消泡剂共存体系中泡沫分离蛋白质

2009 年 8 月 The Chinese Journal of Process Engineering Aug. 2009收稿日期：2009−02−27，修回日期：2009−04−29作者简介：徐钟河(1982−)，男，福建省沙县人，硕士研究生，生物化工专业；吴兆亮，通讯联系人，E-mail: zhaoliangwu@.消泡剂共存体系中泡沫分离蛋白质徐钟河， 吴兆亮， 赵艳丽(河北工业大学化工学院，天津 300130)摘 要：在以牛血清白蛋白(BSA)为目标蛋白、聚环氧丙烷环氧乙烷甘油醚(PGE)为消泡剂的模拟体系中，考察了表面活性剂种类(非离子型Tween-20和离子型SDBS)、浓度、溶液pH 及操作参数(气体流量、初始液池高度)对BSA 分离效率的影响. 结果表明，2种活性剂均能改善模拟体系的泡沫性能，使泡沫分离. 后者作用更强并能促进BSA 的吸附，因DBS −通过静电作用与带相反电荷的BSA 结合形成疏水性更强的BSA −DBS 复合物. pH 通过影响BSA 的电荷分布而影响其与SDBS 的结合，进而影响对BSA 的吸附，初始BSA 浓度0.1 g/L, PGE 4 mg/L, SDBS 50 mg/L, pH 为3.4时，约66%蛋白质浓缩在泡沫液中，富集比为5.34. 增加气速或初始液池高度可得到较高收率，但富集比减小. 关键词：蛋白质；消泡剂；泡沫分离；吸附；静电结合中图分类号：TQ028 文献标识码：A 文章编号：1009−606X(2009)04−0712−051 前 言泡沫分离技术作为一种高效、能耗低、设备简单的技术，现已广泛应用于多种具有表面活性的生物大分子如多肽、蛋白质及酶的分离研究[1−5]. 本实验室通过与康益公司合作，已成功将该技术应用于乳链菌肽的生产过程中，取得良好的分离效果. 然而在实际的生化应用中，往往因为发酵液中消泡剂的残存问题，使该技术多停留在实验室研发阶段，工业应用屈指可数.聚环氧丙烷环氧乙烷甘油醚(Polyoxypropylene Polyoxyethylene Glylerin Ether, PGE)作为一种消泡剂已广泛应用于发酵过程，凭借其较强的表面活性将蛋白从气泡表面脱附，而其本身又不形成坚固的液膜[6]，从而达到消泡的目的. 但这种消泡作用往往因起泡剂的竞争吸附和胶束的增溶作用而削弱[6]，使消泡剂存在的体系中进行泡沫分离操作成为可能. 然而起泡剂的加入也使混合体系中蛋白质的界面吸附行为变得复杂，甚至使蛋白变性. 以往的研究[7,8]发现，其在界面的吸附行为与共存的表面活性剂种类、浓度及溶液的pH 密切相关. 本工作以非离子型Tween-20和离子型SDBS(十二烷基苯磺酸钠)为消泡剂，探讨在不同pH 下其对牛血清白蛋白的富集比和回收率，并考察了操作参数对分离的影响. 此探索将有助于为拓宽泡沫分离技术在生化产业中的应用提供参考依据，同时也为以大分子蛋白质/消泡剂/小分子起泡剂三元表面分子形成的混合体系中蛋白质的吸附行为研究提供借鉴作用.2 实 验2.1 材料牛血清白蛋白(BSA ，纯度99%，天津联星生物技术有限公司)，BCA 蛋白质定量试剂盒(北京盖宁生物科技公司)，十二烷基苯磺酸钠(SDBS)、消泡剂PGE 均为工业品(天津乐泰化工有限公司)，Tween-20(化学纯，上海精析化工科技有限公司)，乙酸、乙酸钠、氯化钠均为分析纯(天津赢达稀贵化学试剂公司)，转子流量计(沈阳市北星仪表厂)，AC0-318电磁式空气压缩机(广东海利集团有限公司). 2.2 泡沫分离塔装置泡沫分离塔自制(图1)，塔体为有机玻璃管，管外标刻度，塔高90 cm ，内径3 cm ，塔底装有烧结玻璃制成的气体分布板，孔径30∼50 µm. 通过导管与气体缓冲瓶、流量计和空气压缩机相连.图1 泡沫分离装置图Fig.1 Schematic diagram of the foam fractionation system2.3 泡沫性能测试方法采用气流法评价PGE 添加量对BSA 泡沫衰变的影响，实验在常温下进行. 