彗星电泳方法整理
彗星试验步骤
彗星试验步骤1.5.4 彗星试验（单细胞凝胶电泳试验）：参照文献[i]，略加改动，进行碱性单细胞凝胶电泳，具体如下。
1.5.4.1 制片将0.6%的NMPA（用PBS配制）于微波炉中加热融化后，浸泡磨砂玻片，用吸水纸将玻片滑面及四周吸干，自然晾干备用。
1.5.4.2 铺胶取1.5.3中所备细胞悬液10μl，向其中加入70μl 37℃0.7%LMPA（用PBS配制），混匀后迅速滴于37℃预热的玻片上，立即盖上盖玻片，4℃固化10min。
1.5.4.3 裂解轻轻取下盖玻片，将玻片浸于新鲜配制并预冷的细胞裂解液中，4℃避光裂解1h。
1.5.4.4 解旋从裂解液中取出载玻片，用PBS浸泡玻片3×3min。
用纸巾吸去玻片上残留的液体，置于水平电泳槽中，加新鲜配制的碱性电泳缓冲液至高于玻片表面3mm 以上，避光解旋30min。
1.5.4.5 电泳电压25V，调整液面高度使电流达到300mA，电泳25min。
1.5.4.6 漂洗及染色电泳完毕，取出玻片，用PBS浸泡2×15min，以中和强碱。
用纸巾吸去玻片上残留的液体，然后滴加20μg/ml的EB20μl，盖上盖玻片，立即置荧光显微镜下观察。
以上步骤尽量在黄光下或暗处进行，避免其他原因所致的DNA损伤。
每一剂量水平制片2张。
1.5.4.7 结果观察荧光显微镜下200倍观察，激发波长515~560nm，发射波长590nm。
每一剂量水平随机观察100个细胞，记录拖尾细胞数。
计算拖尾细胞率（以下简称拖尾率），拖尾率＝(拖尾细胞数/100)×100%。
每一剂量水平用目镜测微尺测量30个拖尾细胞的全长和头长，拖尾细胞尾长（以下简称尾长，tail length，TL）＝全长－头长，计算各剂量组的平均尾长。
表1.1 MMS、MMC和NaN3的WTK1细胞彗星试验结果Table 1.1 Comet assay of MMS, MMC and NaN3 with WTK1 cell lineChemicalConc.(μg/ml)0h 20hRG a (%)Cometcell (%)TL(x±s, μm)RG a(%)Cometcell (%)TL(x±s, μm)MMS 0 100.0 6.0 3.50±1.69 100.0 3.0 3.67±3.130.625 97.2 10.0 10.38±2.92** 98.8 8.0 6.50±3.05**1.25 100.4 18.0* 24.25±4.88** 97.7 11.0 8.90±3.52**2.5 96.4 33.0** 32.08±7.40** 88.3 15.0** 18.62±4.04**5 94.8 60.0** 52.33±5.68** 86.8 44.0** 46.00±5.36** K2Cr2O7147 92.4 100.0** 78.70±4.39** －－－MMC 0 100.0 6.0 2.57±1.76 100.0 5.0 1.75±1.760.0625 100.4 6.0 3.70±1.86 96.2 9.0 3.62±1.920.125 108.1 10.0 4.04±1.52 54.6 19.0** 5.50±1.81**0.25 104.5 11.0 3.92±1.42 52.7 50.0** 22.87±3.95**0.5 87.8 17.0* 4.93±3.63 48.8 64.0** 50.17±5.80** K2Cr2O7147 105.4 100.0** 68.19±5.15** －－－NaN30 100.0 8.0 3.12±1.69 100.0 9.0 2.15±1.67 250 90.0 7.0 3.03±1.48 99.0 6.0 2.85±1.58500 102.5 8.0 3.35±1.16 97.7 9.0 3.10±1.831000 89.4 14.0 4.09±1.57 88.3 11.0 3.16±1.292000 92.2 56.0** 14.93±4.54** 86.8 52.0** 11.25±1.38** K2Cr2O7147 92.5 100.0** 72.33±6.12** －－－a Relative growth compared with corresponding solvent control*P<0.05 **P<0.01, compared with corresponding solvent control。
彗星试验步骤范文
彗星试验步骤范文彗星试验是一种用于检测和评估新药物或化合物的毒性和安全性的实验方法。
下面是彗星试验的步骤：1.实验前准备：-准备细胞培养物：选择一种常用的哺乳动物细胞系，如人肺细胞株。
培养细胞，并确保细胞处于稳定的生长状态。
-准备测试物溶液：将待测试的化合物溶解在适当的溶剂中，以得到所需的浓度。
