灵芝三萜类化合物的研究进展

表 1 微波法及其他提取方法提取率比较［25］ Table 1 Comparison of extraction rates of microwave method and other methods
方法
浸提［25］ 超声［25］ 加热回流［25］ 超临界提取［25］ 微波［25］
提取时间 溶剂 料液比 三萜类提取率 /%
［关键词］ 灵芝; 三萜类化合物; 提取纯化; 含量分析
灵芝 Ganoderma lucidum 是一种大型药用真菌，属于担子 菌岗多孔菌科灵芝属真菌，包括赤芝 G． lucidum( Levss. ex Fr. ) . 和紫芝 G． sinense. 的干燥子实体［1］。始载于《神农本 草经》，历代医书将其列为上品，具有补中益气、滋阴强壮、扶 正固本、延年益寿等功效。灵芝是《中国药典》收录的一种中 药材，是食药兼用的一种真菌，灵芝中的多糖、三萜、核苷、生 物碱、氨基酸多肽、微量元素等成分是其药效物质基础，其中 三萜和多糖是灵芝最主要的两大活性成分。现代药理研究 表明，灵芝 三 萜 类 化 合 物 具 有 保 肝、抗 肿 瘤、抗 HIV-1 及 HIV-1 蛋白酶活性、抗 组 织 胺 释 放、抑 制 血 管 紧 张 素、抗 氧 化 等作用［2-12］。
12 h 30 min 2h 3h 5 min
95% 乙醇 40 95% 乙醇 60 95% 乙醇 40 CO2 + 乙醇 － 95% 乙醇 25
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2. 58 1. 72 2. 22 1. 52 5. 11
1. 4 超临界 CO2 提取法 超临界 CO2 提取( supercritical fluid carbon dioxide extraction) 技术是一项把萃取和分离合二为一 的新型技术，该技术与传统的化学溶剂提取法相比，不仅工艺 简单、能耗低，活性成分不易被破坏，而且具有无污染、无化学 溶剂消耗和残留的优点，被称为绿色生物萃取分离技术［26-27］。
［稿件编号］ 20110614010 ［基金项目］ 科技部科技基础性工作专项重点项目( 2007FY130100) ［通信作者］ * 李晔，食品工程师，福建省食用菌学会第三届理事会 副理事 长，长 期 专 业 从 事 食 药 用 菌 的 研 究 与 开 发，Tel: ( 0591 ) 83053398，Fax: ( 0591) 83053396，E-mail: lee@ xianzhilou. com
1 灵芝三萜类化合物的提取 1. 1 溶剂提取法 灵芝三萜化合物结构相似，难溶于水、易 溶于有机溶剂、性质不稳定，因此分离和纯化的难度比较大。 一般常用甲醇、乙醇、氯仿或乙酸乙酯等有机溶剂在常温或 高温下回流提取。溶 剂 不 同 提 取 效 果 差 异 明 显。侯 敏 娜 等［15］采用正交试验方法研究了灵芝三萜的最佳提取方法，得 出最佳的提取工艺为 5 倍量 95% 乙醇回流提取 3 次，每次 1. 5 h，再用硅胶色谱柱分离，紫外分光光度法测定了灵芝中总三 萜化合物的含量为 9. 07% 。Iksoo Lee 等［16］用甲醇回流提取 灵芝三萜类，甲醇浸膏用水溶解，经正己烷和氯仿反复萃取得 到三萜类粗提物，提取率 2% 。Wang X M 等［17］将灵芝子实体 经 95% 乙醇回流提取，所得浸膏经碱提酸化后用二氯甲烷萃 取出 来，浓 缩 得 三 萜 酸 浸 膏，提 取 率 1. 13% 。Sri Fatmawati 等［18］将灵芝子实体在室温下用氯仿提取 3 次，24 h，所得浸膏 经碱提酸化后再由氯仿萃取得到三萜酸浸膏，提取率 1. 99% 。 1. 2 超声提取法 从灵芝子实体或孢子粉中提取三萜类物 质时，溶剂回流 提 取 法 因 受 其 结 构 影 响，花 费 时 间 较 长。 而 采用超声波处理能破坏灵芝的致密结构，使提取时间相比溶 剂提取 缩 短 一 半 以 上［19-23］，目 前 已 得 到 广 泛 应 用。