第八章 高效液相色谱法ppt课件
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高效液相色谱 PPT
(2)≡Si－C或Si一N共价键合固定相
制备反应如下
+ Si OH
SO Cl 2
HgBr
Si
Si Cl
NH 2 CH 2 NCH 2 H2
Si NH
CH 2 CHNH 2
共价键健合固定相不易水解,并且热稳定较硅酸 酯好。缺点就是格氏反应不方便;当使用水溶液时,必须 限制PH在4～8范围内。
(3)硅烷化(≡Si—O－Si－C)键合固定相 制备反应如下:
第3节 高效液相色谱得固定相和流动相
(－)固定相
高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类, 可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化硅 为基质,可承受高压,可制成直径、形状、孔隙度不同 得颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团,就就 是键合固定相,可扩大应用范围,她就是目前最广泛使 用得一种固定相。硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻 色谱中,她由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。固定 相按孔隙深度分类,可分为表面多孔型和全多孔型固 定相两类。
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交
12
3 分离系统——色谱柱
色谱柱就是液相色谱得心脏部件,她包括柱管 与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜 及内衬光滑得聚合材料得其她金属。玻璃管耐压有限, 故金属管用得较多。一般色谱柱长5～30cm,内径为 4～5mm,凝胶色谱柱内径3～12mm,制备往内径较大,可 达25mm 以上。
(三)液一固吸附色谱法(LSAC)
液一固吸附色谱就是以固体吸附剂作为固定 相,吸附剂通常就是些多孔得固体颗粒物质,在她们 得表面存在吸附中心。液固色谱实质就是根据物 质在固定相上得吸附作用不同来进行分离得。
1、分离原理
当流动相通过固定相(吸附剂)时,吸附剂表面得活性中 心就要吸附流动相分子。同时,当试样分子(X)被流动相带 入柱内,只要她们在固定相有一定程度得保留就要取代数目 相当得已被吸附得流动相溶剂分用)于就是,在固定相表面 发生竞争吸附:
制备反应如下
+ Si OH
SO Cl 2
HgBr
Si
Si Cl
NH 2 CH 2 NCH 2 H2
Si NH
CH 2 CHNH 2
共价键健合固定相不易水解,并且热稳定较硅酸 酯好。缺点就是格氏反应不方便;当使用水溶液时,必须 限制PH在4～8范围内。
(3)硅烷化(≡Si—O－Si－C)键合固定相 制备反应如下:
第3节 高效液相色谱得固定相和流动相
(－)固定相
高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类, 可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化硅 为基质,可承受高压,可制成直径、形状、孔隙度不同 得颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团,就就 是键合固定相,可扩大应用范围,她就是目前最广泛使 用得一种固定相。硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻 色谱中,她由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。固定 相按孔隙深度分类,可分为表面多孔型和全多孔型固 定相两类。
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交
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3 分离系统——色谱柱
色谱柱就是液相色谱得心脏部件,她包括柱管 与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜 及内衬光滑得聚合材料得其她金属。玻璃管耐压有限, 故金属管用得较多。一般色谱柱长5～30cm,内径为 4～5mm,凝胶色谱柱内径3～12mm,制备往内径较大,可 达25mm 以上。
(三)液一固吸附色谱法(LSAC)
液一固吸附色谱就是以固体吸附剂作为固定 相,吸附剂通常就是些多孔得固体颗粒物质,在她们 得表面存在吸附中心。液固色谱实质就是根据物 质在固定相上得吸附作用不同来进行分离得。
1、分离原理
当流动相通过固定相(吸附剂)时,吸附剂表面得活性中 心就要吸附流动相分子。同时,当试样分子(X)被流动相带 入柱内,只要她们在固定相有一定程度得保留就要取代数目 相当得已被吸附得流动相溶剂分用)于就是,在固定相表面 发生竞争吸附:
《高效液相色谱法》课件
– 分离机理：组分分子与流动相分子竞争吸附剂表面 活性中心
– 固定相：硅胶 – 流动相：底剂（烷烃）+ 极性调节剂