根据先前的研究或文献，确定起始浓度和待测物的浓度范围。
2.计算细胞培养物数量：根据实验设计和所需的浓度范围，计算出需要的细胞数量。
3.处理细胞：将细胞分为多个处理组和对照组。
每个处理组使用不同浓度的待测物处理细胞，对照组仅使用培养基或溶剂作为对照。
4.孵育细胞：将处理后的细胞培养物放入恒温培养箱中孵育。
按照特定的条件（温度、湿度、CO2浓度等）进行培养。
5.细胞收集：在设定的时间点，收集细胞并通过离心将细胞沉淀下来。
清除培养基及其他杂质。
6.细胞裂解：使用一种适当的裂解液（如悬浮剂），将细胞裂解并释放核酸。
7.准备凝胶：准备琼脂糖凝胶，通常是用琼脂糖粉末和缓冲液混合制备。
8.凝胶电泳：将裂解液样品和标准DNA样品分别加载到琼脂糖凝胶孔中。
使用电场使DNA片段从样品中迁移出来。
9.DNA染色：使用DNA染料（如Ethidium bromide）染色凝胶，以可视化DNA片段。
10.凝胶成像和分析：使用紫外线照明或分子影像系统观察凝胶上DNA片段的大小和形状。
使用适当的软件测量和分析DNA损伤程度。
11.数据分析：将实验结果转化为数值形式，使用统计学方法进行数据分析，如计算DNA损伤指数或计算细胞生存率。
比较不同浓度的样品与对照组的差异。
12.结果解读：根据实验结果，评估待测物的毒性和安全性。
根据不同浓度的处理组的DNA损伤程度，确定药物是否具有潜在的毒性。
13.结论和报告：对实验结果进行解读，并得出结论。
根据实验结果撰写报告，包括实验设计、方法、结果和结论。
需要注意的是，彗星试验作为一种初步的毒性评估方法，通常需要与其他细胞毒性测试方法结合使用，以全面评估待测物的安全性。
单细胞dna彗星实验步骤
单细胞dna彗星实验步骤彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1～3]，并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。
本实验对Singh等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。
用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet，UV)，属于UVC波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7～9]，诱导K562细胞DNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度，验证改良的实验系统是否可靠，同时筛选并评价DNA损伤的分析指标。
1 材料与方法1.1 细胞K562细胞，来源于第四军医大学免疫学教研室，37 ℃、5％CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。
1.2 紫外线照射装置紫外消毒灯(ZSZ-20型，20 W，天津市紫晶特种光源有限公司)。
1.3 主要试剂和仪器培养基：10％新生牛血清(杭州四季青公司)，90％RPMI-1640培养液(Hyclone公司)；双抗(青、链霉素，100 UI/ml)；Triton X-100(Genview分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMC分装)；常熔点琼脂糖(Spanish 分装)。
其余生化试剂均为分析纯。
电泳仪：由西北大学物理系提供；电泳槽：DYC33A型(北京市六一仪器厂)；显微镜：Leica DM LB 2 (Leica 公司)；彗星图象分析软件：CASP软件(casp-1.2.21.4 实验分组及UV处理收集对数生长的K562细胞，台盼蓝染色计数，细胞活力大于95％，用Hank's(pH7.4)调整细胞密度至1×105/ml，接种于塑料培养皿中(ф=35 mm，2 ml/plate)，然后进行紫外线照射(0.3 mW/cm2)。
实验分为对照组和8个照射组，各照射组分别照射3、5、10、40，60、120、180、240 s，对照组不进行紫外线照射，之后进行彗星实验。
单细胞凝胶电泳试剂盒（彗星实验）说明书
单细胞凝胶电泳试剂盒（彗星实验）使用说明书一 单细胞凝胶电泳实验介绍单细胞凝胶电泳( Single Cell Gel Electrophoresis, SCGE) 又名彗星试验(comet assay)， 1984 年起用于检测的真核细胞的DNA 断裂和修复，具有方法灵敏、快速优点，同时既可以定性又可以定量，目前DNA 损伤检测的其他方法（Giemsa 染色法,TUNUL 法、DNA 电泳梯度法、流式细胞检测法）是无法比拟的。
彗星实验是检测DNA 微损伤和修复的新方法，得到国际遗传毒性检测程序工作会议认可。