向泡沫分离塔中注入一定量待测液使初始液池高度为35 cm ，通过空气压缩机鼓入气1. Foam fractionation tower2. Distributor3. Foam collector4. Outlet5. Rotameter6. Surge generator7. Humidifier8. Air pump体，气体依次经过加湿瓶、缓冲瓶等鼓入塔内，通过气体流量计将气速控制在100 mL/min ，通气时间为120 s.以泡沫高度H f 及泡沫高度衰减至一半所需的时间(泡沫半衰期t 1/2)分别表征溶液的起泡性和泡沫的稳定性. 待测液由pH 4.6(BSA 等电点)的0.2 mol/L 乙酸/乙酸钠缓冲溶液配制，BSA 浓度100 mg/L. 2.4 分离实验方法及过程模拟溶液BSA 浓度为100 mg/L ，PGE 4 mg/L ，NaCl 0.06 mol /L ，通过改变表面活性剂浓度和溶液pH 、调节气体流量及初始液池高度进行实验. 泡沫从塔顶导出，至泡沫无法鼓出塔顶时实验结束. 每组实验重复3次，分析收集到的泡沫液和塔底残余液，计算蛋白质富集比E (泡沫液与初始液中的BSA 浓度比)及收率R (相应的质量百分比). 2.5 蛋白质的检测蛋白质采用BCA 法[9]检测，根据蛋白质浓度与吸光度关系制作标准工作曲线，线性拟合方程为C = 0.667A −0.035，其中C 为蛋白质浓度(mg/mL)，A 为吸光值，蛋白质检测范围为0.02∼0.2 mg/mL.3 结果与讨论3.1 PGE 对溶液泡沫性能的影响起泡性是泡沫稳定性的先决条件，而稳定性又作用于起泡性. 决定泡沫稳定性的关键因素是液膜的强度，而液膜的强度主要取决于表面吸附膜的坚固性，后者又主要由起泡分子在其表面单分子层内的排列紧密程度决定[10]. PGE 以较高的表面活性将BSA 从膜上替换下来，减少BSA 在界面的吸附量，破坏了BSA 吸附膜的完整性和连通性，阻碍了蛋白质分子间的相互作用，膜的修复效应减弱，泡沫稳定性降低；而PGE 分子间缺乏必要的相互作用，无法形成一定强度的膜，从而降低图2 PGE 浓度对起泡性及泡沫稳定性的影响Fig.2 Foam capacity and stability as function of PGE concentration 了泡沫的膜弹性，液膜的气体扩散加快，排液和破裂加剧，从而无法起泡. 其影响如图2所示，随着PGE 含量加大，体系的泡沫高度H f 和半衰期t 1/2均迅速下降，当C PGE 为1 mg/L 时，t 1/2衰变趋于平缓，而H f 的变化相对缓和，当C PGE 增加到4 mg/L 时，H f 几乎不再下降. 以下的分离实验均取PGE 浓度为4 mg/L. 3.2 Tween-20/BSA/PGE 混合体系泡沫分离自然状态下蛋白质总是倾向于将疏水残基包埋在分子内部，而将亲水的残基分布在分子表面，因而其表面疏水区较少，表面吸附效率较低. 与蛋白质相比，小分子量的表面活性剂能更有效地降低界面张力，并以更快的速率吸附在界面上. 当两者在溶液中共存时，混合体系的界面组成或泡沫行为不仅依赖于表面活性剂的活性和蛋白质浓度，而且还与两者间的相互作用有关[7,8]，其相互作用的驱动力主要来自静电荷相互作用、疏水相互作用及氢键力，通常状态下后两者的作用力较弱.由于竞争效应，加入Tween-20抑制了PGE 的吸附行为，同时伴随着胶束加溶作用的增强，两者共同作用使体系去消泡作用增强，排液减缓，泡沫变得稳定，泡沫分离得以进行. 但由于小分子量的Tween-20比大分子量的蛋白质能更有效降低界面自由能及在液膜上有更紧密的排列密度，在高浓度Tween-20作用下蛋白质从界面上被置换出而释放到主体相[7,8]，因此造成BSA 收率随泡沫液增加而增加的同时，其富集比却迅速降低，接近1，即此刻蛋白在气液界面上的过剩吸附浓度为0，丧失分离浓缩的意义. 而Tween-20分子的烷基链与蛋白质分子表面疏水残基间的较弱疏水结合(增强蛋白的亲水性)可能也是导致蛋白质从界面上脱附的原因之一，虽然这种作用较弱. 图3很好地反映了小分子起泡剂对大分子蛋白质的置换作用.