– 出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱
3.2 液液分配色谱法 – 分离机制：利用组分在两相中分配系数的差异 – 分类:
正相色谱 • 固定液极性 > 流动相极性 NPLC • 极性小的组分先出柱，极性大
➢ 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站 ➢ 检测器:
紫外检测器 荧光检测器 蒸发光散射检测器 其它检测器
• 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站 Agilent 1100紫外检测器工作原理
色谱－光谱图
波长(nm)
T/min
• 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站
WATERS
WATERS
– 分离机制：定向作用力、诱导作用力、或氢键作用 力的差别
– 固定相：极性大的氰基或氨基键合相 – 流动相：极性小的底剂（烷烃）+ 极性调节剂
– 流动相极性与k的关系： 流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓ 结构相近组分，极性大的组分后出柱
3.3 化学键合相色谱法 3.3.3 离子对色谱法（IPC，PIC）
– 适用范围：3.0≤pKa≤7.0 的弱酸 7.0≤pKa≤8.0 的弱碱
– 抑制剂: Biblioteka 酸（HAc）、弱碱（NH3·H2O）或缓冲液
4. 固定相
4.1 液-固色谱固定相 – 硅胶 无定形全多孔硅胶 球形全多孔硅胶
YWG YQG
– 高分子多孔微球
YSG
特点：柱选择性好，峰形好，柱效低
4.2 化学键合相 特点： – 不易流失；热稳定性好；化学性能稳定 – 载样量大；适于梯度洗脱
– 固定相：硅胶 – 流动相：底剂（烷烃）+ 极性调节剂
– 出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱
3.2 液液分配色谱法 – 分离机制：利用组分在两相中分配系数的差异 – 分类:
正相色谱 • 固定液极性 > 流动相极性 NPLC • 极性小的组分先出柱，极性大
➢ 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站 ➢ 检测器:
紫外检测器 荧光检测器 蒸发光散射检测器 其它检测器
• 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站 Agilent 1100紫外检测器工作原理
色谱－光谱图
波长(nm)
T/min
• 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站
WATERS
WATERS
– 分离机制：定向作用力、诱导作用力、或氢键作用 力的差别
– 固定相：极性大的氰基或氨基键合相 – 流动相：极性小的底剂（烷烃）+ 极性调节剂
– 流动相极性与k的关系： 流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓ 结构相近组分，极性大的组分后出柱
3.3 化学键合相色谱法 3.3.3 离子对色谱法（IPC，PIC）
– 适用范围：3.0≤pKa≤7.0 的弱酸 7.0≤pKa≤8.0 的弱碱
– 抑制剂: Biblioteka 酸（HAc）、弱碱（NH3·H2O）或缓冲液
4. 固定相
4.1 液-固色谱固定相 – 硅胶 无定形全多孔硅胶 球形全多孔硅胶
YWG YQG
– 高分子多孔微球
YSG
特点：柱选择性好，峰形好，柱效低
4.2 化学键合相 特点： – 不易流失；热稳定性好；化学性能稳定 – 载样量大；适于梯度洗脱
高效液相色谱法PPT课件
12
13
开机前的准备工作
1、将试验中要求的流动相配制好。 2、流动相要抽滤除气。 3、安装好试验要求的色谱柱。
14
15
正相色谱法
采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与 腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏 水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷）， 常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯 甲烷等以调节组分的保留时间。常用于 分离中等极性和极性较强的化合物(如酚 类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。
3、关上排液（或灌注）旋钮，逐渐将流 速升高。平衡至少30分钟后准备进样。
23
进样前准备——样品过滤
一次性注射器
样品瓶
针式（头）过滤器
24
仪器：手动进样器-六通阀/定量环
25
手动进样器工作原理
装填状态
样品注入
26
手动进样器
27
28
仪器：检测器
29
仪器：检测器-紫外
ＤＡＤ检测器 流路
UV/Vis双灯，全波长检测
6
色素 玻璃柱
石油醚
碳酸钙颗粒
俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906 年研究用碳酸钙分离植物色素时发现 的，色谱法(Chromatography)因之得 名。
