流感病毒核酸检测作业指导书
标准操作规程(SOP)——禽流感病毒H5N1 NASBA检测
一、目的确保H5N1禽流感疑似病例标本得到有效的检测，为禽流感H5N1感染提供可靠的实验室诊断依据。
国家流感中心实验室按照规定方法对疑似H5N1禽流感感染病例的标本进行处理和检测，使疑似禽流感病例标本的处理和检测得到有效的控制。
保证检测结果的快速性和可靠性，同时确保样本不被污染和污染环境。
二、范围适用中国国家流感中心操作人员进行疑似H5N1禽流感病例标本的检测。
三、定义核酸序列依赖性扩增（Nuclear acid sequence-based amplification ，NASBA ）检测技术是一项快速等温核酸扩增并能实时观测结果的检测技术，该技术的检测反应有赖于AMV 逆转录酶、噬菌体T7 RNA 多聚酶、核糖核酸酶H 、两种特别设计的特异性寡核苷酸引物和分子信标探针共同协作而完成。
如下是在检测结果分析中涉及到的几个概念：1．样品检测信号值（WT signal ）：在扩增过程中分子信标探针与靶基因发生特异性结合后，产生荧光信号的荧光信号被收集经软件转换后的强度值，即WT signal 。
2．阈值（threshold ）：在NASBA 反应过程中会产生荧光信号，阈值是判断阴性或阳性结果的荧光信号界线值，样本荧光信号≥阈值者为阳性，反之为阴性。
图1：NASBA 检测标准曲线Time WT Signal标准操作规程（SOP H5N1 NASBA四、背景本SOP是为了疑似H5N1禽流感感染的诊断而制定，确保禽流感病例诊断的快速性和可靠性，同时要求实验操作过程中标本不被污染或污染环境。
五、程序（一）生物安全要求标本裂解在BLS-3实验室，其余操作部分在具有规范分区（体系配制区、核酸提取区和检测分析区）的BSL-2级实验室进行并遵守相应生物安全规定。
详细生物安全防护参见“生物安全个人防护SOP”。
（二）材料及仪器1．梅里埃公司 Nulisens EasyQ 检测分析系统。
2．孵育器3．离心机4．移液器：规格分别为0.5~10μL、20~200μL和100~1000μL各一支。
流感病毒的核酸检测技术操作规范
流感病毒的核酸检测技术操作规范（一）流感病毒Conventional one step RT-PCR 检测应用核酸检测技术为疑似流感病毒感染病例诊断提供依据，为流感病毒的型别和亚型的鉴定提供技术方法。
按照规定方法对标本和病毒进行处理和检测，保证检测结果的快速性和可靠性，同时确保样本不被污染和污染环境。
1.生物安全要求实验室操作应当遵守生物安全实验室的有关生物安全的规定。
季节性流感病毒生物安全二级，疑似高致病禽流感病例标本需在BSL-2级实验室操作，采取BSL-3级防护；核酸提取及加RNA模板可在BSL-2级实验室生物安全柜内操作；PCR反应体系配制在体系配制区；PCR产物检测在电泳区操作。
2.主要试剂（所列厂家仅用作举例，实验室可自行选择）注：*引物序列详见表1.3.设备（1）BSL-2生物安全柜；（2）可调转速最大至140rmp的离心机；（3）涡旋混合器；（4）10p L，1pL，2pL，10^L量程移液器；（5）PCR 仪；（6）电泳槽和电泳仪；（7）凝胶成像系统。
4.质量控制（1）实验检测所需核酸提取试剂和一步法RT-PCR检测试剂不同批号之间需进行灵敏度的检测。
同一试剂不同批次的灵敏度的检测至少半年一次。
（2）实验检测除待检标本外还需设置阳性对照及阴性对照，阳性对照核酸事先应稀释分装，经Real-time PCR检测Ct值在30以内；阴性对照为DEPC处理水Real-time PCR检测Ct值为0.5.实验步骤（1）实验注意事项由于PCR检测灵敏度高，因此必须采取一些预防污染的措施，以避免假阳性结果的出现，建议采取如下方法：a）核酸提取、反应液配制及检测反应进行应在独立的房间中进行。
b）不同的房间配制相应的专用耗材和设备，不可交叉使用。
c）配制反应液时，应穿着干净的实验服，带无粉手套进行操作。
d）实验操作期间，如怀疑有污染，请更换手套。
e）试剂及反应管的盖子应尽可能盖上。
（2）设备准备操作台的表面、枪头和离心机应保持洁净，可用5%漂白剂或其它清洁剂，如可以去除DNA酶的试剂擦拭台面，以减少核酸污染的风险。
流感病毒实验室pcr检测技术
流感病毒实验室pcr检测技术
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Real-Time PCR
▪ 基础原理:指在RT-PCR反应体系中加入荧光基团, 利用荧光信号积累实时监测整个RT-PCR进程,最 终经过标准曲线对未知模板进行定量或定性分析 方法.荧光基团主要有TaqMan荧光探针和SYBR 荧光染料
