人正常胃黏膜细胞全长cDNA文库的构建及鉴定
构建cDNA文库
用被感染的蝗虫体液构建昆虫病原菌——绿僵菌的cDNA文库的方法摘要为了克隆在宿主中表达的真菌的基因，形成了构建被感染昆虫致病真菌的cDNA文库的方法。
这种方法根据病原菌的细胞结构和组成部分与宿主细胞的结构和组成部分存在明显的差别这个优势来设计的。
宿主体液细胞只含细胞膜，很容易被SDS/PK（蛋白激酶）降解掉，而真菌有细胞壁，能够保护细胞不被SDS/PK降解。
利用这种方法体液细胞被SDS/PK降解后释放出的动物的DNA和RNA然后进一步地被DNA 酶和RNA酶彻底分解。
因此，得到的生长在昆虫体液里的真菌不会被宿主的DNA和RNA 污染。
从被感染的体液里得到的纯化的真菌可以用来提取mRNA和构建cDNA文库。
用PCR和RT—PCR证实了真菌的mRNA的纯度，分别用宿主的特异性引物对和真菌的特异引物对，并且分析了用真菌构建的cDNA文库的克隆。
结果表明，真菌mRNA中没有发现真菌污染物DNA或RNA的存在。
从cDNA文库中随机选择cDNA克隆体用BlastX进行序列分析，没有发现与昆虫序列有显著相似的序列存在。
这个结果进一步证实了从宿主动物中纯化致病性真菌的方法是可靠的，从真菌中提取的mRNA适合于构建cDNA 文库和其他一些分子分析包括RT—PCR。
这个方法适用于其它一些致病性真菌和它们的宿主动物的研究。
关键词致病真菌，昆虫，mRNA提取，cDNA文库说明近年来，有很多关于致病性真菌如何通过昆虫表面侵染昆虫的报道，并且已基本弄明白了它的侵染机制。
然而很少有关于昆虫病原菌如何克服昆虫防御机制甚至进入后杀死昆虫的这方面知识的报道。
因此，分析昆虫宿主中真菌基因的表达有利于探索其发病机制。
目前，为了阐明真菌感染的机制，有好几种用来分析真菌基因体内表达的方法。
其中一种是构建三种cDNA文库（包括宿主和真菌混合的cDNA文库、健康宿主的cDNA 文库、真菌的cDNA文库），之后分析三种文库去寻找真菌侵染后表达的基因。
花生果皮全长cDNA文库的构建及初步分析
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cDNA文库构建的具体步骤及详细说明
cDNA文库构建的具体步骤及详细说明cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA 经反转录形成的cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。
经典cDNA 文库构建的基本原理是用Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。
其基本步骤包括：（1）mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA 文库的关键步骤之一。
（2）cDNA第一条链的合成。
（3）cDNA第二条链的合成。
（4）双链cDNA的修饰。
（5）双链cDNA的分子克隆。
（6）cDNA文库的扩增。
（7）cDNA文库鉴定评价。
一、Superscipt II—RT合成第一链1. 在一RNase-free的0.2 ml PCR管中加入x ul mRNA(大约500 ng) 、1 ul Xho I Primer(1.4 ug/ul)(5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)、11-x ul RNase-free water（大于500 ng mRNA 分n管(500 ng/tube)合成第一链，第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成。
）。
2. 混匀后，70℃反应10分钟。
3. 反应完成后，立刻将反应体系置于冰上5 min。
4. 稍微离心一下，顺序加入以下试剂：（1）4 ul 5×first strand buffer（2）2 ul 0.1 M DTT（3）1 ul 10 mM dNTP(自己配制)5. 混匀，稍微离心反应物之后，42℃放置2分钟。
6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT，混匀。
7. 42℃反应50分钟，然后70℃，15分钟灭活反转录酶。
二、cDNA第二链的合成1. 第一链反应完成后，取2ul一链产物-20℃冰箱中保存，待电泳检测。
铁皮石斛均一化全长cDNA文库的构建与序列分析
铁皮石斛均一化全长cDNA文库的构建与序列分析目的：为了获得药用植物铁皮石斛功能基因的信息和筛选功能基因。
方法：以SMART（switching mechanism at 5′ end of RNA transcript）方式合成全长cDNA，结合DSN（duplex-specific nuclease）均一化技术，构建铁皮石斛茎组织的均一化全长cDNA 文库。
结果：该文库重组率为93.9%，文库滴度1.3×106 cfu·mL-1，插入片段平均大小1.5 kb 左右。
随机挑取163个阳性克隆进行单侧测序，通过生物信息学分析，获得150个单一序列，其中147个序列与相应的同源蛋白匹配，GO（gene ontology）分类表明这些序列参与各种生化途径。
8个序列包含了完整编码框，可判断为全长基因。
结论：成功构建了铁皮石斛茎组织均一化全长cDNA 文库，为满足铁皮石斛代谢途径等功能基因筛选和基因信息研究奠定了基础。
标签：铁皮石斛；均一化；cDNA 文库；序列分析铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo是兰科Orchidaceae石斛属多年生草本植物，具有独特的药用价值，为我国名贵中药材。
铁皮石斛以其茎入药，其主要药用成分是石斛多糖、石斛碱、石斛次碱及多种氨基酸及微量元素，有生津益胃、清热养阴及增强人体免疫活性等功效，主要分布于我国云南、广西、浙江、安徽、福建、四川等省区[1]。
铁皮石斛种子小无胚乳，自身繁殖力低，在自然条件下需与某些真菌共生才能萌发，加上人为的过度采挖，其自然资源濒临枯竭[2]。
近些年铁皮石斛的组织培养与栽培管理技术的突破性发展[3]，使得人工栽培铁皮石斛逐渐成为一个新兴产业。
由于对天然药物需求的不断增加，解决药物资源匮乏问题一直存在，从20世纪90 年代开始，药用植物功能基因的克隆呈现发展势头[4]。
通过确定药用植物的功能基因，发展药用植物的基因工程，获取药用植物的药用成分，这些都依赖药用植物的功能基因研究开发。
第五章_cDNA文库的构建
3’
第二链合成
• 剩下的cDNA单链的3’末端可能形成一个弯回来的 双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条 cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA。
5’
cDNA第一链 DNA聚合酶 cDNA第二链合成 cDNA第一链 cDNA第二链
5’ 3’
• 用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA 中有用的序列被切掉）。
•λZapcDNA 载体
• 优点：
1、高的转染效率
2、可在体内用M13辅助噬菌体将其变为真核生物的 质粒表达载体。
