植物细胞培养

MS salts increased to 9.52 g. l-1
Shoots developed on upper surface of explant. No roots or callus.
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激素的影响1
无苄基 腺嘌呤
Profuse development of roots and a reduced number of shoots. Undifferentiated callus is developing at the edges of the explant
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布；有空气交流。
3）原生质体再生法分离细胞
• 原生质体分离方法也有机械分离法和酶 解法这两种。 • 分离时要用渗透压保护剂 哪些渗透压保护剂？ • 形成细胞悬液
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3）原生质体再生法分离细胞
• 原生质体分离方法也有机械分离法和酶 解法这两种。 • 分离时要用渗透压保护剂 蔗糖、葡萄糖、盐类溶液 • 形成细胞悬液
无萘乙酸
Poor shoot development and no roots
萘乙酸有0.1 mg. l-1
Poor shoot development and no roots. Extensive callus generation
萘乙酸升到 5.0 mg. l-1
Profuse development of roots over the explant upper and lower surface, and few shoots. Some callus
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常用植物细胞培养基
2）B5培养基
是 1968 年由 Galmborg 等为培养大豆根细胞而设 计的。其主要特点是含有较低的铵，这可能对不少 培养物的生长有抑制作用。从实践得知有些植物在 B5 培养基上生长更适宜，如双子叶植物特别是木本 植物。
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常用植物细胞培养基
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植物细胞培养在产酶方面的应用
☆应用植物细胞培养可生产下列产酶：
木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、菠萝蛋白
酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶
糖苷酶、β-半乳糖苷酶、糖化酶、酸性转 化酶等
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例：植物细胞培养获得的产物
名称 长春新碱 长春化碱 辅酶Q-10 吗啡 当归根油 茉莉 春黄菊油 苦橙花油 可特因
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价格（美元/kg） 1000000 3500000 600 600 800 500-2000 500 1125 650
用途 抗肿瘤药物 抗肿瘤药物 强心碱 麻醉剂、镇痛剂 香料、中药 香料 香料、药物 香料 麻醉剂、镇痛剂
除酶外，各种色素、药物、香精从植物或培养的细胞中提取
一、植物细胞的特性 动、植物细胞培养和微生物细胞培养比较
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三、植物细胞培养的工艺条件及控制
一）植物细胞培养的工艺流程 • 外植体的选择和处理→愈伤组织 的诱导→细胞的获取→细胞培养 →分离纯化→产物 • 选择外植体、切取片段、消毒处 理，诱导培养生成愈伤组织，分 离细胞后过滤、离心得到能迅速 增殖、无特定结构功能的薄壁细 胞团，振荡培养分离得到单细胞 后悬浮培养，最后再大规模培养
第三章 动植物细胞培 养产酶 之植物
Plant Tissue Culture
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植物体、细胞来源酶的生产方式： 1、从天然植物材料中直接提取
2、从大规模培养的植物细胞中提取
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• 1、从现成植物材料中提取酶的一般步骤
取材→预处理→加提取液捣碎→离心或过滤除去固
体物，收集粗酶液→适当浓缩→纯化→成品加工
加果胶酶
过滤、离心
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注意：大麦，小麦和玉米，很难通过酶解
法使细胞分离。（叶肉细胞伸长，并在许 多地方收缩，细胞间链状互锁结构）
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两种细胞分离方法 机械法和酶解法比较 机械法
1. 细胞不受到酶的伤害； 2. 不用质壁分离； 3. 细胞产量低； 4. 细胞易破。
1. 细胞受到酶的伤害； 2. 要质壁分离； 3. 细胞产量高； 4. 细胞不易破。
无
低 广泛使用
有
非常高 不常使用
有
高 有时使用
细胞或产物浓度
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较高
低
低
总结：植物ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ胞突出特点
• 生产周期长、 • 生长和代谢需要一定 的光照 • 对剪切力敏感、
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二、植物细胞培养的特点 相比从植物原材料中提取 1）提高产率 • 2）缩短周期 • 3）易于管理、减轻劳动强度 • 4）提高产品质量 • 5）其他，如不受季节、生物资 源限制
（1）植物细胞的生长和代谢需要大量无机盐； （2）植物细胞需要多种维生素和植物生长激素； （3）植物细胞需求的氮源一般为无机氮源； （4）植物细胞一般以蔗糖为碳源、浓度为2-5%。
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植物细胞培养基
国际上流行的培养基有几十种，常用的 培养基有：
MS培养基、B5培养基、White培养基、
无蔗糖
Very few shoots have developed on the explant. No roots and no callus愈伤组织.
