8.仪器分析 高效液相色谱法

2013-8-12
流动相：对于亲水性固定液，通常采用疏水性流
动相，即固定相的极性大于流动相的极性，称为
正相色谱；反之，固定相的极性小于流动相的极 性的称为反相色谱。 正相色谱适用于极性化合物的分离。其流出顺序是 极性小的先流出，极性大的后流出。 反相色谱适用于非极性化合物的分离，其流出顺序 与正相色谱恰好相反。
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液相色谱仪（2）
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液相色谱仪（3）
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三、高效液相色谱的流程及主要部件
process and main assembly of HPLC
1.流程图 动画演示
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2. 主要部件
高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和 数据处理系统；此外还有一些附属设备，如梯度洗 脱、自动进样装置。
分离及痕量分析。
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（二）流动相
由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲合力， 并参与固定相对组分的竞争，因此，正确选择流动相直接
影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：
（1）溶剂必须具有合适的极性和良好的选择性；能溶解
样品但不与样品发生反应或聚合。
（2）选用的溶剂与检测器匹配。
第二节 主要的分离类型和原理
main separating types and principle
第三节 影响分离的因素与操作条件选择
factors influenced separation and choice of operation condition
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第十章 高效液相色谱法
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一、高效液相色谱法的特点
feature of HPLC
特点：高压、高效、高速 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。
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（一）固定相
高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性
固体和硬胶两大类。
刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.0×108～109Pa的高 压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。 硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯 与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5×108Pa。
high performance liquid chromatography(HPLC)
第二节 主要分离类型和原理
main separation types and principle
一、液-固吸附色谱 liquid-solid adsorption chromatography 二、液-液分配色谱 liquid-liquid partition chromatography 三、离子对色谱 Ion pair chromatography 四、离子交换色谱 ion exchange chromatography 五、尺寸排斥色谱 size-exclusion chromatography 六、亲和色谱 Affinity chromatography



K K XY [Y ]水相

组分的保留值取决于组分离子和离子对试剂生成配合物的 平衡常数和反离子的浓度。 离子对色谱对一些生化试样，如核酸、核苷、儿茶酚胺类 物质具有良好的分离效果。尤其是可以借助离子对的生成 引入紫外吸收或荧光基团。
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(3) 分离系统
柱体为直型不锈钢管，内径2～6 mm，柱长 10～30 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以
提高柱效。
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(4) 检测系统
在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。 一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理 或化学特性有响应，比如紫外、荧光等检测器。 另一类是总体型检测器，它对试样和流动相总的 物理或化学性质有响应，比如示差折光，电导检 测器等。
3. 流动相
一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。在吸 附色谱中对极性大的试样往往采用极性强的洗脱 剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。 洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度参数（0 ） 来衡量。 0 越大，表示洗脱剂的极性越强。
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二、 液－液分配色谱
liquid-liquid partition chromatography 固定相与流动相均为液体（互不相溶）。
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2．分离原理
固定相为非极性键合相，流动相为水溶液，于流 动相中加入与待测离子X+相反电荷的离子Y-：
组分 流动相
X
Y
X Y
K XY

疏水性
K XY
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[ X Y ]有机相 [ X ]水相 [Y ]水相

X
组分
Y
流动相
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3. 正相键合相色谱法
固定相采用极性的有机基团，CN、NH2、双羟基 等键合在硅胶表面； 流动相采用非极性或极性小的溶剂（如烃类）中 加入适量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙醇等）。 它多用于分离异构体、中等极性的化合物，
此时，组分的分配比k值随其极性的增加而增大，
但随流动相极性的增加而降低。
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a. 紫外光度检测器 ultraviolet photometric detector 应用最广，对大部分有机化合物有响应。
灵敏度高，10-6 g/L； 流通池可做的很小（1mm × 10mm ，容积 8μL）； 对流动相的流速和温度变化不敏感；可用于梯度洗脱。
动画演示
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1. 基本原理：
利用组分在互不相溶的两相间的分配系数K的不 同，造成各组分的差速迁移而进行分离。
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2. 固定相和流动相
涂渍固定相：早期涂渍固定液，固定液易流失， 现在较少采用；
化学键合固定相：将不同基团通过化学反应键合
到硅胶（载体）表面的游离硅羟基上。 1. 疏水基团：如烷烃C8、C18和苯基等 2. 亲水基团：如氨基、氰基等
n
其中Kad为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂 上保留强，难于洗脱。Kad值小，则保留值弱，易
于洗脱，试样中各组分据此得以分离。
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2．固定相
极性： 由于硅胶的优点较多，如线性容量高，
机械性能好，不溶胀，与大多数试样不发生化
学反应等，因此，以硅胶用得最多。 非极性：活性炭。
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对强极性的有机酸和有机碱的分离？
将一种或多种与溶质离子电荷相反的离子加入到 流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏 水性的离子对化合物，从而控制溶质的保留行为
的一种色谱分离方法。
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1．固定相和流动相
固定相：正相键合固定相；反相键合固定相。
流动相：一般含有适当有机反离子的溶剂。 烷基铵盐离子对试剂，用于阴离子的分离； 烷基磺酸盐离子对试剂，用于阳离子的分离。
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固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全
多孔型固定相两类。
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1. 表面多孔型固定相
它的基体是实心玻璃球，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性 材料，如硅胶、氧化铝、分子筛等。这类固定相的多孔层 厚度薄、孔浅、柱子容量低，相对死体积小，出峰快。 2. 全多孔型固定相 由直径为3-10 m 的硅胶微粒凝聚而成。这类固定相由于 颗粒很细，传质速率快，柱效高。特别适合复杂混合物
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4．反相键合相色谱法
固定相是采用极性较小的键合固定相，如硅 胶－C18H37、硅胶－苯基等；
流动相是采用极性较强的溶剂，如甲醇、乙
睛－水、水和无机盐的缓冲溶液等。
反相键合色谱它多用于分离多环芳烃等低极性化 合物；反相键合相色谱法具有柱效高，能获得无 拖尾色谱峰的优点。
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除紫外检测器之外应用最多的检测器；通用型检测器（每 种物质具有不同的折光指数） ； 可连续检测参比池和样品
池中流动相的折光指数差值，差值与浓度呈正比。
灵敏度低、对温度敏感、
不能用于梯度洗脱；
偏转式、反射式两种类型
动画演示
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请选择内容
第一节 高效液相色谱的特点与仪器
feature and instrument of HPLC
第十章 高效液相色谱法
high performance liquid chromatography (HPLC)
第一节 高效液相色谱 的特点与仪器
feature and instrument of HPLC
一、HPLC的特点 feature of HPLC 二、高效液相色谱仪 instrument of HPLC 三、流程及主要部件 general process and main assembly of HPLC
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一、 液－固吸附色谱
liquid-solid absorption chromatography
1．分离原理
利用吸附剂作为固定相，根据吸附剂对样品中不 同组分产生不同的吸附能力以及流动相对吸附在 固定相上的样品组分具有不同的洗脱能力进行分
离的方法。
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当流动相流过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面
高压梯度洗脱: 内梯度 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的 比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。 低压梯度洗脱: 外梯度
一台高压泵，通过比例调节阀，将两种或多种不同极 性的溶剂按一定的比例抽入混合器中混合。
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(2) 进样系统
动画演示
通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图 所示：
Байду номын сангаас(1) 高压输液系统
（a）高压输液泵： 主要部件之一，压 力：150～350×105 Pa。