彗星实验是简单、快捷检测DNA 微损伤的方法，被广泛应用于遗传毒理、放射生物学、生物监测、癌症化疗和细胞凋亡、衰老等领域。
是一个十分成熟的技术，逐渐成为快速检测DNA损伤的一种方法，尤其应用于新药开发、保健品开发、化妆品开发、环境监测和毒理学研究等领域。
彗星实验具有以下优点：1 适用范围广，不仅适用于静止状态的细胞，且对T 和B 淋巴细胞敏感；2 所需实验器材较少，一台荧光显微镜和一套电泳装置即可完成彗星实验；3 实验流程短，一天可完成一个实验流程，且图像获取和数据分析可隔日完成；4 安全性好，避免了同位素的使用；5 在单细胞水平上对DNA 损伤进行可视性检测；6 准确性好、灵敏度高；7 属于新技术，客观实际，国际遗传毒性学术委员会认可。
二、试剂盒组成（见试剂盒内）三、试剂使用说明（见试剂盒内）四、操作步骤1.各种细胞用冰冷的PBS 洗一次，离心收集，用PBS 重悬，密度为1×104-5个/ml。
2.铺胶：下述各浓度琼脂糖凝胶均用PBS 配制。
3.第1 层凝胶的制备：将加热熔解的正常熔点琼脂糖(NMA)，冷至45-60℃，取适量铺于载玻片CometSlide上，再置4℃下10min 使NMA 凝固。
也可以先铺胶，晾干后无尘存放，1周内使用（据经验，此法较优）。
4.第2 层凝胶的制备：低熔点琼脂糖LMA在60-70℃水浴加热至少20min 使之完全溶化，冷至37℃（可以放置于细胞培养箱中或水浴箱冷却至37℃，低熔点琼脂糖LMA在37℃可维持3小时）。
单细胞凝胶电泳——彗星实验方法的建立、改良与应用
陕西师范大学硕士学位论文单细胞凝胶电泳——彗星实验方法的建立、改良与应用姓名：罗明志申请学位级别：硕士专业：动物学指导教师：齐浩20050501单细胞凝胶电泳——彗星实验方法的建立、改良与应用罗明志摘要单细胞凝胶电泳（ｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｓｉｓ，ＳＣＧＥ），又称彗星实验（ｃｏｍｅｔａｓｓａｙ），是一种在单细胞水平进行ＤＮＡ损伤的检测方法，具有简便、灵敏、快捷、样品用量小等优点，广泛用于遗传毒性检测、环境毒性检测、分子流行病学和ＤＮＡ损伤与修复等研究领域。
我们在本实验室建立了单细胞凝胶电泳技术，并对部分操作流程进行了改良，包括（１）制胶方法改良；（２）增加水洗；（３）进行梯度酒精脱水。
在上述改良过程中，我们用“灌胶”法在载玻片上制胶，替代了传统的使用磨砂载玻片上“三明治”制胶，解决了彗星实验中常见的脱胶现象，脱水后有利于获得平整胶面：在裂解后增加了水洗步骤，以消除裂解液中的高盐和去垢剂对后续实验操作的影响；采用直流稳压电源进行单细胞电泳，保证了实验结果的可重复性；对染色的条件进行了筛选，确定了使用ＥＢ作为细胞ＤＮＡ的荧光染料；以ＣＡＳＰ（免费）作为彗星图像的分析软件，建立了图像分析的方法。
这些实验步骤的改良以及实验流程的优化或标准化．简化了操作程序，节省了时间，并使结果分析更加简便。
为了验证上述改良后的实验系统是否可靠，我们用紫外线作为损伤因子处理细胞，诱导细胞ＤＮＡ损伤，然后用彗星实验检测这一损伤。
从这～阳性模型的结果分析来看，发现细胞损伤呈现出很好的时间依赖性，表明该实验系统的可靠性。
我们同时筛选并评价了彗星实验中有关的ＤＮＡ损伤分析指标，发现ＴａｉｌＬｅｎｇｔｈ，ＣｏｍｅｔＬｅｎｇｔｈ，ＴａｉｌＭｏｍｅｎｔ和ＯｌｉｖｅＴａｉｌＭｏｍｅｎｔ作为ＤＮＡ损伤的评价指标比较可靠。
我们建立了肝细胞的组织块原代培养系统。
在建立肝细胞组织块原代培养实验流程中，我们对实验的各个步骤，例如组织块贴壁需要的时间、细胞生长所需的培养基种类、培养基添加剂以及动物组织供体年龄等进行了筛选，建立了小鼠肝细胞组织块的原代培养系统。
彗星实验
彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1～3]，并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。
本实验对Singh 等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。
用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet，UV)，属于UVC波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7～9]，诱导K562细胞DNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度，验证改良的实验系统是否可靠，同时筛选并评价DNA损伤的分析指标。
1 材料与方法1.1 细胞K562细胞，来源于第四军医大学免疫学教研室，37 ℃、5％ CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。