7
色谱法的分离原理是：
溶于流动相中的各组分经过固定相时， 由于与固定相发生作用（吸附、分配、 离子吸引、排阻、亲和）的大小、强 弱不同，在固定相中滞留时间不同， 从而先后从固定相中流出。又称为色 层法、层析法。
8
色谱分离过程
流动相 Temporal
course
9
液相色谱理论发展简况
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃 管柱在室温和常压下用液位差输送流动 相，称为经典液相色谱法，此方法柱效 低、时间长（常有几个小时）。高效液 相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相 色谱法的基础上，于60年代后期引入了 气相色谱理论而迅速发展起来的。
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开机前的准备工作
1、将试验中要求的流动相配制好。 2、流动相要抽滤除气。 3、安装好试验要求的色谱柱。
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正相色谱法
采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与 腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏 水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷）， 常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯 甲烷等以调节组分的保留时间。常用于 分离中等极性和极性较强的化合物(如酚 类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。
3、关上排液（或灌注）旋钮，逐渐将流 速升高。平衡至少30分钟后准备进样。
23
进样前准备——样品过滤
一次性注射器
样品瓶
针式（头）过滤器
24
仪器：手动进样器-六通阀/定量环
25
手动进样器工作原理
装填状态
样品注入
26
手动进样器
27
28
仪器：检测器
29
仪器：检测器-紫外
ＤＡＤ检测器 流路
UV/Vis双灯，全波长检测
6
色素 玻璃柱
石油醚
碳酸钙颗粒
俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906 年研究用碳酸钙分离植物色素时发现 的，色谱法(Chromatography)因之得 名。
7
色谱法的分离原理是：
溶于流动相中的各组分经过固定相时， 由于与固定相发生作用（吸附、分配、 离子吸引、排阻、亲和）的大小、强 弱不同，在固定相中滞留时间不同， 从而先后从固定相中流出。又称为色 层法、层析法。
8
色谱分离过程
流动相 Temporal
course
9
液相色谱理论发展简况
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃 管柱在室温和常压下用液位差输送流动 相，称为经典液相色谱法，此方法柱效 低、时间长（常有几个小时）。高效液 相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相 色谱法的基础上，于60年代后期引入了 气相色谱理论而迅速发展起来的。
高效液相色谱法培训PPT课件
注意事项与常见问题解答
样品处理注意事项
01
避免样品污染、损失或变质，确保处理过程的准确性和可重复
性。
常见问题及解决方法
02
针对样品处理过程中可能出现的问题，如回收率低、干扰物质
多等，提供相应的解决方法。
安全与防护
03
注意有毒有害试剂的使用安全，做好个人防护和环境保护工作。
04 方法开发与优化策略
梯度洗脱程序设计思路
初始比例确定
根据待测组分的极性差异，选 择合适的初始流动相比例。
梯度斜率设置
根据组分的分离情况，调整梯 度斜率，使各组分在合适的保 留时间内洗脱出来。
梯度时间设置
确保梯度洗脱过程中，各组分 能够充分分离，同时避免过长 的分析时间。
梯度曲线类型
根据实际需求选择合适的梯度 曲线类型，如线性梯度、凹形
梯度或凸形梯度等。
方法验证内容及标准
精密度
准确度
通过添加回收率试验，验证方法 的准确度，确保测定结果可靠。
考察方法的重复性和中间精密度， 确保测定结果的稳定性。
线性范围
确定方法的线性范围，确保待测 组分浓度在该范围内时，测定结 果准确可靠。
专属性
考察方法对待测组分的选择性， 确保其他共存物质不干扰测定。
长期稳定性
考察样品在规定的储存条件下放置一定时间后的稳定性，以确定 样品的保质期和储存条件。
方法学考察
对分析方法本身进行稳定性考察，包括方法的耐用性、重复性和 中间精密度等指标的评估。
质量控制图绘制和应用
质量控制图绘制
根据长期稳定性考察数据，绘制质量控 制图，包括平均值、标准差和控制限等 指标。
VS
发展历程及应用领域
高效液相色谱ppt课件
缺点：使用了两台高压输 液泵，使仪器价格变得更 昂贵，故障率也相对较高， 而且只能实现二元梯度操 作。
精选课件
Tanghui.p2h3a.shzu
第二节 高效液相色谱仪器
四元低压梯度系统结构