张 亮 等［20］用超声波辅助 法，通 过 正 交 试 验 研 究 了 灵 芝 三 萜 的 提 取，得到最优的灵芝三萜提取工艺为乙醇用量 30 倍，提取温 度 60 ℃ ，提取时间 60 min，用碱醇( 无水乙醇加碱) 调 pH 8. 5，可以明显提高乙醇提取灵芝三萜的能力。弓晓峰等［21］ 通过对黑灵芝的溶剂提取法和超声提取法对比研究，得出在 相同的提取时间内，溶剂回流的提取率( 0. 929 4% ) 低于超 声 的 提 取 率 ( 1. 43% ) 。Somayeh Keypour 等［22］ 和 Liu Y L 等［23］采用超声波辅助提取，以氯仿为提取溶剂，提取液过滤 后浓缩得三萜类浸膏，其提取率在 1% ～ 1. 5% 。 1. 3 微波辅助提取法 微波提取技术是近年来发展起来的 新型提取技术，具有选择性高、耗时少、能耗低、排污量少等
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较的结果是超临界 CO2 提取法的提取温度较低且得率较高， 提取率为 1. 72% 。廖幼鸣［33］等用超临界 CO2 加 10% ～ 20% 的乙醇夹带剂直接从灵芝子实体提取灵芝三萜酸，提取物中 灵芝三萜酸的含量达 42. 5% 。钱律余［34］将灵芝子实体和灵 芝孢子用食用酒精浸润后，再加入 30% ～ 50% 的食用酒精的 夹带剂，做超临界 CO2 提取，提取物中三萜含量达 18. 16% 。 2 灵芝三萜类化合物的纯化
第 37 卷第 2 期 2012 年 1 月
Vol. 37，Issue 2 January，2012
灵芝三萜类化合物的研究进展
李晔1* ，朱忠敏1 ，姚渭溪1 ，陈若芸2
( 1. 福建仙芝楼生物科技有限公司 国家食用菌加工技术研发分中心， 福建省药用菌工程研究中心，福建 福州 350002;
2. 中国医学科学院 北京协和医学院 药物研究所 天然药物活性物质与功能国家重点实验室，北京 100050)
20 世纪 80 年代，国内外研究者开始深入研究灵芝化学 成分，并取得一定的成效，迄今为止，已成功分离出 200 多种 化合物［13-14］，并进行 了 分 子 结 构 鉴 定。 但 是，这 些 工 作 都 是在实验室进行的，得到的 化 合 物 量 非 常 少，只 能 开 展 色 谱分析、分子结 构 鉴 定 和 体 外 细 胞 水 平 的 药 理 活 性 筛 选 等研究工作，而难以开展药 理 学、药 效 学 和 毒 理 学 的 深 入 研究，极大影响灵芝三萜 的 继 续 开 发 和 利 用。因 此，研 究 三萜化合物的提取纯化的产业化工艺技术具有重要的理 论意义和实践意义。本文重点介绍了灵芝三萜类化合物 提取纯化工艺、化 学 成 分 及 含 量 分 析 的 国 内 外 研 究 现 状 及其进展，探讨 了 产 业 化 制 备 灵 芝 三 萜 类 成 分 的 工 艺 技 术，旨在进 一 步 推 动 灵 芝 产 业 的 快 速 发 展，并 为 保 健 食 品 、药 品 的 研 究 和 生 产 提 供 科 学 依 据 。
目前，对提取物中三萜类化合物的分离纯化，大多是通过 一种或几种层析法反复富集纯化，结合液相制备色谱或结晶 等分离技术达到分离提纯的效果。
Sri Fatmawati 等［18］ 将 灵 芝 子 实 体 用 氯 仿 提 取，碱 提 酸 化、再用氯仿提取，旋蒸得三萜酸浸膏; 所得浸膏经硅胶柱色 谱富集纯化，氯仿-甲醇、二氯甲烷-甲醇梯度洗脱; 目标组分 由液相制备柱纯化得到灵芝酸 Df 单体。Chen M 等［35］将赤 芝子实体经乙醇回流提取得三萜类粗提物，经硅胶柱层析和 Sephadex LH-20 凝胶色谱反复富集纯化，分别用石油醚-乙酸 乙酯和氯仿-甲醇进 行 梯 度 洗 脱，得 到 一 个 新 的 化 合 物 灵 芝 三醇 M 和灵芝酸 ε。陈若芸等［36］自赤芝孢子粉酸性部分中 分离得到灵芝酸 A，B，C，E 和灵芝三酮。