图3 Tween-20浓度对富集比及收率的影响Fig.3 Enrichment ratio and recovery rate as functionof Tween-20 concentration3691215182106121824303642Concentration of PGE, C PGE (mg/L)F o a m c a p a c i t y , H f (c m )250500750100012501500F o a m s t a b i l i t y , t 1/2 (s )1002003004005006001.001.051.101.151.20Concentration of Tween-20, C tween-20 (mg/L)E n r i c h m e n t r a t i o , E10203040R e c o v e r y r a t e , R (%)对于不带电荷的Tween-20及PGE(无法形成稳定泡沫)，pH 的变化对其表面活性的影响可以忽略，但对于混合体系中具有表面活性的两性电解物质蛋白质，pH 是影响其在界面吸附的重要因素. 如图4所示，当溶液pH 偏离蛋白质等电点时，其富集比和回收率均有所降低，且二者的变化趋势一致. 这是因为当pH 偏离蛋白质等电点时，蛋白质分子表面重新带电，分子间斥力加大，疏水性减弱[15]，降低了其在混合吸附膜上的吸附量，从而使E 和R 减小，这与文献[7]的观点也是一致的.图4 以Tween-20为表面活性剂pH 对收率及富集比的影响 Fig.4 Enrichment ratio and recovery rate as function of pH withTween-20 as surfactant3.3 SDBS/BSA/PGE 混合体系泡沫分离尽管表面活性较弱、扩散系数较低的大分子量蛋白质无法像小分子量表面活性剂(如SDBS 和Tween)那样迅速有效吸附在界面上，但蛋白质一旦在液膜上吸附即可通过相邻分子间共价二硫交联和非共价(氢键、范德华力及疏水作用力)的相互作用在气泡表面形成连续的粘弹性膜，蛋白分子表面丰富的亲水残基(主要指不带电荷)的水化作用产生较高的表面粘度，可对抗液膜的排液和破裂，从而具有较好的泡沫稳定性，这些特性是小分子量表面活性剂[11]不具备的.与非离子型Tween-20不同，在合适条件下，离子型表面活性剂SDBS 可通过静电作用与BSA 结合成疏水性更强的BSA −DBS 复合物[12,13]，该复合物同时兼具有蛋白质大分子的特性，产生很好的互补效应，使之不易被消泡剂PGE 脱附，足以在PGE 存在的混合体系中产生坚固的泡沫液膜，从而促进蛋白的泡沫吸附. 而这种互补效应是不带电荷的Tween-20所不具备的，由于缺少必要的相互作用力，当较低浓度的自由Tween-20分子在PGE 和BSA 形成的混合液膜上吸附时，其不但不能增强BSA 的吸附，反而阻碍了液膜上BSA 分子间的相互交联作用，使蛋白质液膜易滑动；同样，由于大分子BSA 的位阻效应，也阻碍小分子起泡剂Tween-20在界面上的横向迁移速率，即抑制了Gibbs −Marangoni 修复效应，加上PGE 造成膜的粘弹性下降，直至浓度增大的Tween-20在竞争作用下将PGE 和BSA 从液膜上替换下来，体系的泡沫性能才有所加强[14,15]，而这也正是造成Tween-20/BSA/PGE 体系泡沫分离效率较低的主要原因.图5为不同SDBS 浓度下蛋白质的泡沫分离效率. 随着SDBS 浓度增大，复合物表面疏水基团(疏水尾基)增多，表面活性增大，与PGE 竞争吸附的能力增强，富集比和回收率均随其在界面吸附量的增加而提高. 但当富集比增加到一极值后迅速降低，而收率仍持续增加. 这是因为随着复合物在界面吸附量增加，分子间交联作用加强，泡沫变得稳定，泡沫层持液量增加稀释了泡沫液中蛋白质的浓度. 但当收率增加到一定程度时，蛋白质分子表面可供DBS −静电结合的位点趋于饱和，SDBS 开始与蛋白质发生疏水作用；同时在SDBS 的诱导下，BSA 分子的折叠结构被打开，结构变松散，暴露出更多可供结合的原先包埋在分子内部的疏水基团. SDBS 通过疏水作用与蛋白质结合，使其表面负电荷密度增大[12,13] (与SDS −PAGE 电泳中SDS 的作用类似)，复合物的疏水性减弱，对界面的亲和性下降，此时溶液中游离的吸附活性更高的SDBS 将与复合物竞争气液界面，将蛋白质从界面上脱附，收率回落.