1.2 紫外线照射装置紫外消毒灯(ZSZ-20型，20 W，天津市紫晶特种光源有限公司)。
1.3 主要试剂和仪器培养基：10％新生牛血清(杭州四季青公司)，90％RPMI-1640培养液(Hyclone公司)；双抗(青、链霉素，100 UI/ml)；TritonX-100(Genview分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMC 分装)；常熔点琼脂糖(Spanish分装)。
其余生化试剂均为分析纯。
电泳仪：由西北大学物理系提供；电泳槽：DYC33A型(北京市六一仪器厂)；显微镜：Leica DM LB 2 (Leica 公司)；彗星图象分析软件：CASP软件(casp-1.2.2，/index.php下载)；CO2培养箱：BB16HF型(上海力申科学仪器有限公司)；环地牌紫外辐照计(北京师范大学光电仪器厂)。
1.4 实验分组及UV处理收集对数生长的K562细胞，台盼蓝染色计数，细胞活力大于95％，用Hank's(pH7.4)调整细胞密度至1×105/ml，接种于塑料培养皿中(ф=35 mm，2 ml/plate)，然后进行紫外线照射(0.3 mW/cm2)。
彗星试验方法
试剂配制
1.磷酸缓冲液（PBS）2.琼脂糖溶液 3.裂解液 4.Tris-Hcl 缓冲 液 (pH=7.5) 5. 电 泳 缓 冲 液 （ pH>13 ） 6. 中 和 Leabharlann 7. 染 色 液 8.0.5%台盼蓝
载玻片凝胶体的制备
1.55ul 正常熔点琼脂糖铺底胶、 2.110ul 低熔点琼脂糖铺第一层胶、 3.75ul 琼脂糖细胞悬浮液铺第二层胶、 4.75ul 低熔点琼脂糖第三层胶
染色
室温下待玻片胶体表面水分干燥后，滴加 30μ l 5μ g/ml 的溴 化乙锭到胶体表面，盖上盖玻片染色。20 分钟后就可用荧光 显微镜镜检。
观察
将载玻片编为盲片，在荧光显微镜下用 515～560nm 的激发波观察，目镜 10×， 物镜 20～40×。每个处理制作两张载玻片凝胶体，每个计数 50 个细胞，共计 100 个。用来统计细胞拖尾率用 X2 比较对照组和处理组的差异；每个载玻片凝胶体用 图像采集系统采集 25 个细胞，共采集 50 个细胞。
分析
用 CASP 图像分析软件来分析彗星图像。
细胞的裂解
将预冷的电泳液倒入电泳槽中，液面高于载玻片 0.25cm，保 证液面浸没所有玻片，电泳槽置于 4℃冰箱中，避光解旋 30 分钟。
DNA 电泳
室温下，稳压 25V，电流 300mA，电泳 30 分钟。电流可通 过调节液面高低来调节。电泳槽放置到托盘中，四周铺冰块来 降低电泳液的温度。
中和
从电泳槽中取 出玻片， 放置到方 形盒中，倒 入预冷的 0.4mol/LTris-HCl 缓冲液，置于冰箱中，中和 5 分钟后，倒掉 反应液，重新加入预冷的 Tris-HCl 缓冲液。重复三次，每次 反应 5 分钟，共计 15 分钟。
彗星电泳
每片滴加60ulPI( 5ug/ml) 染色20min.用蒸馏水 洗一下即可观察。
取出玻片放于无Ca2+、Mg2+的PBS中洗1-2次，吸
水纸吸干； 每片载玻片上加60μl 2μg/ml PI染色15min， 蒸馏水冲洗盖玻片观察并拍照（Olympus荧光显 微镜绿色激发光下观察）；
用casp. exe软件分析细胞拖尾变化
思考题
彗星实验的原理？ 彗星实验的评价方法？
步骤
γ射线照射细胞后，分别于照射后0h，30’， 1h，2h，4h收集细胞并做细胞计数，以 适量PBS重悬细胞；
胶片制备
取100 ul 用微波炉熔解的 1%正常熔点琼脂糖(NMA)滴 在预热的(45℃~70℃)磨砂载玻片上，迅速盖上干净的 盖玻片，4℃ 15分钟，(第一层) 将琼脂糖凝固后，取下盖玻片。将细胞悬液（约3000 个cell/片）与180ul0.65%低熔点琼脂糖溶液在37℃混 匀后，取一半液体滴在第一层的琼脂糖上（2个/载）， 盖上盖玻片，4℃，15min.( 第二层越薄越好，使细胞 尽量在一个平面上) 取下盖玻片，在第二层上滴加60ul0.65%低熔点琼脂糖， 4℃，15min。（第三层）
彗星电泳检测辐射诱发DNA损伤
目的
掌握彗星电泳的原理 熟悉彗星电泳的操作方法 掌握彗星电泳的评价方法
原理
单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis， SCGE)是由Ryberg B和Jonhanson K J首先提出后又经 Singh N P和Olive P I进一步完善的一种在单细胞水 平上检测DNA损伤与修复的方法。因其细胞电泳形状 颇似彗星，又称彗星试验(comet assay)。它是一种 测定和研究单个细胞DNA链断裂的新电泳技术，与传 统方法相比，其简便、快速、灵敏、样品量少、无需 放射性标记，具有极高的实用价值。目前该技术已广 泛地应用于体内、体外各种有核细胞经受试物诱导的 DNA损伤和修复的研究 。