标本采集（一）
▪ 主要采集上呼吸道标本 ▪ 鼻咽拭子：将棉签平行于上颚插入鼻孔，保持几
秒吸收分泌物。 ▪ 口咽拭子：拭抹咽后壁和扁桃体部位，防止触及
舌部；快速将棉签放入无菌、内装3-5ml样本运 输液及带垫圈螺口塑料管中，在靠近顶端处折断， 旋紧管盖并密封。 ▪ 气管分泌液：搜集气管吸收液或支气管浇灌液510ml放入无菌、带垫圈50ml螺口塑料管中，马上 密封。
区、旅游区）人群健康，快速诊疗将提供有效信息以 供控制方案制订，提供有效公共健康提议。
流感病毒实验室pcr检测技术
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快诊应用价值
➢ 监测：为社会公众提供流感活动情况“早期预警”系 统。在一些国家快速检测已经被应用流感监测形成制 度，被用于病毒分离前标本筛选。不过WHO要求对 流感进行抗原分析，不推荐把快速检测作为监测单一 伎俩。
▪ TaqMan荧光探针工作原理:PCR扩增时,在加入一 对引物同时加入一个特异性荧光探针,探针两端分 别标识一个汇报荧光基团和淬灭荧光基团.探针完 整时,汇报基团发射荧光信号被淬灭基团吸 收;PCR扩增时 ,探针被酶切降解,汇报基团和淬灭 基团分离,从而荧光监测系统接到荧光信号,每扩 增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧 光信号累积与PCR产物形成完全同时
流感病毒核酸检测标本采集、送检、处理流程
流感病毒核酸检测标本采集、送检、处理流程1. 引言流感病毒核酸检测是一种常用的检测方法，可以用于流感的早期诊断和监测。
本文档旨在提供流感病毒核酸检测标本采集、送检和处理的详细流程，以确保准确、及时和安全的检测结果。
2. 标本采集标本采集是流感病毒核酸检测的第一步，正确的采集方法对于后续检测结果至关重要。
以下是标本采集的步骤：1. 选择合适的采集时间：流感病毒在病程初期时最容易检测到，因此最好在症状开始后的48小时内采集标本。
2. 选择合适的采集方法：常见的标本采集方法包括咽拭子采集、鼻拭子采集和咳痰样本采集。
根据临床需要和采集者的经验选择合适的采集方法。
3. 采集过程：采集者应使用无菌手套，并根据操作要求进行准确的采集。
在采集过程中，要避免其他污染源的接触，确保标本的纯净度。
4. 标本保存和运输：采集后，标本应立即储存于适当的中，并在规定的时间内送往实验室进行处理。
3. 送检送检是将采集的标本送往实验室进行核酸检测的步骤。
以下是送检的流程：1. 填写申请单：在送检前，检测人员应填写标本的相关信息，如姓名、性别、年龄等，并注明流感病毒核酸检测的要求。
2. 标本包装：将已采集的标本放入密封袋中，确保袋子密封良好，避免标本在运输过程中的泄漏。
3. 运输方式：根据实验室的要求，选择适当的运输方式。
一般情况下，标本应使用专用的运送盒，采取冷链运输以确保标本的质量。
4. 相关文件：将申请单和相关的送检文件一同放入密封袋中，以便实验室对标本的追踪和管理。
4. 处理流程实验室收到标本后，需要进行一系列处理步骤以获得准确的核酸检测结果。
以下是处理流程的主要步骤：1. 样本接收：实验室收到标本后，应及时确认标本的完整性和相关信息的准确性，并记录相关数据。
2. 样本处理：对标本进行必要的预处理，如离心、去除细胞和红细胞沉淀等，以提取标本中的核酸。
3. 核酸提取：使用合适的提取试剂和方法，从标本中提取核酸。
在提取过程中，应采取相关措施以防止实验室内的交叉污染。
甲型流感病毒检测方法及技术方案H1N1
甲型（H1N1）流感病毒实验室检测技术方案(试行)广州健仑生物科技有限公司整理本方案旨在为全国流感监测网络实验室提供甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案，不用作商业活动或赢利目的。
一、标本的采集种类和要求1、推荐采集的呼吸道标本种类疾病发病后应尽快采集如下标本：鼻拭子、咽拭子、鼻腔吸取物、鼻腔冲洗液。
气管插管的病人也应收集气管吸取物。
标本应置于无菌病毒采样液，并立即用冰块或冰排保存或置于4 ℃（冰箱），并马上送至实验室。
（临床样品采集人员及实验室检测人员的感染控制指导请见相关文件。
）采样同时填写疑似人感染甲型H1N1感染病例标本采样单。
（附表1）2、拭子的选择标本应使用头部为合成纤维的拭子（例如，聚酯纤维），用铝或塑料做柄。
不推荐棉拭子和木柄。
标本采集管应包含3毫升病毒采样液（含有蛋白质稳定剂，阻止细菌和真菌生长的抗生素，缓冲液）3、临床标本储存要求保存在4℃（不能超过4天）或者-70℃或-70℃以下。