只需一个高压泵，混合 就在泵前安装了一个比例 阀中完成。因比例阀是在 泵之前，所以是在常压 （低压）下混合，在常压 下混合易形成气泡，常配 置在线脱气装置，来自于 四种溶液瓶的四根输液管 分别与真空脱气装置的四 条流路相接，经脱气后进 入比例阀，混合后从一根 输出管进入泵体。
(2)GC采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即
不产生相互作用力，仅起运载作用。而HPLC中流动相
可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生
一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因
此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制
和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了
极大方便。
7
精选课件
Tanghui.ph7a.shzu
第二节 高效液相色谱仪器
一、流程（process of HPLC）
首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色 谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时， 流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分 离，然后依先后顺序进入 检测器，记录仪将检测器 送出的信号记录下来，由 此得到液相色谱图。
它是在经典液相色谱基础上，引入了气相 色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固 定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效 率高、灵敏度高、操作自动化的特点。为了更 好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方面 进行比较：
2
精选课件
Tanghui.ph2a.shzu
精选课件
Tanghui.p2h3a.shzu
第二节 高效液相色谱仪器
四元低压梯度系统结构
只需一个高压泵，混合 就在泵前安装了一个比例 阀中完成。因比例阀是在 泵之前，所以是在常压 （低压）下混合，在常压 下混合易形成气泡，常配 置在线脱气装置，来自于 四种溶液瓶的四根输液管 分别与真空脱气装置的四 条流路相接，经脱气后进 入比例阀，混合后从一根 输出管进入泵体。
(2)GC采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即
不产生相互作用力，仅起运载作用。而HPLC中流动相
可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生
一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因
此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制
和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了
极大方便。
7
精选课件
Tanghui.ph7a.shzu
第二节 高效液相色谱仪器
一、流程（process of HPLC）
首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色 谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时， 流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分 离，然后依先后顺序进入 检测器，记录仪将检测器 送出的信号记录下来，由 此得到液相色谱图。
它是在经典液相色谱基础上，引入了气相 色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固 定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效 率高、灵敏度高、操作自动化的特点。为了更 好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方面 进行比较：
2
精选课件
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第八节高效液相色谱
由于HPLC具有以上特点，所以70年代以来得到了迅速的发展。 一般认为，对于有机物的色谱分析，当其相对分子质量小、沸点 较低时，可用GC进行分析；当沸点较高(＞450 ℃)、不能气化或 热稳定性差者，可用HPLC分析；如果条件不允许，无法购置昂贵 的仪器时，可用TLC等经典液相色谱进行分析。
高效液相色谱系统
色谱柱： 也称固定相，是将色谱填料填充到色谱柱管中 所构成的。
柱体为直型不锈钢管，内径1-6 mm，柱长5-40 cm。发 展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
4.检测器：