• 含有一个真核启动子
•λZapcDNA 载杂交 1、已知氨基酸序列的相关简并密码子探针； 2、纯化蛋白质的相应抗体探针；
5’ 3’
cDNA第一链 cDNA第二链 核酸酶S1
5’ 3’
cDNA第一链 cDNA第二链
3’ 5’
cDNA 合成
缺点：合成 效率低;〈1% mRNA能合 成cDNA。
• 改进
• RNase H酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，
并将其降解成许多小片断。 • 小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成冈崎 片断。 • DNA聚合酶I能除去引物并修补后再使用DNA连接酶
基本原理：
• 许多真核生物的转录激活因子都是由两个结构上
可以分开的、功能上相互独立的结构域组成； • 应用重组DNA技术，可以将来自同一个转录因子的、 或者两种不同转录因子的结构域分开，分开的两 种结构域在体内重新组装成具有功能的转录因子，
从而激活UAS（上游激活序列）下游启动子调节的
报告基因的表达。
通常由以下原因造成:
• prey蛋白的非特异性结合；
• 无需与诱饵蛋白结合就能诱导报告基因的转录。
cDNA文库构建
cDNA文库构建cDNA文库[原理]：cDNA文库不同于基因组文库，被克隆DNA是从mRNA反转录来源的DNA。
CDNA组成特点是其中不含有内含子和其他调控序列。
从而做cDNA克隆时应是先从获得mRNA开始，在此基础上，通过反转录酶作用产生一条与mRNA相互补的DNA链，然后除掉mRNA，以第一条DNA链为模板复制出第二条DNA链（双链）；再进一步把此双链插入原核或真核载体。
cDNA文库的构建分为六个阶段：阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链阶段2：cDNA第二链的合成阶段3：cDNA的甲基化阶段4：接头或衔接子的连接阶段5：SepharoseCL-4B凝胶过滤法分离cDNA阶段6：cDNA与λ噬菌体臂的连接[阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链]1．在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行cDNA 第一链的合成：poly(A)+RNA(1μg/μl)10μl寡核苷酸引物(1μg/μl)1μl1mol/LTris-HCl(pH8.0,37℃) 2.5μl1mol/LKCl 3.5μl250mmol/LMgCl22μldNTP溶液（含4种dNTP，每种5mmol/L）10μl0.1mol/LDTT2μlRNase抑制剂（选用）25单位加H2O至48μl2．当所有反应组在0℃混合后，取出2.5μl反应液转移到另一个0.5ml微量离心管内。
在这个小规模反应管中加入0.1μl[α-32P]dCTP（400Ci/mmol,10mCi/ml）。
3．大规模和小规模反应管都在37℃温育1h。
4．温育接近结束时，在含有同位素的小规模反应管中加入1μl0.25mol/LEDTA，然后将反应管转移到冰上。
大规模反应管则在70℃温育10min，然后转移至冰上。
5．参考《分子克隆实验指南》第三版附录8所述方法，测定0.5μl小规模反应物中放射性总活度和可被三氯乙酸（TCA）沉淀的放射性活度。
此外，用合适的DNA分子质量参照物通过碱性琼脂糖凝胶电泳对小规模反应产物进行分析是值得的。
人卵巢癌cDNA噬菌体表达文库的构建及鉴定
cDNA文库的构建方法与原理
c D N A文库的构建方法与原理蛋白质是细胞的功能分子：它们构成结构和调控分子，动力和泵蛋白，酶和受体。
然而，如果仅用传统的生化方法确定某一特异蛋白的全序列，或制备足够量的蛋白进行操作和鉴定都是使人厌烦且昂贵的步骤。
基因克隆和遗传工程对生化领域有很大贡献。
如果只限于将基因组DNA作为材料来源，由于其中仅2%被认为可能编码蛋白质，那么确定蛋白质序列仍然是令人生畏的工作。
其他部分包括结构和调节因子、内含子、非编译外显子和重复及功能未知的非编码序列。
如果分析仅局限在编码序列，那么确定基因产物序列所需的努力就会大大的降低。
因此分子生物学主要原则之一是mRNA作为蛋白质合成的模板，所以mRNA是确定蛋白质序列的理想底物。
不幸的是，现有通用的克隆载体没有一个能容纳mRNA分子作为插入片段。
因此，产生表达序列文库的一个基本步骤是将mRNA分子转变成双链DNA。
来自mRNA分子的DNA拷贝称cDNA，由来自细胞或组织mRNA种类的DNA拷贝组成的文库称为cDNA文库。
1．基本原理cDNA（Complementary DNA）是以mRNA为模板，在反转录酶作用下合成的互补DNA，它的顺序可代表mRNA序列。
cDNA文库的构建是指将cDNA与克隆载体DNA体外重组，然后去转化克隆载体DNA 的宿主细胞，从而得到一群含重组DNA的细菌或噬菌体克隆的过程。
这些序列来自并代表一定组织或细胞类型特定发育或分化阶段的整个mRNA群体。
其过程可概括为：（1）通过反转录酶将各种mRNA转变在cDNA；（2）cDNA与合适的载体重组并导入到宿主中。
cDNA基因文库具有许多优点和特殊用途：首先，cDNA克隆以mRNA为起始材料，这对于有些RNA病毒来说非常适用，因为它们的增殖并不经过DNA中间体，研究这样的生物有机体，cDNA克隆是唯一可行的方法。
第二，cDNA基因文库的筛选简单易行，恰当选择mRNA的来源，使所构建的cDNA基因文库中，某一特定序列的克隆达到很高的比例，简化了筛选特定基因序列克隆的工作量。
cdna文库的构建过程
cdna文库的构建过程
cdna文库的构建过程包括以下步骤：
1. RNA提取：从目标细胞或组织中提取总RNA。
2. mRNA纯化：通过亲和层析或磁珠法将mRNA从总RNA中分离出来。
3. 反转录：利用反转录酶将mRNA转录成cDNA。
4. 修饰：为cDNA末端加上适当的连接器，如poly(A)尾部，便于后续PCR扩增。
5. PCR扩增：将cDNA扩增，并通过聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR）共有两种方法：one-step PCR 和two-step PCR。
6. 克隆：使用克隆技术将cDNA插入载体中。
7. 测序：对文库中的克隆进行测序，得到cDNA序列。
8.数据分析：通过基因注释、比对等方法分析得到的cDNA序列，进一步研究其功能和相关生物学过程。
以上是一般情况下的cdna文库构建过程，不同实验室根据具体需求会有部分不同的处理步骤和程序，如加入不同的连接器或使用不同的测序技术等。
cDNA文库的构建
PCR基因扩增
• 目的：增加目的DNA的数量
过程：
• 1、将PCR使用的药品、试剂从冰箱取出，冰浴放置。按照 PCR反应体系加药品，加药完毕后，用微型离心机离心数秒， 使所加药品混匀。
• 2、PCR反应体系
• 在0.2ml PCR管内配制25ml反应体系
• 3、PCR反应程序： • 预变性 • 变性 • 退火 • 延伸 • 再延伸
• (4)PCR反应完成后的样品4℃下短时间保存。-20℃下可 以保存数周。
双链cDNA连接到质粒或噬菌体载体并导入 大肠杆菌中繁殖
• 将合成的双链重组到质粒载体或噬菌体载体上,转化大肠 杆菌寄主细胞增殖.