有条件的实验室均应保存在-70℃或-70℃以下。
不应保存在-20℃。
4、标本的分装处理标本送至实验室后，立即进行处理，避免反复冻融。
将原始标本分为三份，一份用于核酸检测，一份用于病毒分离，一份保存待复核。
5、标本的运输疑似人感染甲型H1N1感染病例列为 A类，用UN2814包装运输。
填写疑似人感染甲型H1N1感染病例标本送检单（附表2）。
二、核酸检测基于PCR原理的核酸检测方法是一种快速有效的诊断方法，在突发传染病应急工作中发挥了巨大作用。
1、基于real-time RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒（引物和探针序列为美国CDC设计）：4月29日WHO网站上公布了美国CDC设计的针对此次甲型H1N1流感病毒的real-time RT-PCR引物和探针，此实验用于检测疑似甲型H1N1流感病例的呼吸道样本, 因此，用此real-time RT-PCR的方法，建议首先筛选甲型流感病毒并排除季节性流感病毒和H5N1禽流感病毒。
甲乙流操作简易流程
甲乙流操作简易流程甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂（胶体金法）操作简易流程【检验原理】本品利用免疫层析技术，采用双抗体夹心法检测甲型和乙型流感病毒抗原。
【储存条件及有效期】4℃～30℃保存，产品有效期24个月。
铝箔袋开封后，测试卡应在1小时内尽快使用。
样本提取液使用后应立即加盖，并置于阴凉处或冰箱内，请在有效期内使用。
【样本要求】采集样本的无菌拭子推荐使用PP（聚丙烯）杆的聚酯海绵拭子。
1. 2.2.标本采集后应尽快采用病毒采样液或本试剂盒提供的样本提取液进行处理。
如不能立即处理，标本应立即置于干燥、消毒并严格密封的塑料管内储存，2℃～8℃下可保存8小时，-70℃可长期保存。
【检验方法的局限性】1. 本试剂仅供检测鼻咽拭子和口咽拭子的呼吸道分泌物。
2. 测试的准确性取决于采集样本过程，样本采集不当、样本储存不当、样本不新鲜或样本反复冻融均会影响检测结果。
3. 采集的样本若存在个别药物如高浓度的非处方药和处方药（鼻腔喷雾剂）会干扰结果。
若结果可疑，请重新测试。
5. 本试剂的检测结果仅供临床参考，不得作为临床诊治的唯一依据，对患者的临床管理应结合其症状/体征、病史、其它实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。
6. 受抗原类检测试剂方法学的限制，其分析灵敏度普遍较核酸类试剂低，故实验人员应对阴性结果给予更多的关注，需结合其它检测结果综合判断，建议对有疑问的阴性结果采用核酸检测或病毒培养鉴定方法进行复核。
7. 对甲型流感病毒的检测，建议对阳性结果进一步实验以确认甲型流感病毒的亚型，并向当地公共卫生预防机构咨询协商处理。
8. 有关假阴性结果的可能性分析：①不合理的样本采集、转运及处理、样本中病毒滴度过低均有可能导致假阴性结果。
②病毒基因变异可能导致抗原决定簇的改变，从而造成假阴性结果，使用单克隆抗体的试剂更易发生此类情况。
③最适样本类型以及感染后的最佳采样时间（病毒滴度峰值）未经验证，因此，在同一患者分次、多部位采集样本可能会避免假阴性。
医院人感染H7N9禽流感病毒核酸检测标准操作程序
医院人感染H7N9禽流感病毒核酸检测标准操作程序一、目的确保人感染H7N9禽流感病毒核酸检测过程标准化、规范化，降低人为不规范操作对检测结果造成的影响，保证结果的准确性和可重复性。
二、适用范围医疗机构临床基因扩增检验实验室按照《关于医院开展人感染H7N9禽流感病毒核酸检测有关工作的通知》（卫办医政函〔2013〕383号）和《关于做好医疗机构人感染H7N9禽流感检测试剂供给保障工作的通知》（卫发明电〔2013〕29号）有关要求，使用国家疾病预防控制中心制备或商品化试剂盒开展人感染H7N9禽流感病毒核酸检测工作。
三、样本采集、运送和保存尽量采集病例发病早期的呼吸道样本(上呼吸道样本包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液和鼻洗液, 下呼吸道样本包括痰液、气管吸取物、肺洗液、肺组织等)。
可将鼻、咽拭子收集于同一采样管中，以便提高检出率。
患者有下呼吸道样本时，应优先采集。
根据试剂说明书对样本采集方法有关要求，制订样本采集标准操作程序（SOP），并组织样本采集人员进行培训及考核。
样本的采集应当严格按照SOP进行。