图5 SDBS 浓度对收率及富集比的影响Fig.5 Enrichment ratio and recovery rate asfunction of SDBS concentration与SDBS 不同的是，蛋白质分子表面电荷分布是随pH 变化的. 溶液的酸化能加快蛋白质表面碱性氨基酸残基(Arg, His, Lys)的质子化程度，使蛋白质易与带负电荷的DBS −通过静电结合形成疏水性更强的复合物，从而有利于蛋白质回收与富集. 蛋白质分离效率与溶液3.03.54.0 4.55.0 5.56.01.061.081.101.121.141.16pHE n r i c h m e n t r a t i o , E8101214R e c o v e r y r a t e , R (%)20304050607080901003.03.54.04.55.05.5Concentration of SDBS, C SDBS (g/L)E n r i c h m e n t r a t i o , E304050607080R e c o v e r y r a t e , R (%)pH 的关系如图6所示，分离效率随着pH 的降低而提高，但当溶液pH 降至一定程度后蛋白质的分离效率反而下降，这可能是由以下两方面原因引起的：一方面，随着蛋白质表面碱性残基离子化趋于稳定，酸的加入将使溶液的介电常数增大，由库仑定律可知，介电常数增加将弱化相反电荷的吸引力. 同时，溶液中H +浓度增大还将增加其与蛋白质竞争结合DBS −的几率；另一方面，溶液过于酸化导致复合物构象转变也可能对其在液膜上的吸附造成不利影响.图6 以SDBS 为表面活性剂pH 对收率及富集比的影响 Fig.6 Enrichment ratio and recovery rate as function ofpH with SDBS as surfactant3.4 操作参数对蛋白质泡沫分离的影响根据传统的泡沫分离理论可将分离过程分为2个阶段：(1) 液池中气泡在上升过程中目标物质在气泡表面的吸附；(2) 泡沫层中的泡沫在气流推动下上升的过程中，液膜通过普拉特边界向下排液，使液膜变薄，目标物质浓缩[4]. 按照该理论，液池中目标物质在泡沫表面的吸附及泡沫层中液膜的排液将最终决定目标物质的分离效率. 在间歇式泡沫分离过程中，对于特定泡沫分离塔及确定组分的待分离溶液，分离效率主要是由气速和初始液池高度决定的. 实验以SDBS/BSA/PGE 混合体系为例，分别探讨气速和液池高度对蛋白质分离效率的影响.图7为混合体系在不同气速下蛋白质的分离效率. 当气速较小时，泡沫在塔中的停留时间较长，蛋白质在泡沫界面吸附时间较长，可提高其在泡沫表面的吸附密度. 由于泡沫在非连续相的上升速度较小，液膜的排液也较充分，因而蛋白质富集比较高，但因泡沫的排液与聚变加强使到达塔顶的泡沫减少，收率较低. 随着气速的增加，蛋白质收率迅速增加，当气速增大至一定值后，蛋白质在连续相中与气泡表面的接触时间明显减小，传质效率恶化，使收率增速减缓.图7 气速对收率及富集比的影响Fig.7 Enrichment ratio and recovery rate asfunction of gas flow rate液池高度对泡沫分离效率的影响见图8. 随着初始液池高度的增大，收率呈增加趋势，而富集比则降低. H L 增加延长了气泡在液池中的停留时间，有助于提高气泡液膜表面蛋白质吸附密度，使其在膜上的作用增强，泡沫变得稳定；此外，由于泡沫层高度是液池高度的单调递减函数，初始液池高度增加将进一步减缓泡沫液膜排液，使回收的泡沫液增加，收率提高，而富集率降低. 这与增加气速的结果是类似的.图8 初始液池高度对收率及富集比的影响Fig.8 Enrichment ratio and recovery rate as functionof initial height of liquid pool4 结 论非离子型表面活性剂Tween-20与离子型表面活性剂SDBS 均可使含消泡剂的BSA 混合体系泡沫性能提高，但SDBS 的稳泡性能和分离效率更强.