• 1,同聚物加尾法 • 利用小牛胸腺末端转移酶在双链cDNA和质粒载体的3'-端
都加上一个互补的同聚片段,通过退火使两个连接片段成 重组质粒,再将重组质粒转化受体细胞. • 同聚物加尾法克隆双链cDNA • 2,接头-衔接头法 • 3,mRNA-cDNA克隆法
蓝白斑筛选：• 找出需构建的目的（3）cDNA第二条链的合成。
（4）双链cDNA的修饰。
（5）双链c提取与分离 B. 第一链cDNA的合成 C. 第二链cDNA的合成 D. 双链cDNA连接到质粒或噬菌体载体并导入大肠杆菌中
• 2、在锥瓶的瓶口用玻璃纸封口，留有一定空隙。然后在 微波炉中加热溶解琼脂糖。加热时，当溶液沸腾后，请 戴上防热手套，小心摇动锥瓶，使琼脂糖充分均匀溶解。
• 3、使溶液冷却至50℃-60℃左右，在此时按照1 μL / 10 mL的比例加入4S green染料，并充分混匀。
cDNA文库构建技术手册
目录1 材料与方法 (1)1.1 植物材料以及菌株的保存与培养 (1)1.2 Trizol法提取Total RNA (1)1.3 Oligo（dT）磁珠纯化mRNA (1)1.4 三框cDNA的合成 (2)1.5 cDNA均一化与小片段去除 (4)1.6 双链cDNA与pGADT7（lineared）同源重组 (6)1.7 质粒转化大肠杆菌 (7)1.8 文库鉴定 (7)1.9 文库质粒大抽 (8)2 结果与分析 (9)2.1 RNA质量较好无降解 (9)2.2 ds cDNA合成 (10)2.3 ds cDNA均一化与去除小片段 (11)2.4 克隆计数 (11)2.5 文库质量鉴定 (12)附录 (14)1．材料与方法1.1 植物材料以及菌株的保存与培养1.1.1 植物材料的保存盐穗木由客户提供，存放于-80℃超低温冰箱。
1.1.2 菌株的保存与培养大肠杆菌（Eschrichia coli）菌株TOP10于LB培养液摇菌后保存成20%的甘油菌于-80℃冷冻保存。
大肠杆菌于37℃培养箱中培养。
1.2 Trizol法提取Total RNA1）研钵研棒药勺用液氮预冷，样品在液氮中研磨成粉末状，转移到离心管中；2）按50-100 mg/ml trizol加入trizol，充分振荡混匀。
室温静置5 min，使其充分裂解；3）按200 μl/ml trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置10 min；4）4℃ 12000 rpm离心15 min，吸取上层水相至一新的离心管中，按500 μl/ml trizol加入异丙醇混匀，-20℃放置10 min；5）4℃ 12000 rpm离心10 min，弃上清，此时RNA沉淀于管底；6）按1 ml/ml trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。
4℃ 8000 g 离心5 min，尽量弃去上清；7）重复步骤6一次；8）室温晾干或真空干燥5-10 min，用29 μl RNase-free ddH2O和1 μl的RNase inhibitor 溶解RNA样品；9）分别吸取2 μl进行电泳检测与浓度测定。
cDNA文库构建知识
全长cDNA文库的构建—SMART技术真核细胞的mRNA在加工过程中有一个比喻为“穿鞋戴帽”的过程，因此mRNA的3'末端都带有一段Poly A，这是利用逆转录酶制备cDNA文库的基础。
但是由于cDNA的5'端的序列各不相同，如何获得全长的cDNA，如何扩增由微量的mRNA逆转录得到的cDNA 文库、如何利用已知片断序列得到全长的cDNA（即RACE），曾经是一个令人困扰的问题。
常见的做法是在合成cDNA的双链后在两端连上接头，利用已知的接头序列再进行扩增，或者是利用末端转移酶在双链cDNA的3'末端加上一连串的G或者C（或者A/T），再通过补齐粘末端，利用已知的两头序列进行扩增。
但是这些方法不同程度的存在一些问题，比如接头的连接效率非常有限，会导致部分信息的丢失，再加上这些方法需要多次用不同的酶处理有限的样品，需要经过反复的纯化，会损失很多有用的信息，特别是少量样品中的低丰度信息，很大程度上会影响结果的准确性。
另外由于mRNA容易部分降解，很难确定得到的cDNA是否就是全长的cDNA，还是cDNA的片断。
SMART技术的出现是一个新的里程碑。
这个称作Switching Mechanism At 5' end of the RNA Transcript(SMART)，原理实际上非常简单：在合成cDNA的反应中事先加入的3'末端带Oligo（dG）的SMART引物，由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到达mRNA 的5'末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个（dC），SMART引物的Oligo （dG）与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样得到的所有cDNA单链的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二链后可以利用通用引物进行扩增。
cdna文库的构建步骤
CDNA文库的构建步骤一、引言在分子生物学和基因组学研究中，建立cDNA文库是一项重要的实验技术。
cDNA文库是从mRNA中合成的互补DNA（cDNA）的集合，它能够反映细胞中mRNA的表达情况。
本文将详细探讨cDNA文库构建的步骤和流程。
二、cDNA文库构建步骤2.1 RNA提取与纯化在构建cDNA文库之前，首先需要提取和纯化所需基因表达的RNA，这是启动构建cDNA文库的关键步骤。
1.准备细胞样本或组织样本。
2.使用适当的方法（例如TriZol法、RNA纯化试剂盒）提取总RNA。
3.通过离心等手段去除DNA和蛋白质等杂质。
4.使用酶切RNA的方法去除rRNA等非编码RNA。
2.2 逆转录合成cDNA逆转录是将RNA转录成cDNA的过程，这是构建cDNA文库的关键步骤之一。
1.准备RNA模板和引物，引物可以是随机引物或特定引物。
2.将RNA样本与引物混合，在特定条件下进行反应。
3.添加逆转录酶（如Reverse Transcriptase），逆转录酶能合成cDNA的互补序列。
4.根据反应体系的要求进行反应，通常涉及温度和时间的控制。