样本采集后，按照《人间传染病的病原微生物名录》中高致病性禽流感病毒的相关规定进行包装，用密封容器立即送往实验室。
若气温高时，需放入冰块降温。
样本抵达实验室后，应尽快进行检测，24小时内能检测的样本可置于2～8℃暂时保存，24小时内无法检测的样本则应置于≤-70℃状态保存。
如无-70℃保存条件时，可于-20℃冰箱暂存。
样本避免反复冻融。
样本采集、处理、运输及保存不当时，可因病毒RNA降解出现假阴性结果，也可因为样本“污染”出现假阳性结果。
四、PCR检测（一）样本处理样本的核酸提取应当在样本处理区进行。
按所采用的商品化试剂盒说明书要求，取适量待检样本、阳性及阴性对照进行核酸提取。
样本应尽可能新鲜，提取过程应严防RNA酶污染及操作不当导致的RNA降解。
提取过程如涉及离心步骤，应采用低温冷冻离心机；在生物安全柜内进行加样、提取过程中，为防止RNA降解，可将试管架置于托盘内平铺的碎冰上。
流感病毒核酸检测—标本运输
流感病毒核酸检测—标本运输
概述
本文档旨在介绍流感病毒核酸检测标本的正确运输方法。
标本运输的合理性和规范性对于确保检测结果的准确性至关重要。
标本选择
在进行流感病毒核酸检测标本运输前，应首先选择合适的标本类型。
一般而言，下呼吸道标本（如咽拭子、鼻拭子、痰液等）是流感病毒核酸检测的常用标本。
标本采集
标本采集过程中，务必注意以下要点：
- 使用无菌采集工具进行标本采集；
- 遵循相关标本采集操作规范，确保采集到足够的标本量；
- 避免标本污染，确保标本的纯净度。
标本包装
在标本运输过程中，正确的包装是保证标本完整性和安全性的关键。
- 使用合适的，如密封的塑料袋或标本收集管；
- 标记标本信息，包括患者姓名、采集日期和时间等；
- 在包装中添加吸收剂，以保持标本的湿润状态。
标本运输
标本运输的目的是确保标本在运输过程中的稳定性和安全性。
- 使用适当的运输，如特制冷藏盒或冰袋；
- 保持适当的温度，根据标本类型选择合适的运输温度，如冷藏运输或干冰运输；
- 注意防止标本的震动和碰撞，减少标本破损的风险。
运输信息记录
在标本运输过程中，记录运输信息是非常重要的。
- 记录标本的运输起始时间和截止时间；
- 记录标本的运输温度，确保温度要符合标本运输要求；
- 记录每个运输阶段的标本位置，以便跟踪运输进展。
结束语
流感病毒核酸检测标本的正确运输过程对于确保检测结果的准
确性至关重要。
请在进行标本运输时，遵循本文档所述的正确方法，确保标本完整性和安全性，并记录相关信息以便跟踪运输进展。
甲型乙型流感病毒核酸检测试剂盒(荧光PCR法)sop
甲型乙型流感病毒核酸检测试剂盒（荧光PCR法）操作规程1 目的：规范操作流程，确保检测结果的准确性可靠性。
2 范围：甲型/乙型流感病毒核酸检测试剂盒（荧光PCR法）3 操作人：甲型/乙型流感病毒核酸检测人员对此规程负责4 内容：4.1 核对本次实验所有标本与申请单对应的编号，统计本次实验标本总数，确定所需实际量。
实际检测数量为所需检测样本数量和阴阳对照品总和。
4.2 试剂准备：4.2.1 进入试剂准备区，更换本区实验服和实验鞋，戴上手套、口罩。
4.2.2 打开照明灯，从冰箱中取出本次实验所需试剂。
4.2.3 打开超净工作台，在废液缸中加入新鲜配置的10%的次氯酸钠溶液。
4.2.4 取出本次实验所需耗材，如离心管、离心管架、吸头。
将试剂盒中的核酸扩增反应液、酶混合液、检测液、阳性对照、空白对照、DNA提取液取出，置于离心管架上。
待室温溶解后，瞬时离心，备用。
4.2.5 根据样本量计算需准备检测试剂人份数N（N=样本数+阳性对照+空白对照）。
4.2.6 按比例（核酸扩增反应液7.5μl/人份+酶混合液5μl/人份+甲型/乙型流感病毒反应液4μl/人份+去RNA酶水 3.5μl/人份）将各组分在离心管中混匀后瞬时离心，配置成PCR-mix，并按20μl/管依次分装到对应编号PCR八连管中。
4.2.7 将分装好的PCR-mix盖上PCR板盖，放到传递窗，收拾好试验台，将垃圾桶内的废弃物丢弃到医疗垃圾桶中并用10%的次氯酸钠溶液清洗干净，将移液器调回最大量程，换下本区工作服。
4.3 样本处理：4.3.1 进入样本处理区，更换本区实验服和实验鞋，戴上手套、口罩。
4.3.2 开启生物安全柜照明灯，将样本、试剂、分装好的PCR-mix放入生物安全柜内，在废液缸中加入新鲜配置的10%的次氯酸钠溶液。
4.3.3 取200μl的待测样本、阳性对照、弱阳性对照和空白对照用病毒核酸提取试剂盒提取核酸。
本试剂盒的阳性对照、弱阳性对照、空白对照参与提取，用于对环境的监控和试剂的质控。
实验室流感检测操作流程-Gavin
结果判读与分析
FAM通道.
