流感病毒核酸检测作业指导书

流感病毒核酸检测作业指导书

1 适用范围

适用于鼻拭子、咽拭子、漱口液、鼻腔冲洗液、鼻腔吸取物、气管吸取物等样品中流感病毒的核酸PCR检测。

2 原理

基于PCR原理进行的核酸检测。

3 仪器设备

3.1 QIACube工作站

3.2 ABI7500荧光定量PCR仪器

3.3 核酸电泳仪

3.4 离心机

3.5 -20℃冰箱、-70℃冰箱、2~8℃冰箱

3.6移液器（1-10µL，10-100µL，100-1000µL）

4 试剂耗材

4.1 QIAGEN核酸抽提试剂盒

4.2 PCR试剂盒

4.3 不同规格移液枪头

4.4 1.5 mL Eppendorf 离心管

5、操作步骤

5.1 核酸提取

5.1.1 使用QIAGEN手工抽提试剂盒进行核酸抽提

5.1.1.1 试剂准备

Carrier RNA试剂的准备：将310μL Buffer A VE加入到1管冻干的Carrier RNA（310μg）中，混合均匀，彻底溶解Carrier RNA；将溶解的Carrier RNA分装3~4小管，于-20℃冰箱保存。临用时根据具体样品量进行Buffer A VL工作液的配置。每管Carrier RNA反复冻融不得超过3次。

Buffer A VL工作液的配置：Buffer A VL原液保存于正常室温条件下，使用前观察有无结晶。若有，可置于80℃温度下少于5min快速溶解后使用。根据下列公式计算各成分含量进行Buffer A VL工作液的配置。

n × 0.56mL = y mL；

y mL × 10µL/mL = z µL

n表示本次试验所要抽提的总样品数，包括空白阴阳性对照数；

y 表示计算所得要使用的Buffer A VL工作原液；

z 表示计算所得要使用的含Carrier RNA的Buffer A VE（Carrier RNA-A VE）的量；

下表列举出1-12个样品Buffer A VL工作液配制所要使用的Buffer A VL原液与Carrier RNA-A VE的量。

含Carrier RNA的Buffer A VL工作液4℃保存48小时有效，使用前置37℃水浴让结晶溶解，并混匀。

Buffer AW1工作液：（按下表配制，配制好的工作液室温保存）

Buffer AW2工作液：（按下表配制，配制好的工作液室温保存）

说明：上述各表是根据目前所使用试剂配制所需的各成分含量，当试剂改进后需根据新的试剂说明书进行试剂的配制。

5.1.1.2核酸抽提

5.1.1.2.1取1.5mL离心管，加入560μL Buffer A VL工作液；

5.1.1.2.2分别加入140μL标本、阴性对照、临界阳性对照、强阳性对照，涡旋振荡混匀15秒；

5.1.1.2.3 室温放置10分钟，瞬间离心；

5.1.1.2.4 加入560μL浓度为100%乙醇，涡旋振荡混匀15秒，瞬间离心；

5.1.1.2.5 取630μL上述液体加入带有2 mL废液离心管的QIAamp离心柱，8000rmp离心1分钟；弃去滤液，换一个干净的废液收集管；

5.1.1.2.6 重复2.5；

5.1.1.2.7 打开QIAamp离心柱，加入500μL Buffer AW1工作液；

2.8 8000rmp离心1分钟，弃去滤液；

5.1.1.2.9打开QIAamp离心柱，加入500μL Buffer AW2工作液，14000rmp离心3分钟，弃去滤液；

5.1.1.2.10 将QIAamp离心柱放入一个2mL废液收集管，14000rmp离心1分钟；

5.1.1.2.11 将QIAamp离心柱放入一个1.5mL离心管，打开QIAamp离心柱，加入平衡至室温的A VE洗脱液60μL，室温放置1分钟，8000rmp离心1分钟。离心后的液体即为抽提的RNA；

5.1.1.2.12 在离心管上标记编号，包括样品编号、样品性质、抽提日期；

5.1.1.2.13 标记好后置-70℃冰箱保存待用。

5.1.2使用QIACube工作站进行核酸抽提

5.1.2.1试剂准备

Carrier RNA试剂的准备：将310μL Buffer A VE加入到1管冻干的Carrier RNA（310μg）中，混合均匀，彻底溶解Carrier RNA；将溶解的Carrier RNA分装3~4小管，于-20℃冰箱保存。临用时根据具体样品量进行Buffer A VE工作液的配置。每管Carrier RNA反复冻融不得超过3次。

Buffer AW1工作液：（按下表配制，配制好的工作液室温保存）

Buffer AW2工作液：（按下表配制，配制好的工作液室温保存）

需要注意的是，使用QIACube工作站进行核酸抽提，Buffer A VL工作液使用原液，这是与QIAGEN手工抽提试剂盒进行核酸抽提时试剂配制的不同之处。

下表列出了2-12个样品（不能进行1或11个样品抽提）进行核酸抽提时部分试剂的配制量。

说明：上述各表是根据目前所使用试剂配制所需的各成分含量，当试剂改进后需根据新的试剂说明书进行试剂的配制。

5.1.2.2 试剂、耗材等的放置

5.1.2.2.1 各试剂的安放

根据仪器说明书的要求准备好试剂；

5.1.2.2.2 硅胶膜过滤柱及1.5mL Eppendorf管的安放

根据仪器说明书的要求准备好过滤柱与样品收集管；

5.1.2.2.3 样品的安放

根据仪器说明书的要求准备好样品；

5.1.2.2.4 离心吊篮的安放

根据仪器说明书的要求在指定位置安放好离心吊篮。

5.1.2.3 程序运行

根据仪器设备的液晶显示面板，选择RNA核酸抽提，抽提过程中不得随意打开仪器盖子，否则程序运行会终止。

如意外情况导致仪器设备程序运行被迫终止，可从终止时的步骤开始，继续根据手工试剂盒的抽提方法进行核酸抽提。

5.2 基因扩增

5.2.1 Real-time PCR