5.利用热敏聚合酶（如Taq DNA Polymerase）可加热光敏不稳定的逆转录酶，从而停止逆转录反应，并保持产物的合成。
2.3 cDNA文库构建cDNA文库的构建涉及PCR扩增、酶切、连接和转化等步骤，下面详细介绍。
2.3.1 PCR扩增1.准备扩增反应液：包括cDNA模板、引物（正向引物和反向引物）、dNTPs和聚合酶等。
2.设置PCR扩增条件，包括温度、循环数和时长等。
3.进行PCR扩增反应，其中cDNA模板将作为DNA合成的起始物，引物将提供扩增的特异性。
2.3.2 酶切1.使用限制性内切酶对扩增产物和载体进行酶切。
2.确定酶切产物的大小和酶切位点。
2.3.3 连接1.准备连接试剂盒和连接系统。
2.混合酶切产物和合适的载体，进行连接反应。
3.控制反应条件，如温度和时间。
人正常垂体组织全长cDNA文库的构建及初步鉴定
Ｃｏ ｓ ｒ ｃ ｉ ｎ ａ ｄ ｐｒ ｌｍ ｉ ｒ ｄ ｎｔｆｃ ｔｏ ｆｆ ｌ—ｅ ｇ ｈ ｃ ｎ ｔ ｕ ｔｏ ｎ ｅ ｉ ｎａ ｙ ｉ ｅ ｉ ｉ ａ ｉ ｎ ｏ ｕ ｌｌ ｎ ｔ ＤＮＡ ｌｂ ａ ｙ ｏ ｍ ａ ｔ ｉａ ｙ ｔｓ ｕ ｉ ｒ ｒ ｆ ｈｕ ｎ ｐｉｕ ｔ ｒ ｉｓ ｅ
基 础 研 究 ．
人 正 常垂 体 组 织 全 长 ｃ ＤＮＡ 文 库 的 构 建 及 初 步鉴 定
蔡 英 ， 慧 玲 黄
摘 要 ： 应 用 Ｓ Ａ 术 构 建 人 正 常 垂 体 组 织 的 全 长 ｃ Ａ 文 库 。 方 法 用 Ｔ Ｉｏ 试 剂 提 取 组 织 总 Ｒ 目的 Ｍ Ｒ Ｆ技 ＤＮ Ｒｚｌ ＮＡ， 利 用 逆 转 录 酶 的 末 端 转 移酶 活 性 ， 先 加 入 Ｓ 预 ＭＡＲ 引物 ， Ｃ ｓ Ⅲ／ Ｐ Ｒ 引 物 的 引导 下 合 成 ｃ Ａ 第 一链 ， Ｔ 在 Ｄ ３ Ｃ ＤＮ
Ｍ ｅ ｈ ｄ Ｔ ｈｅ ｔ ａ Ｎ Ａ ａ ｘｔａ ｔ ｄ ｆ ｒ ｓ ｎｔ ｅ ｉｉ ｇ ｔ ｉｓ ｔ ａ ｆｃ Ｎ Ａ ｓｎｇ ＳＭ Ａ Ｒ Ｔ ｔｏ ｓ ｏｔ ｌＲ ｗ ｓ ｅ ｒ ｃ ｅ ｏ ｙ ｈ ｓｚ ｎ ｈｅｆｒ ｔｓ ｒ ｎｄ ｏ Ｄ ｕｉ ｔ ｃ ｎｉ ｕｅ Ｔ ｈｅ ｄ ｂｌ ｔ ａ ｄ ｃ Ｎ Ａ ａ ｍ ｐ ｉｉｄ ｂｙ ＬＤ— ｅｈ ｑ ． ｏｕ ｅ ｓ ｒ ｎ Ｄ ｗ ｓａ ｌｆｅ ＰＣＲ ｎｄ ｄ ｇｅ ｔ ｄ ｂｙ ＳｆＩｒ ｓ ｒｃ ｉ ｎ ｅ — ａ ｉ ｓ ｅ ｉ ｅ ｔ ｉｔｏ ｎ
华 老年心 腑 血戗： 杂志 ２ 病 ０１ ０年 １ ２月 第 １ ２卷 第 １ ２期
屋尘螨cDNA表达文库的构建及初步鉴定
屋尘螨cDNA表达文库的构建及初步鉴定作者：刘良，彭江龙，周鹰，崔玉宝【摘要】目的：构建屋尘螨cDNA表达文库. 方法：用RNAiso Reagent试剂盒提取屋尘螨Total RNA，用Poly AT tract mRNA分离试剂盒提取mRNA，用Clontech公司SMARTTM PCR cDNA library kit 反转录合成第1链cDNA，用LD PCR合成第2链cDNA并扩增，PCR产物与MaxPlax TM试剂盒体外连接包装，建成未扩增的cDNA 文库，计算其滴度和重组效率后进行文库扩增并测定扩增文库的滴度. 结果：cDNA文库未扩增时滴度为9.148×106，重组效率达93.88%以上，文库扩增后滴度为7.628×109，插入片段平均1.63 kb. 结论：成功地构建了高质量的屋尘螨cDNA表达文库.【关键词】欧洲屋尘螨，基因文库0引言随着现代分子生物学技术的发展，应用基因工程变应原诊断和治疗变态反应性疾病已成为当代变态反应学研究的主流. 研究表明，基因工程技术通过减少重组变应原IgE结合的抗原表位，能有效地降低IgE介导的过敏反应，同时通过保留变应原T细胞识别所必须的结构域，因而具有较好的免疫原性，减少免疫治疗的危险性，可以提高脱敏治疗的效果［1-2］.制备基因工程变应原的前提是获取目的基因. 从理论上讲，研究者可从一个合格的基因文库中调取任何目的基因，是发现并获取特异性基因克隆应用于重组变应原研究的有效方法之一. 本研究采用Clontech公司Smart方法构建屋尘螨cDNA表达文库，为系统地研究屋尘螨的基因结构和功能、进一步制备尘螨基因工程变应原奠定基础.1材料和方法1.1材料SMARTTM PCR cDNA library kit为美国Clontech 公司产品，RNAiso Reagent，Transcript RNA Clean Up Kit均购自日本TaKaRa公司，poly AT tract mRNA分离试剂盒由美国Promega公司生产. Oligo dT纤维素、MMLV反转录酶和MaxPlaxTMLambda Packaging Extract购自德国Eicentre technologies公司，其余试剂为国产分析纯. TP3000 PCR仪（Takara），Mupid电泳仪(Advance bio Co., Ltd)，ImageMaster VDS电泳成像装置（Pharmacia Biotech），ABI PrismTM 377XL DNA Sequencer DNA测序仪（Perkin Elmer）.1.2方法1.2.1cDNA文库的构建解剖镜下挑取屋尘螨约200只，匀浆后用TaKaRa RNAiso Reagent试剂盒提取Total RNA，用Poly AT tract mRNA 分离试剂盒提取mRNA，操作按说明书进行. 参照试剂盒说明书，cDNA文库的构建以mRNA为模板，Smart ⅢOligonucleotid (dT)为引物，在MMLV反转录酶作用下合成cDNA第1链；加入dNTPs，5 PCR Primer，3PCR Primer和Advantage Ⅱ聚合酶，置基因扩增仪上用长距离PCR(LD PCR)合成得双链DNA，取PCR产物5 μL用琼脂糖凝胶电泳检测，以鉴定双链DNA分布范围. 经蛋白酶K灭活、SfiⅠ酶切、过柱(Chro2Maspin 400) 分级分离后，连续收集12个单滴组分，每组分取2 μL进行琼脂糖凝胶电泳，收集前4个含有cDNA 的组分，用乙醇沉淀回收. 按照cDNA∶Vector = 1∶2/1∶1/2∶1 三种方式进行连接，用MaxPlaxTM试剂盒对连接产物进行体外包装，至此建屋尘螨cDNA未扩增文库.1.2.2未扩增文库滴度测定取3种连接方式稀释度为1∶5，1∶10和1∶20的包装产物各1 μL，分别与过夜液体培养物200 μL混合，并加入融化的LB/MgSO4 Top Agar 3 mL，快速倒在37℃预热的90 mm LB/MgSO4平板，快速旋转平板，使Top Agar水平分布，室温冷却10 min后置37℃倒置培养6~18 h. 