蔗糖浓度只有1%
Shoots developed on edges of upper surface, and some root development has occured
转速30-150rpm 2-3cm冲程
防细胞破裂
愈伤组织
液体培养基 摇床振荡
悬浮培养
质地疏松，细胞分散程度大； 质地紧密，细胞分散程度小，不适于悬浮培养
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2、悬浮培养的基本形式
分批培养 连续培养
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分批培养/成批培养（Batch culture）
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3. 植物细胞培养基的配制
配置方法： 先配母液，按比例稀释、混合 常见母液：不同稀释倍数 大量元素母液 微量元素母液 铁盐母液 维生素母液：维生素和某些氨基酸 植物激素母液：吲哚乙酸、萘乙酸、苄基腺嘌呤
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三） 培养温度和pH等条件
• 温度：适宜温度20-25℃，酶合成温度因植物种类而异 • pH: 植物细胞培养要求稳定pH，一般pH5.8-6.1最好 • 植物细胞培养过程中pH变化不大 • 溶氧、通气搅拌: 细胞比较大，较脆弱，对剪切力敏 感，且耗氧速率较慢，所以通气和搅拌不要太强烈 • • • • 光照：对一些植物酶有诱导作用或抑制作用。 刺激物：在酶合成时期，适当添加。 前体的添加：对一些植物酶有诱导作用。如苯丙氨酸 刺激物：在酶合成时期，适当添加。微生物细胞碎片 细胞壁碎片、酵母葡聚糖、果胶酶、纤维素酶、
项目 大小（μm） 微生物 1-10 动物细胞 10-100 植物细胞 20-300
悬浮生长
营养要求 生长速率
可以
简单 快，0.5-5h
大部分附着
非常复杂 慢，15-100h
可以，易成团
较复杂 慢，24-74h
代谢调节
环境敏感
内部
忍受范围广
内部、激素
无细胞壁非常敏感
内部、激素
能忍受广泛范围
细胞分化
剪切力敏感 传统变异、筛选
• 2、植物细胞培养
在离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置 于液体培养基中，进行振荡培养，得到分散成游离 的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得 大量细胞群体的一种技术。
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提取分离法
植物来源的物质的生产
采集植物
各种生化技术
有用的物质提取 分离纯化得所需物质
特点：提取分离法设备简单，但受到原料来源的限制
N6培养基、KM-8P培养基
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植物细胞培养基
常用培养基简介— 1）MS培养基
1962 年由 Murashige 和 Skoog 为培养烟草细胞而 设计的。特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定 的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足 植物的营养和生理需要。它的硝酸盐含量较其他培 养基为高，广泛地用于植物的器官、花药、细胞和 原生质体培养，效果良好。有些培养基是由它演变 而来的。
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外植体和愈伤组织
外植体：由活体（in vivo)植物体上提取下 来的，接种在培养基 上的无菌细胞、组织、 器官等。 愈伤组织：在人工培 养基上由外植体上形 成的一团无序生长状 态的薄壁细胞。
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1.外植体的选取、处理，及愈伤组织的 获取： 外植体剪取部位，消毒方法 愈伤组织的生长部位 愈伤组织的挑取
酶解法
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2）由愈伤组织诱导分离细胞
茎段
步骤1、2：
1 诱导产生愈伤组织； 2 愈伤组织反复继代，使 组织不断增殖，提高愈 伤组织的松散性；
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继代
悬浮
步骤 3：
摇床用于振荡
3（Suspension culture) 将愈伤组织在液体培养 优点：细胞团成小 基中培养，建立悬浮培 细胞团或单细胞； 在培养基中均匀分 养物
3）White培养基
是 1943 年由 White 为培养番茄根尖而设计的。 1963年又作了改良，称作White改良培养基，提高了 MgSO4的浓度和增加了硼素。其特点是无机机盐数量 较低，适于生根培养。
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常用植物细胞培养基
4）N6培养基
是 1974 年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培 养而设计的。其特点是成分较简单，KNO3和（NH4） 2SO4 含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其 他植物的花药培养和其他组织培养。
苄基腺嘌呤 有 0.1 mg. l-1
More balanced development of roots and shoots. However, undifferentiated callus is developing at the edges of the explant
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激素的影响2
• 最后，分离纯化、提取
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二） 植物细胞培养的培养基
植物组织培养营养条件-培养基 (Culture Medium)
培养基是植物组织培养的重要基质。 培养基的成分主要可以分水、无机盐、 有机物、天然复合物、培养体的支持材 料等五大类。
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二）植物细胞培养的培养基
• 培养基
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蔗糖浓度有5%
Shoots have developed over the surface of the explant, along with roots from the lower surface. The result is comparable with the control medium
不同营养条件对植物组织培养的影响
No MS salts
No sign of regeneration from explant at all.
MS salts reduced to 0.47 g. l-1
Some root growth but reduced development of shoots
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2.植物细胞的获取
有直接分离法、愈伤组织诱导法和原生 质体再生法 1）直接分离法 直接从外植体中分离得到细胞，有机械 法和酶解法这两种。
A。机械法：只有薄壁组织排列松散，细胞 间结触点很少时用机械法分离叶肉细胞才能 取得成功。
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B。酶解法
酶解法：Takebe等（1968）最早报道：用 果胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞
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MS培养基配制方法
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相关知识
不同营养条件对植物组织培养的影响
生长良好的愈伤组织
The explant is completely covered with green shoots, and roots are developing on the lower surface
含义：将愈伤组织培养在一定容积 的密闭容器中进行培养。它是进行 细胞生 长和细胞分裂的生理生化研 究常用的培养方法。 但要进行下一批培养，则生长一定 时间后，需要继代转移。
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悬浮培养特点
培养基体积固定 • 培养过程中，细胞生长，其数 目不断发生变化，呈S型增长。 • 必须适当搅拌
•
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补充：细胞悬浮培养 Suspension culture
特点 1. 细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞 群体，适于大规模培养； 2. 能够提供大量较为均匀的细胞，为研究 细胞的生长、分化创造方法和条件。 必须指出 悬浮培养中既有单细胞，也有细胞团。
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1、起始悬浮液的制备