检测甲流
【阳性判断值】 1. 阳性： Ct≤37且曲线呈S型 。 2. 阴性： Ct>40 或者未检出。
VIC通道.
检测乙流
【阳性判断值】 1. 阳性： Ct≤37且曲线呈S型 。 2. 阴性： Ct>40 或者未检出。
结果判读与分析
通道 病原体基因
01
人流感主要是甲型流感病毒和乙型流感病毒引 起
02
一般秋冬季节是其高发期（11月—次年3月）
03
从感染到发病之间的间隔时间（称为潜伏期） 大约2天，但可在1天到4天之间
甲型流感分型
01. 甲型流感病毒：根据病毒表面蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶 （NA）的组合情况进一步分类为亚型。
02. 目前正在人际间传播的甲型流感病毒是甲型H1N1和甲型H3N2流 感亚型。
核酸加样
体系配制
取出试剂盒，在室温下融化并振荡混匀后，低 速离心10秒。
计算需准备反应试剂反应数(n=样本数+2管对 照)。每反应体系配制如下：
反应液配制表(每反应)
反应液组份 RT-PCR反应液 酶混合液 甲型/乙型流感病毒检测液
总体积
加量(uL)/每反应 7.5 5 7.5
20
1孔阴参 1孔阳参
5ul核酸
20ul体系
倍比稀释（节省试剂）
3ul核酸
10ul体系
上机扩增
01
循环参数设定
步骤 1 逆转录
温度 50℃
2 预变性
95℃
3 变性
95℃
退火、延伸及 58℃
检测荧光
检测通道：FAM、VIC
时间 10min 5min 10s 30s
流感病毒及实验室检测
汇报人： 日期:
目录
• 流感病毒概述 • 流感病毒的实验室检测方法 • 实验室检测流程与规范 • 流感病毒的变异与进化 • 流感病毒的防治与未来展望 • 相关案例分析
01
流感病毒概述
Chapter
病毒类型与特点
流感病毒属于正粘病毒科，具有包膜、分节段和基因组 等特点。
根据病毒核蛋白和基质蛋白的不同，流感病毒可分为甲 、乙、丙三型，每型又根据病毒的抗原性不同分为若干 亚型。 流感病毒的遗传物质为RNA，具有高变异性，易引起病 毒株的变异和流行。
03
对于流感患者，应 及时隔离和治疗， 以减少病毒的传播 。
04
针对易感人群和高 危人群，可采取抗 病毒药物预防和治 疗。
02
流感病毒的实验室检测方法
Chapter
抗原检测
01
02
03
直接免疫荧光法
利用特异性抗体标记荧光 素，直接检测样本中的流 感病毒抗原。
间接免疫荧光法
将样本与特异性抗体结合 ，再与荧光素标记的抗抗 体结合，检测流感病毒抗 原。
规范操作
实验操作应严格按照实验室规范进行 ，防止因操作不当导致的病毒感染或 实验室事故。
04
流感病毒的变异与进化
Chapter
病毒变异类型与特点
抗原性变异
导致病毒的表面抗原结构发生变 化，从而产生新的病毒株。这种 变异是随机的、不定向的，并可 能导致病毒逃逸免疫系统的识别
和攻击。
宿主适应性变异
使病毒能够在不同的宿主环境中 生存和传播。这种变异通常涉及 到病毒的基因组中的多个位点， 并可能导致病毒对特定宿主产生
更强的致病性。
耐药性变异
使病毒对特定的抗病毒药物产生 抵抗力。这种变异通常是由于病 毒基因组中的突变积累所致，并 可能导致病毒对多种药物产生耐
流感病毒核酸检测作业指导书
流感病毒核酸检测作业指导书1 适用范围适用于鼻拭子、咽拭子、漱口液、鼻腔冲洗液、鼻腔吸取物、气管吸取物等样品中流感病毒的核酸PCR检测。
2 原理基于PCR原理进行的核酸检测。
3 仪器设备3.1 QIACube工作站3.2 ABI7500荧光定量PCR仪器3.3 核酸电泳仪3.4 离心机3.5 -20℃冰箱、-70℃冰箱、2~8℃冰箱3.6移液器（1-10µL，10-100µL，100-1000µL）4 试剂耗材4.1 QIAGEN核酸抽提试剂盒4.2 PCR试剂盒4.3 不同规格移液枪头4.4 1.5 mL Eppendorf 离心管5、操作步骤5.1 核酸提取5.1.1 使用QIAGEN手工抽提试剂盒进行核酸抽提5.1.1.1 试剂准备Carrier RNA试剂的准备：将310μL Buffer A VE加入到1管冻干的Carrier RNA（310μg）中，混合均匀，彻底溶解Carrier RNA；将溶解的Carrier RNA分装3~4小管，于-20℃冰箱保存。
临用时根据具体样品量进行Buffer A VL工作液的配置。
每管Carrier RNA反复冻融不得超过3次。
Buffer A VL工作液的配置：Buffer A VL原液保存于正常室温条件下，使用前观察有无结晶。