PH9143 DNA损伤试剂盒彗星电泳法实验方法
PH9143|DNA损伤试剂盒（彗星电泳法）DNA Damage Assay kitCatalog No：PH9143Size：☐20T Store at4℃简介DNA在自由基（如·OH）的攻击下容易发生损伤，即脱氧戊糖遭到破环，磷酸二脂键的断裂，碱基的破环或脱落，便可进一步产生单链断裂或双链断裂。
将细胞固定于低熔点琼脂糖中，取少量细胞涂在载玻片上，用碱高盐溶液破坏细胞膜，再用碱溶液使DNA分子解旋。
将载玻片置于电泳液中，在电场的作用下，DNA分子向阳极移动。
如果DNA损伤严重，碎片多，则电泳速度快。
未受损伤的DNA大分子则由于细胞膜的阻隔，滞留在原处。
用PI染色或银染，可观察到DNA受损的细胞形同彗星现象，作定性分析。
也可用相关的软件作定量分析。
组分Components20Assay StorageLysis Bufffer100mL4℃DMSO8mL4℃正常熔点琼脂糖NMA30mg4℃低熔点琼脂糖LMA30mg4℃Propidium Iodide（PL）400ul4℃避光自备试剂和仪器低速离心机、水平电泳仪、荧光显微镜、37℃和45℃恒温水浴箱、载玻片、盖玻片、平皿、微量移液器、1.5ml Microube、0.4mmol/LTris-HCl（pH7.5）缓冲液、PBS使用参考1、细胞用冰冷的PBS洗一次，离心收集，用PBS重悬使其密度为1x106个/mL；2、铺胶：下述各浓度琼脂糖凝胶均用PBS配制：第1层凝胶的制备：将载玻片的磨砂面向上，45℃预热，将预热45℃的100μL的0.5%正常熔点琼脂糖（NMA）铺于载玻片上，盖上干净的盖玻片，再置4℃下10min使NMA凝固。
第2层凝胶的制备：将10μL细胞（约104个）和75μL的0.7%低溶点琼脂糖LMA（在37℃下水浴加热至少20min使之完全溶化）混合均匀。
然后，轻轻揭去盖玻片，迅速将含细胞的LMA滴到第1层琼脂糖上，立即盖上另一干净盖玻片，置4℃10min使第2层LMA凝固。
彗星电泳法检测细胞凋亡原理
彗星电泳法检测细胞凋亡原理细胞凋亡是细胞生命周期中的一种自然过程，也是一种重要的细胞死亡方式。
在细胞凋亡过程中，细胞内会发生一系列的形态和生化变化，如细胞核染色质凝聚、细胞核碎裂、胞质内溶酶体释放等，这些变化是细胞凋亡的特征。
彗星电泳法（Comet Assay）是一种常用的细胞凋亡检测方法，它可以通过检测DNA断裂来判断细胞是否发生凋亡。
这种方法以细胞的DNA为基础，通过电泳的方式使DNA在凝胶上产生“彗星尾巴”状的形态，从而判断细胞凋亡的发生程度。
彗星电泳法的原理是利用DNA在电场作用下的迁移能力差异来检测细胞凋亡。
首先，将待检测的细胞经过相应处理，如破碎细胞膜、去除核膜等，使细胞内的DNA暴露在外。
然后，将处理后的细胞混合在低熔点琼脂糖中，制备成凝胶。
接下来，将凝胶浸泡在含有碱性溶液的电泳缓冲液中，形成电泳系统。
在电场的作用下，DNA 会向阳极移动，形成“彗星尾巴”状。
最后，通过染色和显微镜观察，可以看到DNA的形态变化，进而判断细胞凋亡的程度。
彗星电泳法的检测结果可以通过计算尾长、尾百分比、尾状因子等参数来评估细胞凋亡的程度。
尾长是指从头部到尾部的距离，尾百分比是指尾部长度占总长度的百分比，尾状因子是尾长与头部直径的比值。
通过对这些参数的测量和分析，可以得出细胞凋亡的程度和类型。
彗星电泳法具有灵敏性高、操作简便、结果直观等优点，因此被广泛应用于细胞凋亡的研究和药物筛选等领域。
它可以帮助科研人员更好地理解细胞凋亡的机制，以及评估药物对细胞凋亡的影响。
此外，彗星电泳法还可以用于毒理学研究、环境污染监测等方面。
彗星电泳法作为一种常用的细胞凋亡检测方法，通过检测DNA断裂来判断细胞凋亡的发生程度。
它具有操作简便、结果直观等优点，并被广泛应用于细胞凋亡研究和药物筛选等领域。
通过彗星电泳法的应用，科研人员可以更好地理解细胞凋亡的机制，为相关疾病的治疗提供新的思路和方法。
彗星实验
Comet Assay 彗星分析系统软件功能:彗星试验-单细胞凝胶电泳Single cell gel electrophoresis是一种快捷、高灵敏度的检测DNA受损的方法.Comet Assay 专业彗星试验图像分析软件,提供专业快速的测量方法。
测量指标包括头半径，尾长度，积分光密度，头/尾DNA含量比例，尾矩，Olive 矩等多种参数。
具有自动或手动调节分割彗星头部和尾部功能同时提供对双染色系统的分析系统可广泛用于环境毒理学中对DNA具有损伤作用的分析：如紫外光、电离辐射、氧自由基等因素造成的DNA损伤。