用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化 的装置。
检测器利用溶质的某一物理或化学性质与流动相有差异的 原理，当溶质从色谱柱流出时，会导致流动相背景值发生变化， 从而在色谱图上以色谱峰的形式记录下来。
值。差值与浓度呈正比；
通用型检测器（ 每种物质具有不同的 折光指数）；
灵敏度低、对温 度敏感、不能用于梯 度洗脱；
偏转式、反射式 和干涉型三种；
示差折光检测器
荧光检测器是根据某些物质在紫外光照射下具有荧光 的特性来检测的，具有很高的灵敏度，适用于检测有ππ共轭体系的大分子及结构复杂的化合物，如蛋白质、氨 基酸、维生素、稠环芳烃等。有些无π-π共轭体系的分 子通过柱前衍生法引入荧光基团亦可用荧光检测器检测。
(1) 正相液液色谱法
流动相极性小于固定相的液-液色谱法称正相液-液色谱法。 洗脱时，极性小的组分先流出色谱柱，极性大的组分在固定相 中溶解度大，后流出色谱柱 。
原始的正相色谱以含水硅胶为固定相，以烷烃等为流动相， 由于固定液易流失，已被化学键合相色谱法取代。化学键合相 是将固定液用化学键键合在载体表面形成的固定相。正相色谱 常用的氰基键合相，性质与硅胶类似，只是保留时间略小。氨 基键合相的氨基为碱性，与硅胶的性质差异较大，常用于糖类 的分析。
高效液相色谱系统
色谱柱： 也称固定相，是将色谱填料填充到色谱柱管中 所构成的。
柱体为直型不锈钢管，内径1-6 mm，柱长5-40 cm。发 展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
4.检测器：
用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化 的装置。
检测器利用溶质的某一物理或化学性质与流动相有差异的 原理，当溶质从色谱柱流出时，会导致流动相背景值发生变化， 从而在色谱图上以色谱峰的形式记录下来。
值。差值与浓度呈正比；
通用型检测器（ 每种物质具有不同的 折光指数）；
灵敏度低、对温 度敏感、不能用于梯 度洗脱；
偏转式、反射式 和干涉型三种；
示差折光检测器
荧光检测器是根据某些物质在紫外光照射下具有荧光 的特性来检测的，具有很高的灵敏度，适用于检测有ππ共轭体系的大分子及结构复杂的化合物，如蛋白质、氨 基酸、维生素、稠环芳烃等。有些无π-π共轭体系的分 子通过柱前衍生法引入荧光基团亦可用荧光检测器检测。
(1) 正相液液色谱法
流动相极性小于固定相的液-液色谱法称正相液-液色谱法。 洗脱时，极性小的组分先流出色谱柱，极性大的组分在固定相 中溶解度大，后流出色谱柱 。
原始的正相色谱以含水硅胶为固定相，以烷烃等为流动相， 由于固定液易流失，已被化学键合相色谱法取代。化学键合相 是将固定液用化学键键合在载体表面形成的固定相。正相色谱 常用的氰基键合相，性质与硅胶类似，只是保留时间略小。氨 基键合相的氨基为碱性，与硅胶的性质差异较大，常用于糖类 的分析。
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第八章 高效液 相色谱法教学
第一节 液相色谱仪器
（high performance liquid chromatograph）
液相色谱仪（1）
液相色谱仪（2）
液相色谱仪（3）
液相色谱仪（4）
Agilent 1100系列高效液相色谱系统
二、高效液相色谱法的特点
（feature of HPLC）
2 分离原理 吸附剂一般为多孔性的物质，在它们
的表面存在着分散的吸附中心，溶质分子
和流动相分子在吸附剂表面的活性中心上
进行竞争，同时不同溶质之间和同一溶质
的不同官能团之间也存在竞争。竞争的综
合结果就是形成不同溶质在吸附剂表面吸
附、解吸平衡。
可表式为：
n S X + a d n S X + a d
(4) 高效分离柱 柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长
5～40 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高
柱效。
(5) 液相色谱检测器 a. 紫外检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。 特点： 灵敏度高； 线形范围高； 流通池可做的很小 （1mm ×10mm，容积8μL）； 对流动相的流速和温度变化不敏感； • 波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。
B 在大多数情况下 0 ， u
修正的速率方程：
H A Cu
提高柱效 途径
流动相流速对板高的影响
1)小颗粒填料，填充均匀； 2) 选择较低的流动相流速； 3) 选择粘度小的溶剂作流动相，改善传质。
§17-3 高效液相色谱分离方法
一(液-固)吸附色谱法
硅胶－强极性 氧化铝－弱极性 1. 固体吸附剂 活性炭－非极性 分子筛－强极性 高分子多孔微球(GDX)
示差折光检测器
d. 荧光检测器 （fluorescence detector）
高灵敏度、高选择性； 对多环芳烃，维生素B、 黄曲霉素、卟啉类化合 物、农药、药物、氨基 酸、甾类化合物等有响 应。
§17-2 基本理论
一 色谱柱柱效的基本关系式
t ' ' t r r n 5 . 54 16 eff W W 1 /2
氟碳化合物<饱和烃 <烯烃<芳烃<有机卤 化物<醚<硝基化合物<腈<叔胺<酯醛酮<
