需时间可明显 缩短。 碱裂解法处理样 本还 有以 下许 多优 点 : 单 , 省时 , 整个过程 不超 过 15 min; 消除了 PCR 分析的 潜在错误 ; 殊仪器。 综上所述 , 碱裂解法提 取血清 HBV - DN A, 简单、 快 速、 耗 费低 , 用于 HBV- DNA 荧 光定量 测定 敏感 性高、 重 复性 好 , 适 用于临床实验室推广和使用。 [ 参考文献 ] 步 骤 少 , 操作 简 基本 在一 个试 管中 进行 ,
一份样本分 别 经上 述 3 种 方法 处 理后 , 然 后 进 行荧 光 定量 测 定。操作和条件参照 HBV- DNA 荧光 定量 PCR 试剂盒说明。 1. 2. 3 样本处理方法对测定的重 复性的 影响 取 1 份样 本分 别用上述 3 种方法各提取 10 次 , 然后 进行荧 光定量 测定 , 比较 3 种不同方法的测定重 复性。 1. 2. 4 统计学分析 3 种不同方法 处理样本 后所测 得 HBV DNA 含量的均值比较采用单因素方差分析。 2 结果 从表 1 可见 , 碱裂解 法提 106 拷 贝 数 / ml ( P < 106 拷 贝数 / ml) 高于酚 氯仿法 ( 7. 24
[ 3] [ 2] [ 1]
PCR, 取 得了很好的效果。 1 材料与方法 样本为 取临 床乙型 肝炎 患者 血清 , 并 选择 其中 经
1. 1 材料
ELI SA 法 检 测 为 大 三 阳 的 标 本 , 即 : HBsAg ( + ) ; HBeAg ( + ) ; anti- HBcA g ( + ) 。试 剂为 N aOH( 上 海 生 工 ) 、 HBV DNA 荧光定量 P CR 试剂盒 ( 华美生物技术公司 ) 。仪器为 5700 型荧光定量 P CR 仪 ( PE, 美国 ) 、 离心机 ( 湖南仪表总厂 ) 。 1. 2 1. 2. 1 方法 DNA 的 提取 碱裂 解法 : 在 K aneko 等 [ 4] 基 础上 进 保 温 10
实用预防医学
2004 年 8 月
第 11 卷
第4期
Practical Pr eventive M edicine, A ug. 2004, V ol 11, N o. 4
717
文章编号 : 1006- 3110( 2004) 04- 0717- 02
论
著
核酸提取方法对乙肝病毒定量 PCR 检测结果的影响