以及细胞凋亡，抗癌药物的药物毒理学研究，遗传毒理研究和肿瘤治疗的跟踪监测等单细胞凝胶电泳(彗星试验):原理、应用和局限性彗星试验：原理、应用和局限性1. 前言过去十年中，彗星试验或单细胞凝胶电泳（SCGE）已成为一个评定DNA损伤的标准方法，广泛应用于遗传毒性试验、人类生物监测和分子流行病学、生态毒理学以及DNA损伤修复的基础研究，且因其简单、灵敏、多功能、快速、经济实用而赢得了广大科研工作者的青睐，和其有关的文献数目逐年上升。
在应用彗星试验时不会过多去考虑它如何运作和它提供何种信息，因为它在论证DNA损伤中的成功已足以证明它的价值。
这一点实在太可惜，因为它不仅能告诉我们细胞内存在的损伤的类型，而且能告诉我们损伤的程度。
尽管彗星试验是检测DN A断裂的基本方法，但由于对特异性核酸内切酶损伤的引入使其可以检测紫外线诱导的嘧啶二聚体，氧化碱基和烷基化损伤。
2.检测原理和检测指标2.1 背景二十世纪七十年代，Peter Cook和其同事们制定了一种用非离子去污剂使细胞溶解来研究核结构的方法。
这种处理除去胞膜、胞质和核质，并使核小体破裂（几乎所有的组蛋白均被浓盐提取），剩下的就是由核基质或RNA、蛋白质组成的支架以及DNA所构成的类核，其DNA的双螺旋以核小体的组蛋白为核心形成负超螺旋结构。
超螺旋的存在使DNA不能自由旋转，Cook 等提出一个模型，DNA间断的附加于基质，有效的形成一系列环状、而不是线性分子。
电泳
单细胞凝胶电泳技术，又称彗星试验（comet assay)是19世纪60年代在核沉淀和光环测试等检测技术基础上演化而来的一种检测真核细胞DNA损伤与修复的方法1988年Singh首次提出碱性电泳技术，用来检测单链DNA断片在1995年单细胞凝胶电泳技术我国逐渐开展SCGE的原理•细胞核中的DNA为超螺旋结构并且致密，在强碱的条件下，DNA双股结构打开，单链上的断片可以释放出来•包埋在凝胶中的细胞形成一个小室，细胞膜破裂后细胞的其他成分可以扩散到裂解液中，而DNA只能留于小室内•在电场力的作用下带负电荷的影像•DNA向阳极泳动，荧光染色后可观察到彗星样SCGE的操作流程实验设计、染毒→制备细胞悬液→制片→铺胶→裂解→解螺旋→电泳→中和、染色→观察结果和记录SCGE的实验方法与技术 溶液的配置碱性裂解液：2.5M NaCl、100mMEDTA-Na2、100mMTris、1%Triton X-100、10%DMSO(后两者临用前加）碱性电泳液：300mM NaOH,1mMEDTA-Na2中和液：0.4M Tris-HCL溴乙锭应用液：20ưg/ml实验步骤 染毒、试验分组及对照▪体外试验：受试物+细胞（培养基或琼脂糖细胞悬液）染毒时间H2O215分钟，其他一般1小时▪体内试验：受试物+动物（适当途径）染毒时间1-72小时 染毒、试验分组及对照▪体外试验：受试物+细胞（培养基或琼脂糖细胞悬液）染毒时间H2O215分钟，其他一般1小时▪体内试验：受试物+动物（适当途径）染毒时间1-72小时体外试验：受试物+细胞（培养基或琼脂糖细胞悬液）染毒时间H2O215分钟，其他一般1小时体内试验：受试物+动物（适当途径）染毒时间1-72小时至少设3个剂量，外加1个阳性对照、1个阴性对照，每组至少3-5只动物，每个样品设2个平行样对照阴性对照：不加任何处理的细胞悬液，或受试物所用溶剂处理的细胞悬液。
体外试验用溶剂做对照阳性对照：体外用双氧水、体内常用环磷酰胺样品的制备淋巴细胞：用淋巴细胞分离液全血细胞：20μl全血＋0.4-1ml HBSS混匀，1500rpm离心后，留沉淀，加100μl LMA 骨髓细胞：1ml HBSS冲洗骨髓腔，1500rpm离心，留沉淀，加100 μl LMA※固体组织：将所取组织块放在5ml HBSS的平民中剪碎，取20 μl 与LMA混合培养细胞：取20 μl 悬液与LMA混合备用制片载玻片及盖玻片的处理新玻片：1%稀盐酸和酒精中浸泡，过双蒸水旧玻片：洗净后过双蒸水，无水酒精玻片清洗不彻底，容易导致脱胶在荧光显微镜下挑选无自发荧光背景暗的玻片减少干扰预制载玻片配置0.6%NMA，注意保温，将载玻片垂直浸入2s后取出，擦去多余的琼脂糖，水平放置使凝固，可放在80°C孵育至干燥，保存铺胶70-100 μl 0.6%-1.5%NMA↓加盖玻片，4 °C，5-10min，去盖玻片↓含有10-20 μl 细胞悬液的50-100 μl 0.5%-1%LMA↓加盖玻片，4 °C，5-10min，去盖玻片↓60-80 μl 0.5%LMA↓加盖玻片，4 °C，5-10min，去盖玻片 裂解去盖玻片，将载玻片放入新配置的4 °C预冷30-60min的裂解液中，4 °C避光裂解1小时以上解螺旋将裂解后的玻片取出，用PBS冲洗，吸干液体后将玻片并列置于电泳槽阳极附近，玻片间不留空隙，加电泳液液面高出玻片0.2cm，电泳槽放置于冰水浴中20min电泳电压25v，电流300mA，4 °C电泳20min中和与染色将玻片取出倒入中和液，中和两次，每次10min，用EB在暗处染色15min,然后可漂洗10min，然后可观察。