统计噬菌斑，计算滴度pfu/mL=噬菌斑数×稀释因子×103/铺板体积(μL). 利用IPTG和X Gal诱导上述未扩增文库计数蓝、白斑，重组效率=白斑数/(白斑数+蓝斑数).1.2.3扩增文库滴度计算在10 mL试管中加入过夜培养的XL1 Blue菌液500 μL和足够的噬菌体液(未扩增文库)，在37℃水浴15 min 后，每管加入融化的LB/MgSO4 Top Agar 9 mL，快速混匀铺板，室温冷却后置37℃倒置培养至噬菌斑长满，每块平板加入1×λ稀释液12 mL，4℃过夜，以得到已扩增文库的裂解液；将平板在脱色摇台上室温50 r/min 1 h，用灭菌烧杯收集平板中的噬菌体裂解液，充分混匀后分装于50 mL灭菌离心管，每管加入氯仿10 mL，盖紧，振荡混匀2 min，7000 r/min离心10 min，收集上清液，4℃保存. 扩增文库滴度计算方法同上，所选用的噬菌体裂解液稀释度为10-4，铺板体积为5 μL/12 mm.1.2.4文库的PCR鉴定随机挑取12个单克隆噬菌斑分别加入到装有100 μL 1×λ稀释缓冲液的管中，并加入XL1Blue菌的过夜培养物200 μL，制备DNA模板. 根据克隆位点两端的序列设计并委托上海生物工程公司合成引物P1(5′CTCCGAGATCTGGACGAGC 3′)和引物P2 (5′TAATACGACTCACTATAGGG3′). PCR 反应体积为50 μL，具体如下：DNA模板6 μL，引物P1和P2各1 μL (10 μmol/L)，10×Advantage 2 PCR Buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP Mix 2μL，50×Advantage 2 Polymerase Mix及ddH2O 34.6 μL. 反应条件：95℃预变性1 min，95℃50 s，56℃50 s，72℃1 min，共35个循环，最后72℃维持10 min. PCR产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定.取灭菌的1.5 mL Eppendorf管，每管加文库裂解液1 mL及DMSO 70 μL，混匀，并做好标记、封口，-80℃保存文库.2结果2.1cDNA文库的构建按Takara公司RNAiso Reagent 说明书操作获得屋尘螨总RNA 30 μL，紫外分光光度计测定核酸含量0.62 g/L，A260/A280=1.87，12 g/L琼脂糖凝胶电泳结果显示18 s和28 s两条带，未见降解(图1)，提示获得的总RNA纯度高. 用Poly AT tract mRNA 分离试剂盒提取mRNA后，以mRNA为模板，Smart ⅢOligonucleotid (dT)为引物，在MMLV反转录酶作用下合成cDNA第1链，电泳显示第1链cDNA大部分集中在0.5~2 kb之间，符合cDNA合成的分布规律(图2). LD PCR合成得双链DNA，取产物5 μL用琼脂糖凝胶电泳检测，合成的双链cDNA稍大于第1链，大部分集中在0.5 kb以上（图3）.1~2: 屋尘螨总RNA.图1屋尘螨总RNA电泳图1: 屋尘螨cDNA第1链; M: DNA Marker DL2000.图2屋尘螨mRNA反转录合成的cDNA第1链2.2未扩增文库滴度计算噬菌斑数结果表明以第2种连接方式所产生的噬菌斑数最多，第3种连接方式次之，第1种连接方式最少，说明第2种连接方式效果最好（表1）. 取3种连接的最小值计算每种连接的滴度，pfu/L=(2.21+16.875+8.36)×0.5×109/(0.5+0.5+0.5) =9.148×109 pfu/L. 重组效率的计算表明，3种连接方式的重组效率(94.77%, 97.66%, 93.88%)均高于80%，满足构建质量文库的需要. M: DNA Marker DL2000;1: 屋尘螨cDNA第2链.图3屋尘螨mRNA反转录合成的cDNA第2链表13种连接方式在3种稀释度时的噬菌斑数2.3扩增文库的滴度稀释度为10-5的3个平板内噬菌板最为清晰可数，以此计算扩增文库滴度，pfu/L= ［(462/5+637/10+1455/20)/3］×1085×103=7.628×1012（表2）. 表2稀释度为10-5的3个平板计算结果2.4文库的PCR鉴定根据载体克隆位点两端的序列设计引物进行PCR鉴定，结果显示，所选的12个噬菌体均含有重组cDNA，长度在400 bp以上的有2个，500 bp左右的有2个，750 bp以上的有2个，1000 bp以上的有2个，2000 bp及其以上的有4个，平均1.63 kb(图4).3讨论尘螨隶属于节肢动物门(Arthropoda)、蛛形纲(Arachnida)、蜱螨亚纲(Acari)，广泛存在于人类生活和工作环境中，其排泄物、代谢物及螨体均具较强的M: DNA Marker DL2000;1~12: 含重组cDNA 的噬菌体PCR产物.图4屋尘螨cDNA文库的PCR鉴定变应原性，可引起螨性哮喘、异位性皮炎、过敏性鼻炎等Ⅰ型变态反应性疾病. 法国N. Roche(2000)估计约60%~100%的哮喘患者对尘螨过敏［3］. 国内学者用粉尘螨浸液对哮喘患者进行皮肤挑刺试验，47%~92.11%的成人患者呈阳性反应，51.64%~78.85%患儿对尘螨过敏［4］. 《哮喘全球防治策略》指出，哮喘每年造成的直接或间接损失达100亿美元［5］. 随着工业化的发展，人民生活水平的提高，此类疾病的发生不但不下降反而呈上升趋势［6］.特异性免疫治疗被认为是目前唯一Ⅰ型变态反应性疾病病因治疗方法，即通过逐渐增加、反复皮下注射特异性变应原，提高患者对特异性变应原的免疫耐受力，调节患者细胞免疫功能，增强Th1反应,抑制Th2反应，并产生高水平的IgG抗体阻断变应原结合到IgE，以提高患者对特异性变应原的免疫耐受力，达到再次暴露于特异性变应原后不发病或虽发病、但症状明显减轻的目的［1-2,7-9］.尘螨变应原成份复杂，约有30余种，现已提纯出16类变应原. 