阴离子型SDBS 通过与BSA 静电结合形成疏水性更强的BSA −DBS 复合物，提高了蛋白质的分离效率，但过多的SDBS 反而使其亲水性增强，分离效率下降.增大气速或增加初始液池高度均有助于提高BSA3.03.54.04.55.05.56.01.01.52.02.53.03.54.04.55.05.5pHE n r i c h m e n t r a t i o , E203040506070R e c o v e r y r a t e , R (%)60801001201401602.02.53.03.54.04.55.05.56.06.5Gas flow rate, G (mL/min)E n r i c h m e n t r a t i o , E30405060708090R e c o v e r y r a t e , R (%)203040503.03.54.04.55.05.56.06.5Height of initial liquid pool, H L (cm)E n r i c h m e n t r a t i o , E2030405060708090R e c o v e r y r a t e , R (%)的收率，但富集比减小.溶液pH 3.4，SDBS浓度50 mg/L时，蛋白质富集比为5.34，收率为66%. 消泡剂PGE存在的溶液中，离子型表面活性剂SDBS对蛋白质泡沫的分离效果较好，有望为消泡剂存在的发酵液中生物大分子的浓缩分离开辟一条新途径.参考文献：[1] Sarkar P, Bhatacharya P, Mukherjea R N. 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The results revealed that nonionic surfactant Tween-20 and ionic SDBS could enhance the system foam capacity and stability, so that the foam process could be operated, while the latter exhibited higher performance and prompted protein adsorption efficiently on the condition the negative charge DBS− attached to BSA with opposite charge via electrostatic force to form a more hydrophobic complex DBS−BSA. And, pH had a strong influence on protein adsorption by affecting the bonding between SDBS and BSA, since the charge distribution of protein molecule surface varied with pH. About 66% of BSA was concentrated in the foamate and the enrichment ratio was 5.34 with initial BSA concentration 0.1 g/L, PGE 4 mg/L, SDBS 50 mg/L, and pH 3.4. A higher BSA recovery rate could be obtained by increasing G or H L, but the enrichment reduced.Key words: protein; antifoam agent; foam fractionation; adsorption; electrostatic force。