厦门大学-操作讲义-实验八.彗星试验单细胞凝胶电泳(SCGE)
用浓度为2μg/ml的PI染色液4℃染色5min。染色结束，用 预冷的PBS漂洗2min，弃PBS，50%甘油保湿。3h内阅完 玻片。
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操作步骤
(10)镜检
使用荧光正置显微镜观察玻片，仪器参数设置为490nm激 发光(蓝绿色，看见红色荧光)、200倍观察、TIFF格式保存 文件。阅片时要保持玻片湿润，先低倍大体观察，再选择 有代表性区域阅片。
应用：是检测DNA微损伤的新方法， 在国际遗传毒性检测程序工作会议上已得到认可。 检测诱变剂、射线等对DNA的损伤、 监测环境污染物对机体的遗传损害、 研究毒物致癌机制，等
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单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis, SCGE)
特点： ①实验流程短(一天可完成实验); 图像获取和数据分析可隔日 完成； ②在单细胞水平上对DNA损伤进行可视性检测； ③准确性好、灵敏度高。
铺好的玻片完全浸入临用配制的预冷细胞裂解液中，4℃ 水 平放置，裂解2 h。
(5) 解链
将载玻片小心浸入预冷的解链电泳液中，4℃水平放置， 解 链0.5h。
(6) 电泳
接通电源，在300mA和25V条件下电泳20min。(调节液面)
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操作步骤
(7) 中和
电泳结束，将载玻片小心转移到托盘，浸入中和液中和 20min。中和后用冰水洗2次，2min/次。
(11)单细胞凝胶电泳结果分析
每片随机观察100个细胞，计数彗星细胞百分率，用目镜 测 微尺测量彗星细胞尾矩，进行统计学分析。 统计学分析：采用SPSS软件进行单因素方差分析，各组 间 两两比较采用q检验。
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实验记录
表1 不同剂量镉处理LO2细胞中彗星细胞百分率和尾长比较
彗星分析实验：单细胞凝胶电泳
实验步骤
6. 中和、染色
– 将载玻片置于大平皿中，用中和液中和2～3次， 4℃，每次 15min
– 用滤纸将缓冲液吸干 – 每凝胶滴加100 μl AO, 染色20min （避光） ； – 将玻片在蒸馏水中漂洗（避光）。
实验步骤
7. 观察、拍照和分析：
– 置荧光显微镜下，拍照 – 用专用的软件进行分析。
彗星的测量
• 尾长，彗星头部中心到尾部最远端的距离。
– 尾长只在相对低的损伤水平增加，随后损伤剂 量增加时，尾部光密度增加，而尾长不变
彗星的测量
• 头尾光密度比，通常以尾部DNA量占全部 DNA量的百分比表示。
– 与损伤频率成线性关系，受阈值设定的影响较 小，并在最大范围内分辨损伤（理论上，尾部 DNA从0%-100%）
基本原理
• 若细胞受损，在碱性电泳液（pH>13）中， DNA双链解螺旋且碱变性为单链，单链断 裂的碎片分子量小可进入凝胶中，电泳时 断链或碎片离开核DNA向阳极迁移，形成 拖尾。
基本原理
• 细胞核DNA 受损伤越严重，产生的断链就越多， 片段也越小，电泳表现为尾长增加和尾部荧光 增强。
• 因此，通过测定DNA 迁移部分的光密度或迁移 长度就可定量测定单个细胞损伤的程度。
玻片上使胶均匀展开，室温固化10min
实验步骤
2. 制片：第2 层凝胶的制备 • 将细胞与0.7%LMA 混合均匀（体积比1/9） • 迅速将适量（100～200μl）含细胞的LMA
滴到第1 层琼脂糖上，室温固化10min
实验步骤
3. 细胞裂解： • 将玻片置于平皿中，轻轻加入预冷的新鲜
配置的细胞裂解液。4℃下避光裂解2-3h； • 取出载玻片用PBS漂洗2次（要求动作轻柔，
彗星实验
彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1～3]，并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。
本实验对Singh等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。