若有，可置于80℃温度下少于5min快速溶解后使用。
根据下列公式计算各成分含量进行Buffer A VL工作液的配置。
n × 0.56mL = y mL；y mL × 10µL/mL = z µLn表示本次试验所要抽提的总样品数，包括空白阴阳性对照数；y 表示计算所得要使用的Buffer A VL工作原液；z 表示计算所得要使用的含Carrier RNA的Buffer A VE（Carrier RNA-A VE）的量；下表列举出1-12个样品Buffer A VL工作液配制所要使用的Buffer A VL原液与Carrier RNA-A VE的量。
标准操作规程(SOP)H5N1 流感病毒ELISA 抗体检测方法的建立
本标准操作规程（SOP ）规定了H5N1流感病毒ELISA 抗体检测实验的程序和相应的操作。
本SOP 为规范实验操作、保证样本质量、操作安全而制定。
二、范围中国国家流感中心的所有技术人员使用ELISA 进行H5N1流感病毒抗体检测。
三、责任实验室操作人员严格按要求执行。
四、定义标本中的抗原或抗体、标记抗原或抗体按一定的次序与固相载体表面的抗体或抗原反应，并通过底物与酶的反应来反映标本中的抗原或抗体的量。
五、程序（一）生物安全要求检测疑似人高致病性禽流感病例和不明原因肺炎病人血清标本时，血清标本的灭活处理需要在BSL-3级实验室操作，操作人员需以BSL-3级防护。
血清灭活后的检测实验需在BSL-2级实验室操作，操作人员需以BSL-2级防护。
（二）材料1．设备和材料恒温水浴箱：长风 HHW21 微量振荡器：国华 ZW-A 酶标仪：Thermo MK3 洗板机：Thermo WellWashPlus 精确移液器：单通道可调 1－10μL 、20-200μL 、100-1000μL 12通道可调 20-200μL一、目的标准操作规程（SOP ）H5N1ELISA专用试剂槽2．试剂（1）抗原包被液：50mmol/L pH9.6的碳酸缓冲稀释液。
碳酸钠0.79g，碳酸氢钠1.46g，去离子水500mL。
注明配制时间，填写配制记录，配制好的抗原包被液保存在4ºC。
（2）抗原使用杆状病毒表达纯化的HA蛋白（购自 Proteinscience 公司）、有关的抗原应该使用每次监测时流行毒株表达的蛋白作为抗原。
（3）洗液：含0.05％Tween20 ( Sigma Cat# P3563 )PBS，（4）封闭液：2%脱脂奶。
2 mL脱脂奶加入至100mLPBS中。
注明配制时间，填写配制记录，配制好的封闭液保存在4ºC。
（5）样品稀释液：含1%BSA （ Gibco Cat＃15260）PBS（6）阳性对照血清： H5流感病毒阳性的人血清或羊血清（7）阴性对照血清：正常人群血清（8）酶标记物稀释液：含1%BSA PBS（9）辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG（sigma公司）使用浓度：1:6000 （10）TMB显色液：北京万泰公司（11）终止液：北京万泰公司（三）实验步骤1．洗板程序：自动洗板机上编程，为H5N1流感病毒抗体检测洗板程序。
流感病毒的快速检测方法样本
流感病毒的快速检测方法—......................................................................... R T-PCR丿快速诊断方法（-）生物安全要求（-）病毒核酸提取（三）RT-PCR（四）PCR产物纯化（五）流感病毒RT-PCR检测引物二 ............................. 免疫荧光方法检测流感病毒（-）原理（-）标本处理（三）间接免疫荧光法（四）结果判断三 ......... 实时荧光定量PCR（ Real-Time PCR）快速诊断检测（-）基本原理（二）实验试剂（三）实验步骤四 ....................................... 快速诊断试剂盒流感的快速检测方法，与传统的病毒分离鉴定相比具有快速、简便的特点。
因此常见于流感暴发时早期病原学检测用。
流感的快速诊断包括直接和间接免疫荧光法.ELISA、RT-PCR. Real-Time PCR 快速诊断速方法、流感快速诊断试剂盒等。
这里介绍RT-PCR.Real-Time PCR、免疫荧光快速诊断速诊断方法和几种流感快速诊断试剂盒优缺点。
无论那种快速诊断都无法代替传统的病毒分离鉴定方法。