目前，临床主要采用尘螨变应原粗提浸液免疫治疗哮喘患者，由于变应原浸液包含成分较复杂，如存在变应原、非过敏性或毒性蛋白及其他成分，所以很难进行变应原标准化，且在治疗中长期使用易导致严重IgE介导的过敏反应，如可发生红晕、肿胀、硬结、坏死等局部反应和休克、喉头水肿、支气管痉挛、荨麻疹、血管性水肿、全身性红斑等全身反应［1-2,7-9］，因此，提高变应原纯度是减少免疫治疗副反应发生的有效途径. 1998年，WHO发布的关于免疫治疗的指导文件中强调，变应原的质量对变态反应疾病的诊断和治疗至关重要，用于免疫治疗的变应原应该是纯品而不宜为粗制浸液［7］. 但是，尘螨变应原主要存在于螨的排泄物和皮壳中，采用生物化学方法提纯尘螨变应原，耗时长，过程繁琐，成本较高，且不能从根本上提高变应原的纯度、避免免疫治疗中副反应的发生.本研究提取屋尘螨总RNA，反转录合成cDNA第1链并用置换法合成双链cDNA，用Smart方法构建全长cDNA表达文库，为进一步研究尘螨变应原基因信息、通过基因工程技术制备重组变应原疫苗用于尘螨变态反应性疾病的诊断和治疗奠定基础.容量和重组噬菌体中插入的cDNA片段长度是评价基因文库的重要指标. 当一个cDNA文库的容量为4.6×104~4.6×105时，得到所需克隆的概率为99%，就可以筛选出低丰度的cDNA. 本研究所构建的cDNA文库未扩增时滴度为9.148×106，文库扩增后滴度为7.628×109，完全满足要求. 为了鉴定重组体中插入的cDNA片段的长度，本研究从文库中随机挑选12个噬菌斑进行PCR鉴定，电泳结果显示此11个噬菌斑中均含有重组的cDNA，片段长度均在400 bp以上，提示我们所构建的cDNA文库质量较好.【参考文献】［1］Norman PS. Immunotherapy:19992004 ［J］. J Allergy Clin Immunol, 2004,113(6):1013-1023.［2］Greenberger PA. Immunotherpy update: mechanisms of action ［J］. Allergy Asthma Proc, 2002,23(6):373-376.［3］Roche N, Chinet TC,Belouchi NE, et al. Dermatophagoides pteronyssinus and bioelectric properties of airway epithelium: role of cysteine proteases ［J］. Eur Respir J, 2000,16(2):309-315.［4］崔玉宝，何珍，李朝品. 居室环境中螨类的孳生与疾病［J］. 环境与健康杂志，2005,22(6):500-502.［5］NHLBI workshop report. Global strategy for asthma management and prevention ［M］. New York: NIH Publication, 2002: 95-3659.［6］Isolauri E, Huurre A, Salminen S, et al. The allergy epidemic extends beyond the past few decades ［J］. Clin Exp Allergy, 2004,34(7):1007-1010.［7］Bousquet J, Lockey RF, Malling HJ. Allergen immunotherapy: therapeutic vaccines for allergic diseases ［J］. Allergy, 1998,53(Suppl):1-42.［8］Ramirez NC, Ledford DK. Immunotherapy for allergic asthma ［J］. Med Clin North Am, 2002,86(5):1091-1112.［9］Dinakar C, Portnoy JM. Allergen immunotherapy in the prevention asthma ［J］. Curr Opin Allergy Clin Immunol, 2004,4(2):131-136.。
cdna文库构建流程
cDNA文库组标准流程一. Total RNA的提取 (2)二. mRNA的分离 (5)三．cDNA双链合成 (8)四．载体制备 (11)五. cDNA双链和载体的连接 (13)六．电转化流程 (14)七．快速鉴定、菌落PCR (16)八．pBlueScript cDNA库扩增 (18)一.Total RNA的提取1.试剂配制准备工作：1、研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部，置于烤箱内,180℃，烤6小时。
2、50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡过夜后，121℃20mins 高压灭菌。
3、电泳槽及电泳托、梳子用3%双氧水处理。
4、常用试剂及其配方：▲DEPC水：在1000ml去离子水中加入100ul DEPC, 静置过夜后高压灭菌。
▲0.78M柠檬酸纳：PH=4~5三水合柠檬酸纳22.94g加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。
▲10%肌氨酸钠：肌氨酸钠10g加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。
▲变性裂解液：0.78M柠檬酸钠8.25ml10%肌氨酸钠12.375ml异硫氰酸胍118.05g加DEPC水定容至250ml，室温放置备用临用前加β-巯基乙醇使其终浓度为1%（v/v）▲2M 醋酸钠PH=4.5NaAc·3H2O 13.6g加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用▲3M醋酸钠PH=5NaAc·3H2O 20.4g加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用▲4M LiCL:LiCL 24.164g加DEPC水定容至100ml,高压灭菌，室温放置备用▲0.5M EDTA PH=8.0EDTA 18.61g用NaOH调PH值至8.0，定容到100ml，高压灭菌，室温放置备用▲10X MOPS (3-（N-吗啉代）丙磺酸):MOPS 41.86gNaAC·3H2O 4.10g0.5MEDTA（PH 8.0）20ml用NaOH调PH值 6.5 , DEPC水定容到1L，室温避光放置备用。