醇<伯胺<酰胺<羧酸<磺酸
各种不同极性的一元或
3 流动相(洗脱剂)
溶剂强度参数
。
多元溶剂。
溶剂分子在单位吸附剂表面上的 吸附自由能
越大，表明流动相溶剂分子对吸
[Xad][S]n Kad [X][Sad]n
Kad值越大，保留时间越长。
吸附色谱的分离机理
• 随着样品在固定 相上的吸附能力 由大到小 • 在色谱柱上的保 留由长到短
硅胶表面结构
硅胶表面结构经热处理发生的变化
缺 点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾。
极性吸附剂上有机化合物的保留顺序如下：
由于液体与气体性质的以下差异：
•溶质在液体中的扩散系数比它在气体中小 105倍左右
•液体粘度比气体约大102倍 •液体表面张力比气体大104倍左右
•液体密度比气体约大103倍
•液体不可压缩
因此，我们通常所说的高效
液相色谱，实际也是高压液 相色谱，因为没有很高的压
力就不可能产生很高的分离 效率。
三、流程及主要部件
一些常用溶剂的紫外截止波长
CS2 氯仿 四氢 苯 乙睛 甲醇 水 呋喃 187 210 190 205 紫外截 380 245 212 止波长 /nm 溶剂
b. 光电二极管阵列检测器
紫外检测器的重要进展；
光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各
检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图， 如图所示。
(2)梯度淋洗装置
外梯度: 利用两台高 压输液泵，将两种不同 极性的溶剂按一定的比 例送入梯度混合室，混 合后进入色谱柱。 内梯度: 一台高压泵 , 通过比例调节阀，将 两种或多种不同极性的 溶剂按一定的比例抽入 高压泵中混合。
(3) 进样装置
流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示：经Fra bibliotek液相柱 色谱装置
HPLC t分离：1 h
色谱分离
淋洗液
慢 中等 快
Temporal course
液相色谱以液体为流动相，固定相可以 是固体或液体（担载在固体表面），与 气相色谱比，带来一系列变化：
例如，填充柱气相色谱柱，一般填料的 尺寸为80-100目，粒度大约是2毫米， 而一般高效液相色谱的固定相粒度在2 －10微米，因此流动相通过这样一段固 定床时就产生了很高的反压。
2 2
H eff
L neff
二 分离度
2 ( t t ) n 1 eff r 2 r 1 R ( W W ) 4 1 2
三 速率方程
B H A Cu u
B 2 D M
溶质在液相流动相中
的扩散系数，约为气 相中扩散系数的万分 之一
光电二极管阵列检测器
c. 示差折光检测器 （differential refractive index detector）
除紫外检测器之外应用 最多的检测器； 可连续检测参比池和样品 池中流动相之间的折光指数差 值。差值与浓度呈正比； 通用型检测器（每种物质 具有不同的折光指数）；灵敏 度低、对温度敏感、不能用于 梯度洗脱；偏转式、反射式和 干涉型三种。
（process and main assembly of HPLC） 1.流程（动画）
2. 主要部件
(1) 高压输液泵 主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm）， 液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高 压、高速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特 性。
特点：高压、高效、高速、高沸点、热不稳定有机及生化试 样的高效分离分析方法。
高效液相色谱法与经典液相色谱法
例：分离20种氨基酸 经典柱色 谱 柱长：170 cm 柱径：0.9 cm F：30 mL/h t分离: >20 h 高效液相色谱仪 经典液相色谱 HPLC 150-200 μm 3-10 μm 固定相粒径 流动相驱动方式 重力或低压泵 高压泵 快(1-10mL/min) 流动相流速 很慢
第一节 液相色谱仪器
（high performance liquid chromatograph）
液相色谱仪（1）
液相色谱仪（2）
液相色谱仪（3）
液相色谱仪（4）
Agilent 1100系列高效液相色谱系统
二、高效液相色谱法的特点
（feature of HPLC）
2 分离原理 吸附剂一般为多孔性的物质，在它们
的表面存在着分散的吸附中心，溶质分子
和流动相分子在吸附剂表面的活性中心上
进行竞争，同时不同溶质之间和同一溶质
的不同官能团之间也存在竞争。竞争的综
合结果就是形成不同溶质在吸附剂表面吸
附、解吸平衡。
可表式为：
n S X + a d n S X + a d
(4) 高效分离柱 柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长
5～40 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高
柱效。