一、RT-PCR快速诊断方法核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组的有力方法，即使基因组含量很低或死病毒也能够检测到。
本章将介绍检测流感病毒的聚合酶链式反应(PCR) o流感病毒的基因组杲负链RNA,在进行PCR扩增前必须合成与病毒RNA互补的DNA,即为cDNA o逆转录酶(RT)就是用于合成cDNA的多聚酶，因此，扩增流感病毒基因组的过程称为RT-PCR O RT-PCR需要一对型别特异引物，四种脱氧核昔酸(dNTPs), RNA 模板，逆转录酶及Taq DNA多聚酶;首先由逆转录酶将病毒的RNA 逆转录合成cDNA,然后再进行聚合酶链反应经25一30个循环，使DNA产物达到倍增的效果。
甲型流感病毒检测步骤
甲型流感病毒核酸检测步骤所用仪器与试剂盒：实时荧光定量PCR仪、Simply P总RNA提取试剂盒需要的配套设备和材料无菌无酶的1.5ml离心管无菌无酶的各种规格移液器吸头离心机（最大转速〉14000rpm）无酶无水乙醇操作步骤：1、样品预处理a）抗凝全血直接取全血（≤100μｌ）加等量的Solution R1，振荡混合30s，室温静置1min，放入1.5ml离心管中进行下一步。
b）白细胞全血取出后尽快离心（3000rpm×10min）吸取白膜层，或用红细胞裂解液／淋巴细胞分离获取白细胞进入下一步。
c）组织块取不大于30mg组织，于液氮中研磨，取出放入1.5ml离心管中进入下一步。
d）液体及其它液体样本（尿液，腹水，胸水，脑积液等）可以直接取样本100μｌ放入1.5ml离心管中进入下一步。
e）细菌取适量细菌培养液（最多2×10＾6个细菌），离心5000rpm×1min，弃去上清。
加入100μｌSolution R1，振荡混合30s，室温静置1min，进入下一步。
2、处理好的样品中，加入Solution R2 600μｌ充分振荡混匀，室温静置3-5min，此步骤不可离心，取上清时尽量避免吸到悬浮杂质，以避免下步离心时堵塞离心柱。
3、将上清液吸入Spin columns，Spin columns要套上离心管离心30s。
4、弃去外管中液体，向Spin columns中加入600μｌWash buffer，离心30s弃去接液管中液体，重复洗涤一次，然后空柱于10000rpm离心1min后将离心柱转移到一个新1.5ml 离心管。
5、将Spin columns移入新的1.5ml离心管中，在膜中央加入Elution Buffer 20-50μｌ，室温静置1min,离心30s，获得总RNA。
6、取适量PCR反应管，每管加入IV A PCR反应液A17ul、IVC PCR反应液B3ul。
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流感病毒核酸检测作业指导书
1 适用范围
适用于鼻拭子、咽拭子、漱口液、鼻腔冲洗液、鼻腔吸取物、气管吸取物等样品中流感病毒的核酸PCR检测。
2 原理
基于PCR原理进行的核酸检测。
3 仪器设备
3.1 QIACube工作站
3.2 ABI7500荧光定量PCR仪器
3.3 核酸电泳仪
3.4 离心机
3.5 -20℃冰箱、-70℃冰箱、2~8℃冰箱
3.6移液器（1-10µL，10-100µL，100-1000µL）
4 试剂耗材
4.1 QIAGEN核酸抽提试剂盒
4.2 PCR试剂盒
4.3 不同规格移液枪头
4.4 1.5 mL Eppendorf 离心管
5、操作步骤
5.1 核酸提取
5.1.1 使用QIAGEN手工抽提试剂盒进行核酸抽提
5.1.1.1 试剂准备
Carrier RNA试剂的准备：将310μL Buffer A VE加入到1管冻干的Carrier RNA（310μg）中，混合均匀，彻底溶解Carrier RNA；将溶解的Carrier RNA分装3~4小管，于-20℃冰箱保存。
临用时根据具体样品量进行Buffer A VL工作液的配置。
每管Carrier RNA反复冻融不得超过3次。
Buffer A VL工作液的配置：Buffer A VL原液保存于正常室温条件下，使用前观察有无结晶。
若有，可置于80℃温度下少于5min快速溶解后使用。
根据下列公式计算各成分含量进行Buffer A VL工作液的配置。
n × 0.56mL = y mL；
y mL × 10µL/mL = z µL
n表示本次试验所要抽提的总样品数，包括空白阴阳性对照数；
y 表示计算所得要使用的Buffer A VL工作原液；