BAC文库的构建[精华]
![BAC文库的构建[精华]](https://img.taocdn.com/s3/m/9904d7a768dc5022aaea998fcc22bcd127ff4244.png)
BAC文库构建技巧基因组DNA文库构建实验技巧基因组DNA文库有十分广泛的用途，如用于分析、分离特定的基因片段，用以基因表达调控、人类及动植物基因组工程的研究。
通常情况下，基因组文库构建的基本流程可以归为4大步骤：分离基因组DNA、对基因组DNA作相关的处理、将基因组DNA片段连接入载体、将重组载体转入宿主细胞。
一、分离基因组DNA（gDNA）毫无疑问，优质的基因组DNA对于基因组文库构建是至关重要的。
研究者需要查阅文献，通过经验来选择合适的基因组DNA 分离方法，在分离过程中保证DNA不被过度剪切或降解，同时也要尽量保证DNA的纯度。
二、处理基因组DNA根据研究目的，研究者需要选择合适的载体。
不同的载体对基因组DNA的长度有不同的要求，研究者必须选择合适长度的基因组DNA来构建基因组文库。
比如，对于黏粒载体（比如Epicntre的pCC1FOSTM、pEpiFOSTM-5、pWEB-TNCTM、pWEBTM），合适的片段长度大约为40kb；对于BAC载体（比如Epicentre 的pIndigoBAC-5、pCC1BACTM），平均来说，合适的片段长度为120kb-300kb。
构建黏粒基因组DNA文库，研究者需要将基因组DNA用注射器抽打来随机剪切DNA；接着用末端修复酶修复DNA，可以提高DNA连接入载体的效率；然后通过脉冲场电泳或者普通电泳来找到40kb左右的DNA片段，随后使用Epicentre GELase 胶回收试剂盒回收DNA。
构建BAC基因组DNA文库，研究者需要将基因组DNA用限制性内切酶（常用EcoR I、BamH I或者Hind III）来消化基因组DNA，然后通过脉冲场电泳找到合适长度的DNA片段（比如100kb-150kb），随后透析回收DNA。
需要注意：（1）电泳时，要选用合适的DNA Ladder，以保证电泳后可以准确定位所需分子量的DNA。
用Epicentre试剂盒构建黏粒文库时，就可以直接采用文库试剂盒内的Control Insert DNA来做marker，既方便又准确。
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人正常胃黏膜细胞全长cDNA文库的构建及鉴定【摘要】目的构建人正常胃黏膜细胞的cDNA文库并鉴定文库质量。
方法运用mRNA 5′末端的模板转换方法以powerscript 逆转录酶进行转录,在mRNA的5′末端添加一段5′oligo 做为延伸后的模板,从而富集全长cDNA.扩增后的cDNAs经XhoI酶切、柱层析洗脱,重组于pGADT7载体并包装后,测定滴度、重组率,扩增文库。
随机挑取16个克隆行PCR 反应扩增插入片段。
结果构建的cDNA 文库滴度为4.00 ×106 pfu/ml,重组率>95%,扩增后滴度达9.50×109 pfu/ml,16个插入片段长度为0.5～2.0 kb.结论构建的人正常胃黏膜细胞cDNA 文库为高效全长的酵母双杂交cDNA 文库,符合cDNA 文库的要求,可进一步用酵母双杂交的方法探寻与胃疾病相关的基因。
【关键词】胃黏膜细胞;cDNA文库;全长【Abstract】 Objective To construct a full length cDNA library of human gastric mucosa and identify the quality of the library.Methods The library was constructed by using the template switching technique at 5′ end of mRNA.A powerscript reverse transcriptase was used to transcribe,and a 5′ oligo fragment as an extended template was added t o 5′end of mRNA to enrich full length cDNAs.After amplification,the cDNAs digested by XhoI and size fractionated by columns were recombined into pGADT7 vectors.After package,the titer ofrecombinant vectors and the recombinant rate(blue/ white)were determined,then the library was amplified.We identified the library using PCR reaction to determine the size of the inserts.Results The titer of cDNA library was 4.00 ×106pfu/ml,the rate of recombinant was above 95 %,and the titer of amplified library was 9.50×109pfu/ml.The insert size ranged from 0.5 to 2.0 kb.Conclusion The yeast two hybrid cDNA library of human gastric mucosa is successfully constructed and can be used for screening by Yeast Two HyBrid to find the genes related to gastric diseases.【Key words】 gastric mucosa;cDNA library;full length随着人类基因组计划的初步完成,确定不同发育阶段的功能基因成为后基因组时代的重要研究内容,而构建cDNA文库已成为研究功能基因组学的基本手段之一,在分离、克隆、筛选新基因以及基因功能研究等方面具有重要作用[1]。