Cheng C R 等［37］将 灵芝子实体经 95% 乙醇回流提取，石油醚、二氯甲烷萃取得 三萜类粗提物; 粗提物先后由硅胶和 Sephadex LH-20 富集纯 化，洗脱液分别 为 氯 仿-甲 醇 和 石 油 醚-氯 仿-甲 醇 梯 度 洗 脱; 再将所得各组分经重结晶和液相制备柱进一步纯化得到三 萜类单体 43 个，其中 6 个为新的灵芝三萜类化合物。还有 很多研究者通过色谱法和液相制备法也分离纯化得到灵芝 三萜类单体［16-17，38-39］。近年来，大 孔 吸 附 树 脂 在 分 离 纯 化 方 面获得了推广应用，钱竹等［40］ 用大孔树脂分离提取发酵液 中灵芝三萜类化合物，通过比较不同种大孔吸附树脂，最终 得出 AB-8 树脂最适合灵芝三萜的分离纯化，同时确立了上 样的最佳条件为 pH 2，体积流量为 2 mL·min － 1 ，梯度洗脱， AB-8 树脂对灵芝三萜的吸附量达 8. 837 mg·g － 1 。 3 灵芝中的新三萜类化合物
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第 37 卷第 2 期 2012 年 1 月
Vol. 37，Issue 2 January，2012
优点，是目前天然产物提取的创新技术。该技术是利用产生 的高频电磁波，穿透组织外层结构而迅速到达组织内部，使 组织内部温度和压力迅速上升，导致细胞破裂，有效成分自 由流出的技术。蒉霄云等［24］利用微波技术研究灵芝三萜类 的提取工艺，得到最佳的工艺条件为: 乙醇体积分数 75% 、提 取温度 75 ℃ 、功率 870 W、液料比 33 mL·g － 1 、时间 17 min， 在此条件下灵芝三萜的平均提取率为 1. 043% ，而其他未经 微 波 处 理 的 超 声 法、回 流 法、浸 提 法 的 提 取 率 分 别 为 0. 617% ，0. 899% ，0. 658% 。Chen Y 等［25］ 通 过 对 黑 灵 芝 中 三萜类成分提取工艺的研究，分别比较了微波提取法和浸提 法、回流提取法、超临界 CO2 流体萃取法和超声提取法，得出 微波提取为最优的提取方案，其最佳提取工艺为 25 倍量的 95% 乙醇作溶剂、提取温度 90 ℃ 、微波功率 800 W、提取时间 5 min，总 三 萜 提 取 率 为 5. 11% ，其 中 三 萜 皂 苷 提 取 率 为 0. 968% 。其他几种提取法的提取效果见表 1。
宋师花等［28］用超临界 CO2 提取灵芝子实体，测定了 3 批 灵芝子实体总三萜的平均值: 总三萜为 1. 176% ，灵芝酸 B 为 0. 053% ，固形物为 2. 024% 。张洁［29］用超临界 CO2 提取灵芝 子实体中三萜化合物，用 HPLC 测定灵芝酸含量，结果表明用 超临界 CO2 提取和用甲醇提取的提取物，在相同 HPLC 检测条 件下得到的色谱图，具有相似的峰形，说明超临界 CO2 可以代 替甲醇作为新 一 代 的 绿 色 萃 取 溶 剂。陈 燕 等［30］ 建 立 超 临 界 CO2 提取法提取和纯化灵芝孢子粉中总三萜化合物的最佳工 艺条件，通过正交试验得到最佳的工艺条件为: 萃取压力 22 MPa，萃取温度 50 ℃ ，萃取时间 2 h。总三萜化合物提取率为 17. 6% 。贾晓斌等［31］通过对超临界 CO2 提取法和醇回流提取 法所提取灵芝三萜类成分的研究，以灵芝酸 B 计算，得出超临 界 CO2 提取法和传统的醇回流提取法提取效果相似，提取率 分别为 0. 133% ，0. 126% 。Ruey 等［32］分别考察了改性剂、温 度以及压力对提取率的影响，并与传统的溶剂法进行比较，比
［摘要］ 作者综述了近年来国内外有关灵芝三萜类化合物的提取纯化工艺、化学成分及含量分析的研究现状及进展。 灵芝三萜类化合物是灵芝中一种重要的药用活性成分，但是由于它在灵芝中的含量低，提取和纯化工艺复杂，目前高纯度的 灵芝三萜化合物的制备量小，依然处在实验室的研究规模，因此，该文进一步探讨了制备灵芝三萜类化合物的产业化技术，旨 在进一步推动灵芝产业的快速发展，为其作为保健食品、药品的研究和生产提供科学依据。