z 表示计算所得要使用的含Carrier RNA的Buffer A VE（Carrier RNA-A VE）的量；
下表列举出1-12个样品Buffer A VL工作液配制所要使用的Buffer A VL原液与Carrier RNA-A VE的量。
含Carrier RNA的Buffer A VL工作液4℃保存48小时有效，使用前置37℃水浴让结晶溶解，并混匀。
Buffer AW1工作液：（按下表配制，配制好的工作液室温保存）
Buffer AW2工作液：（按下表配制，配制好的工作液室温保存）
说明：上述各表是根据目前所使用试剂配制所需的各成分含量，当试剂改进后需根据新的试剂说明书进行试剂的配制。
5.1.1.2核酸抽提
5.1.1.2.1取1.5mL离心管，加入560μL Buffer A VL工作液；
5.1.1.2.2分别加入140μL标本、阴性对照、临界阳性对照、强阳性对照，涡旋振荡混匀15秒；
5.1.1.2.3 室温放置10分钟，瞬间离心；
5.1.1.2.4 加入560μL浓度为100%乙醇，涡旋振荡混匀15秒，瞬间离心；
5.1.1.2.5 取630μL上述液体加入带有2 mL废液离心管的QIAamp离心柱，8000rmp离心1分钟；弃去滤液，换一个干净的废液收集管；
5.1.1.2.6 重复2.5；
5.1.1.2.7 打开QIAamp离心柱，加入500μL Buffer AW1工作液；
2.8 8000rmp离心1分钟，弃去滤液；
5.1.1.2.9打开QIAamp离心柱，加入500μL Buffer AW2工作液，14000rmp离心3分钟，弃去滤液；
5.1.1.2.10 将QIAamp离心柱放入一个2mL废液收集管，14000rmp离心1分钟；
5.1.1.2.11 将QIAamp离心柱放入一个1.5mL离心管，打开QIAamp离心柱，加入平衡至室温的A VE洗脱液60μL，室温放置1分钟，8000rmp离心1分钟。
离心后的液体即为抽提的RNA；
5.1.1.2.12 在离心管上标记编号，包括样品编号、样品性质、抽提日期；
5.1.1.2.13 标记好后置-70℃冰箱保存待用。
5.1.2使用QIACube工作站进行核酸抽提
5.1.2.1试剂准备
Carrier RNA试剂的准备：将310μL Buffer A VE加入到1管冻干的Carrier RNA（310μg）中，混合均匀，彻底溶解Carrier RNA；将溶解的Carrier RNA分装3~4小管，于-20℃冰箱保存。
临用时根据具体样品量进行Buffer A VE工作液的配置。
每管Carrier RNA反复冻融不得超过3次。
Buffer AW1工作液：（按下表配制，配制好的工作液室温保存）
Buffer AW2工作液：（按下表配制，配制好的工作液室温保存）
需要注意的是，使用QIACube工作站进行核酸抽提，Buffer A VL工作液使用原液，这是与QIAGEN手工抽提试剂盒进行核酸抽提时试剂配制的不同之处。
下表列出了2-12个样品（不能进行1或11个样品抽提）进行核酸抽提时部分试剂的配制量。
说明：上述各表是根据目前所使用试剂配制所需的各成分含量，当试剂改进后需根据新的试剂说明书进行试剂的配制。
5.1.2.2 试剂、耗材等的放置
5.1.2.2.1 各试剂的安放
根据仪器说明书的要求准备好试剂；
5.1.2.2.2 硅胶膜过滤柱及1.5mL Eppendorf管的安放
根据仪器说明书的要求准备好过滤柱与样品收集管；
5.1.2.2.3 样品的安放
根据仪器说明书的要求准备好样品；
5.1.2.2.4 离心吊篮的安放
根据仪器说明书的要求在指定位置安放好离心吊篮。
5.1.2.3 程序运行
根据仪器设备的液晶显示面板，选择RNA核酸抽提，抽提过程中不得随意打开仪器盖子，否则程序运行会终止。
如意外情况导致仪器设备程序运行被迫终止，可从终止时的步骤开始，继续根据手工试剂盒的抽提方法进行核酸抽提。
5.2 基因扩增
5.2.1 Real-time PCR
5.2.1.1 使用试剂盒QIAGEN Quantitect RT-PCR CAT No.204443
5.2.1.2 反应体系
5.2.1.3 循环参数
5.2.2 RT-PCR
5.2.2.1 反应体系
5.2.2.2 循环参数
说明：如使用其他符合要求的试剂盒，反应体系与循环参数的设定按试剂盒使用说明书进行。
5.3 检测结果分析
根据试剂盒使用说明书，基于PCR原理进行反应结果的分析。
6、技术依据
中华人民共和国卫生部标准WS285-2008《流行性感冒诊断标准》。