人正常胃黏膜细胞全长cDNA文库的构建及鉴定

时间：2021年3月28日学海无涯页码：第1页共6页人正常胃黏膜细胞全长cDNA文库的

构建及鉴定

随着人类基因组计划的初步完成,确定不同发育阶段的功能基因成为后基因组时代的重要研究内容,而构建cDNA文库已成为研究功能基因组学的基本手段之一,在分离、克隆、筛选新基因以及基因功能研究等方面具有重要作用[1]。本研究以pGADT7为表达载体,构建了一个人正常胃黏膜细胞全长cDNA 表达文库,为今后胃疾病相关基因的研究工作奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

人GES1细胞于2009年6月18日购自中南大学湘雅中心实验室。Trizol提取试剂购自美国Invitrogen公司;质粒小量提取试剂盒、PCR TaqMix试剂盒、Oligotex dT30 mRNA Purification kit购自大连宝生物科技有限公司;其他生化试剂购自国内生物公司。护理论文发表

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取及poly(A)+RNA纯化细胞用含10%胎牛血

清的DMEM培养基,在37℃,5%CO2的条件下培养。培养至旺盛生长期,倾尽培养液后直接向培养瓶中加入Trizol试剂(1 ml/10 cm2),裂解细

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胞,并用吸头将细胞裂解物吹吸几次,再经氯仿抽提及异丙醇沉淀后,以75%乙醇洗涤,室温自然干燥,干燥后溶于三蒸水中(DECP处理),并在55～60℃放置10 min让其充分溶解。取出一小份稀释后在紫外分光光度计下测RNA含量及纯度,并做琼脂糖凝胶电泳分析总RNA完整性。以Oligotex dT30 mRNA Purification kit进行mRNA分离纯化,实验步骤按说明书进行。

1.2.2 第一链cDNA 的合成将模板RNA(Poly(A)+ RNA)5 μg 中加入H2O,使其总量达到9.8 μl,于72 ℃孵育2 min,冰中放置2 min 后在微量离心管中加入5×1st Strand Synthesis Buffer 4 μl、1st Strand dNTP Mixture 1.2 μl、RNase Inhibitor(20 U/μl)1.0 μl、1 μg /μl Oligo(dT)18 Anchor Primer[序列为5’(GA)10ACTAGTCTCG AG(T)18V 3’(V:A or C or G)]2.0 μl于室温放置10 min后加入Reverse Transcriptase(M MLV)1.0 μl,轻轻混匀,于42 ℃孵育60 min,向反应管中加入200 U/μl SuperScript III RTase 1 μl,52 ℃孵育60 min,反应结束后置于冰中冷却2～5 min.

1.2.3 双链cDNA合成在第一链cDNA合成液(20 μl)中加入5×2nd Strand Synthesis Buffer 30 μl、2nd Strand dNTP Mixture 4.5 μl、RNase free H2O 87.5 μl、E.coli RNase H/E.coli DNA Ligase Mixture 2 μl、E.coli DNA PolymeraseⅠ2 μl.用移液枪轻轻混匀后,16 ℃反应2 h,70 ℃加热10 min,室温放置5 min,加入4 μl的T4 DNA Polymerase 轻轻搅拌,37 ℃反应10 min.经PCI抽提、CI抽提后,加入3 M Sodium Acetate(pH5.2)15 μl,Dr.GenTLE Precipitation Carrier 3 μl,100%乙醇

400 μl,立即进行室温下15 000 r/min共30 min的离心。除去上清后用70%的乙醇清洗,干燥沉淀后,用3.5 μl的RNase free H2O溶解沉淀。

1.2.4 cDNA与sal Ⅰadaptor的连接向上述双链cDNA溶液3.5 μl中加入下列试剂:10×T4 DNA Ligase Buffer 1 μl,0.4 μg/μl EcoR I Adaptor 3.5 μl,350 U/μl T4 DNA Ligase 1 μl,10 mm Ratp 1 μl,全量为10 μl.轻轻混匀,8 ℃过夜反应,70 ℃保温30～45 min,室温放置5 min.

1.2.5 限制酶XhoI酶切反应向Adaptor Ligation溶液中加入:10×H buffer 5 μl,50 U/μl Xho I 3 μl,轻轻混匀,37 ℃反应3 h.护理论文发表

1.2.6 使用Spin Column除去短链cDNA及文库构建单链(single strand,ss)cDNA 扩增后合成双链(double strand,ds)cDNA,ds cDNA经XhoⅠ酶切及柱层析洗脱,收集0.5～5 kb 之间的组分,在T4DNA 连接酶作用下,与pGADT7去磷酸化臂于16 ℃水浴中过夜连接,随后包装蛋白包装载体。

1.2.7 文库滴定、重组率测定和扩增按照构建的cDNA 文库滴度文库滴定公式[2]:原始文库滴度=克隆斑总数×稀释倍数×包装体积,重组率测定采用蓝白斑筛选方法,即向含有酵母菌和E.coli.XL1 Blue 混合液的上层琼脂中分别加入50 μl 100 mmol/L的IPTG 和X2Gal,于90 mm 平板上铺板,置37 ℃孵育过夜,分别计算蓝色斑和无色斑数,重组率=无色噬菌斑数/(无色噬菌斑数+蓝色噬菌斑数),随后进

行文库的扩增。

1.2.8 cDNA文库质量鉴定取扩增后的cDNA 文库铺板,随机挑取16个克隆斑行PCR 扩增,以载体克隆位点两端的序列设计引物(引物合成公司为大连宝生物工程有限公司):引物1:5’GGAGTACCCATA CGACGTACC3’及引物2:5’TATCTACGATTCATCTGCAGC3’,反应条件为:95℃预变性 1 min,于95 ℃30 s,55 ℃30 s,72 ℃3 min循环30周,最后于72 ℃延伸10 min.1% Agarose Ge电泳,检测Insert DNA的片段长度。

2 结果与分析

2.1 总RNA的制备和mRNA的分离纯化

提取的总RNA于紫外分光光度仪检测吸光度OD=A260/A280=1.92,于10 g/L琼脂糖凝胶电泳可见28 S、18 S、5 S 3条清晰带,28 S∶18 S 约为2∶1(图1),纯化后的mRNA于10 g/L琼脂糖凝胶电泳显示为为0.5～5 kb 的片状条带,说明所提取的mRNA质量较纯。2.2 cDNA 文库的构建

poly(A)+ RNA经逆转录及扩增后,于11 g/L琼脂糖凝胶上电泳,ds cDNA在0.4～5 kb之间形成一片状条带,经酶切及柱层析洗脱后,收集长度在0.5 kb 以上的组分,经乙醇沉淀浓缩后,溶于7 μl 去离子水中,取3 μl 于11 g/L琼脂糖凝胶上电泳,显示为长度在0.5～4 kb 的一片状条带(图2),即可与载体pGADT7连接。构建的文库经效价测定,文库的克隆数为 4.00 ×106 pfu/ml,以蓝白斑筛选检测重组率> 95 %,文库经扩增后,滴度达9.50×109pfu/ml.