(5) 液相色谱检测器 a. 紫外检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。 特点： 灵敏度高； 线形范围高； 流通池可做的很小 （1mm ×10mm，容积8μL）； 对流动相的流速和温度变化不敏感； • 波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。
B 在大多数情况下 0 ， u
修正的速率方程：
H A Cu
提高柱效 途径
流动相流速对板高的影响
1)小颗粒填料，填充均匀； 2) 选择较低的流动相流速； 3) 选择粘度小的溶剂作流动相，改善传质。
§17-3 高效液相色谱分离方法
一(液-固)吸附色谱法
硅胶－强极性 氧化铝－弱极性 1. 固体吸附剂 活性炭－非极性 分子筛－强极性 高分子多孔微球(GDX)
示差折光检测器
d. 荧光检测器 （fluorescence detector）
高灵敏度、高选择性； 对多环芳烃，维生素B、 黄曲霉素、卟啉类化合 物、农药、药物、氨基 酸、甾类化合物等有响 应。
§17-2 基本理论
一 色谱柱柱效的基本关系式
t ' ' t r r n 5 . 54 16 eff W W 1 /2
氟碳化合物<饱和烃 <烯烃<芳烃<有机卤 化物<醚<硝基化合物<腈<叔胺<酯醛酮<
醇<伯胺<酰胺<羧酸<磺酸
各种不同极性的一元或
3 流动相(洗脱剂)
溶剂强度参数
。
多元溶剂。
溶剂分子在单位吸附剂表面上的 吸附自由能
越大，表明流动相溶剂分子对吸
[Xad][S]n Kad [X][Sad]n
Kad值越大，保留时间越长。
吸附色谱的分离机理
• 随着样品在固定 相上的吸附能力 由大到小 • 在色谱柱上的保 留由长到短
硅胶表面结构
硅胶表面结构经热处理发生的变化
缺 点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾。
极性吸附剂上有机化合物的保留顺序如下：
由于液体与气体性质的以下差异：
•溶质在液体中的扩散系数比它在气体中小 105倍左右
•液体粘度比气体约大102倍 •液体表面张力比气体大104倍左右
•液体密度比气体约大103倍
•液体不可压缩
因此，我们通常所说的高效
液相色谱，实际也是高压液 相色谱，因为没有很高的压
力就不可能产生很高的分离 效率。
三、流程及主要部件
一些常用溶剂的紫外截止波长
CS2 氯仿 四氢 苯 乙睛 甲醇 水 呋喃 187 210 190 205 紫外截 380 245 212 止波长 /nm 溶剂
b. 光电二极管阵列检测器
紫外检测器的重要进展；
光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各
检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图， 如图所示。
(2)梯度淋洗装置
外梯度: 利用两台高 压输液泵，将两种不同 极性的溶剂按一定的比 例送入梯度混合室，混 合后进入色谱柱。 内梯度: 一台高压泵 , 通过比例调节阀，将 两种或多种不同极性的 溶剂按一定的比例抽入 高压泵中混合。
(3) 进样装置
流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示：经Fra bibliotek液相柱 色谱装置
HPLC t分离：1 h
色谱分离
淋洗液
慢 中等 快
Temporal course
液相色谱以液体为流动相，固定相可以 是固体或液体（担载在固体表面），与 气相色谱比，带来一系列变化：
例如，填充柱气相色谱柱，一般填料的 尺寸为80-100目，粒度大约是2毫米， 而一般高效液相色谱的固定相粒度在2 －10微米，因此流动相通过这样一段固 定床时就产生了很高的反压。
2 2
H eff
L neff
二 分离度
2 ( t t ) n 1 eff r 2 r 1 R ( W W ) 4 1 2
三 速率方程
B H A Cu u
B 2 D M
溶质在液相流动相中
的扩散系数，约为气 相中扩散系数的万分 之一
光电二极管阵列检测器
c. 示差折光检测器 （differential refractive index detector）
除紫外检测器之外应用 最多的检测器； 可连续检测参比池和样品 池中流动相之间的折光指数差 值。差值与浓度呈正比； 通用型检测器（每种物质 具有不同的折光指数）；灵敏 度低、对温度敏感、不能用于 梯度洗脱；偏转式、反射式和 干涉型三种。
（process and main assembly of HPLC） 1.流程（动画）
2. 主要部件
(1) 高压输液泵 主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm）， 液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高 压、高速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特 性。
特点：高压、高效、高速、高沸点、热不稳定有机及生化试 样的高效分离分析方法。
高效液相色谱法与经典液相色谱法
例：分离20种氨基酸 经典柱色 谱 柱长：170 cm 柱径：0.9 cm F：30 mL/h t分离: >20 h 高效液相色谱仪 经典液相色谱 HPLC 150-200 μm 3-10 μm 固定相粒径 流动相驱动方式 重力或低压泵 高压泵 快(1-10mL/min) 流动相流速 很慢