本研究以pGADT7为表达载体,构建了一个人正常胃黏膜细胞全长cDNA 表达文库,为今后胃疾病相关基因的研究工作奠定了基础。
1 材料与方法1.1 材料人GES1细胞于2009年6月18日购自中南大学湘雅中心实验室。
Trizol提取试剂购自美国Invitrogen公司;质粒小量提取试剂盒、PCR TaqMix试剂盒、Oligotex dT30 mRNA Purification kit购自大连宝生物科技有限公司;其他生化试剂购自国内生物公司。
1.2 方法1.2.1 总RNA提取及poly(A)+RNA纯化细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基,在37℃,5%CO2的条件下培养。
培养至旺盛生长期,倾尽培养液后直接向培养瓶中加入Trizol试剂(1 ml/10 cm2),裂解细胞,并用吸头将细胞裂解物吹吸几次,再经氯仿抽提及异丙醇沉淀后,以75%乙醇洗涤,室温自然干燥,干燥后溶于三蒸水中(DECP处理),并在55～60℃放置10 min让其充分溶解。
取出一小份稀释后在紫外分光光度计下测RNA含量及纯度,并做琼脂糖凝胶电泳分析总RNA完整性。
以Oligotex dT30 mRNA Purification kit进行mRNA分离纯化,实验步骤按说明书进行。
1.2.2 第一链cDNA 的合成将模板RNA(Poly(A)+ RNA)5 μg 中加入H2O,使其总量达到9.8 μl,于72 ℃孵育2 min,冰中放置2 min后在微量离心管中加入5×1st Strand Synthesis Buffer 4 μl、1st Strand dNTP Mixture 1.2 μl、RNase Inhibitor(20 U/μl)1.0 μl、1 μg /μl Oligo(dT)18 Anchor Primer[序列为5'(GA)10ACTAGTCTCG AG(T)18V3'(V:A or C or G)]2.0 μl于室温放置10 min后加入Reverse Transcriptase(M MLV)1.0 μl,轻轻混匀,于 42 ℃孵育60 min,向反应管中加入200 U/μl SuperScript III RTase 1 μl,52 ℃孵育60 min,反应结束后置于冰中冷却2～5 min.1.2.3 双链cDNA合成在第一链cDNA合成液(20 μl)中加入5×2nd Strand Synthesis Buffer 30 μl、2nd Strand dNTP Mixture 4.5 μl、RNase free H2O 87.5 μl、E.coli RNase H/E.coli DNA Ligase Mixture 2 μl、E.coli DNA PolymeraseⅠ2 μl.用移液枪轻轻混匀后,16 ℃反应2 h,70 ℃加热10 min,室温放置5 min,加入4 μl的T4 DNA Polymerase轻轻搅拌,37 ℃反应10 min.经PCI抽提、CI 抽提后,加入 3 M Sodium Acetate(pH5.2)15 μl,Dr.GenTLE Precipitation Carrier 3 μl,100%乙醇400 μl,立即进行室温下15 000 r/min共30 min的离心。
除去上清后用70%的乙醇清洗,干燥沉淀后,用3.5 μl的 RNase free H2O溶解沉淀。
1.2.4 cDNA与sal Ⅰ adaptor的连接向上述双链cDNA溶液3.5 μl中加入下列试剂:10×T4 DNA Ligase Buffer 1 μl,0.4 μg/μl EcoR I Adaptor 3.5 μl,350 U/μl T4 DNA Ligase 1 μl,10 mm Ratp 1 μl,全量为10 μl.轻轻混匀,8 ℃过夜反应,70 ℃保温30～45 min,室温放置5 min.1.2.5 限制酶XhoI酶切反应向Adaptor Ligation溶液中加入:10× H buffer 5 μl,50 U/μl Xho I 3 μl,轻轻混匀,37 ℃反应3 h.1.2.6 使用Spin Column除去短链cDNA及文库构建单链(single strand,ss)cDNA 扩增后合成双链(double strand,ds)cDNA,ds cDNA经XhoⅠ酶切及柱层析洗脱,收集0.5～5 kb 之间的组分,在T4DNA 连接酶作用下,与pGADT7去磷酸化臂于16 ℃水浴中过夜连接,随后包装蛋白包装载体。
1.2.7 文库滴定、重组率测定和扩增按照构建的cDNA 文库滴度文库滴定公式[2]:原始文库滴度=克隆斑总数×稀释倍数×包装体积,重组率测定采用蓝白斑筛选方法,即向含有酵母菌和混合液的上层琼脂中分别加入50 μl 100 mmol/L的IPTG 和X2Gal,于90 mm 平板上铺板,置37 ℃孵育过夜,分别计算蓝色斑和无色斑数,重组率=无色噬菌斑数/(无色噬菌斑数+蓝色噬菌斑数),随后进行文库的扩增。
1.2.8 cDNA文库质量鉴定取扩增后的cDNA 文库铺板,随机挑取16个克隆斑行PCR 扩增,以载体克隆位点两端的序列设计引物(引物合成公司为大连宝生物工程有限公司):引物1:5'GGAGTACCCATA CGACGTACC3'及引物2:5'TATCTACGATTCATCTGCAGC3',反应条件为:95℃预变性1 min,于95 ℃30 s,55 ℃30 s,72 ℃3 min循环30周,最后于72 ℃延伸10 min.1% Agarose Ge电泳,检测Insert DNA的片段长度。
2 结果与分析2.1 总RNA的制备和mRNA的分离纯化提取的总RNA于紫外分光光度仪检测吸光度OD=A260/A280=1.92,于10 g/L琼脂糖凝胶电泳可见28 S、18 S、5 S 3条清晰带,28 S∶18 S 约为2∶1(图1),纯化后的mRNA于10 g/L琼脂糖凝胶电泳显示为为0.5～5 kb 的片状条带,说明所提取的mRNA质量较纯。
2.2 cDNA 文库的构建poly(A)+ RNA经逆转录及扩增后,于11 g/L琼脂糖凝胶上电泳,ds cDNA在0.4～5 kb之间形成一片状条带,经酶切及柱层析洗脱后,收集长度在0.5 kb 以上的组分,经乙醇沉淀浓缩后,溶于7 μl 去离子水中,取3 μl 于11 g/L琼脂糖凝胶上电泳,显示为长度在0.5～4 kb 的一片状条带(图2),即可与载体pGADT7连接。