用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet，UV)，属于UVC 波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7～9]，诱导K562细胞DNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度，验证改良的实验系统是否可靠，同时筛选并评价D N A损伤的分析指标。
1 材料与方法1.1 细胞K562细胞，来源于第四军医大学免疫学教研室，37 ℃、5％CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。
1.2 紫外线照射装置紫外消毒灯(ZSZ-20型，20 W，天津市紫晶特种光源有限公司)。
1.3 主要试剂和仪器培养基：10％新生牛血清(杭州四季青公司)，90％ RPMI-1640培养液(Hyclone公司)；双抗(青、链霉素，100 UI/ml)；Triton X-100(Genview分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMC分装)；常熔点琼脂糖(Spanish分装)。
其余生化试剂均为分析纯。
电泳仪：由西北大学物理系提供；电泳槽：DYC33A型(北京市六一仪器厂)；显微镜：Leica DM LB 2 (Leica 公司)；彗星图象分析软件：CASP 软件(casp-1.2.21.4 实验分组及UV处理收集对数生长的K562细胞，台盼蓝染色计数，细胞活力大于95％，用Hank's(pH7.4)调整细胞密度至1×105/ml，接种于塑料培养皿中(ф=35 mm，2 ml/plate)，然后进行紫外线照射(0.3 mW/cm2)。
实验分为对照组和8个照射组，各照射组分别照射3、5、10、40，60、120、180、240 s，对照组不进行紫外线照射，之后进行彗星实验。
彗星实验
1.制片第一层胶: 将预热45℃的80ul, 0.6% 的正常熔点琼脂糖(NMA ) 滴在磨砂载玻片的磨砂面上, 迅速用一干净玻片边缘将胶铺平, 或加盖盖玻片压平胶面, 将玻片臵保湿盒内,4℃,10 min 使胶凝固。
第二层胶: 将10ul 待测细胞悬液盒75ul, 0.6% 的低熔点琼脂糖(LMA ) 在37℃混匀,滴在第一层胶板上(加盖玻片者需先轻轻揭去盖玻片) , 迅速加干净的盖玻片使胶铺平, 将玻片臵保湿盒内, 4℃,10 min使胶凝固。
第三层胶: 在凝固的LMA 层上滴加37℃,0.6%LMA,盖上盖玻片,使其凝固。
铺第一层胶的目的是使第二层胶平整、附着紧密, 铺第三层胶的目的是对第二层胶中的细胞起保护作用。
2.裂解移去盖玻片, 将载玻片水平浸入新配臵的预冷4℃裂解液( 2.5 mol/LNaCl, 100mmol/L Na2EDTA,10 mmol/L Tris, 1%肌氨酸钠, pH = 10, 用前加入1% 体积的Triton X2100, 10%二甲亚砜) 中至少1小时。
此步骤的目的是溶解细胞膜及核膜, 除去蛋白质、RNA 等, 仅存留核骨架。
3.解旋从裂解液中取出载玻片, 用蒸馏水浸泡或PBS 冲洗, 洗去胶表面的盐溶液然后将载玻片臵于水平电泳槽中, 倒入新配制的碱性电泳缓冲液(1 mmol/L Na2EDTA,300 mmol/L NaOH, pH = 13), 约没过胶面0.25cm 左右, 碱解旋20～40 min, 以便使DNA 在碱性条件下解旋成单链DNA,使DNA 断片在电泳场中易于迁移。
4.电泳电压25V,电流300mA,低温避光,电泳20～40min。
5.中和将载玻片取出,用0.4 mmol/L Tris 缓冲液(pH = 7.5) 中和2～3 次, 每次5～15 min, 以除去碱和去污剂,以免影响染色效果。
6.染色观察根据显微镜的滤镜种类选择染色剂。
常用吖啶橙(2mg/L)、溴化乙啶(20mg/L)、碘化丙啶(2.5～5.0 mg/L )、4,6-联脒-2-苯基吲哚(5 mg/L )或苯并嗯唑啉2-2喹啉等, 用量50～ 100ul, 滴臵胶板上, 盖上盖玻片, 24小时内检测, 时间过长将导致荧光减弱。
彗星电泳法
彗星电泳法引言彗星电泳法（Comet assay），又称为碱性单细胞凝胶电泳（alkaline single-cell gel electrophoresis），是一种常用于评估DNA单链断裂程度及修复能力的实验技术。
该方法采用凝胶电泳原理，可以通过观察DNA在电泳中的迁移情况，定量分析DNA的双链断裂、单链断裂及碱解位点等信息，从而评估DNA的损伤程度。
彗星电泳法的原理彗星电泳法的原理是基于以下核心步骤：首先，细胞样品被混悬于低熔点琼脂糖凝胶中，并在裂解液中经过裂解，使DNA在凝胶中解旋并生成碱性单链凝胶。
然后，电泳运行期间，电场引起DNA向阳极移动，而碱解位点产生的碱性断裂会导致DNA 片段扩散，形成类似彗星尾巴的凝胶结构。
最后，经过染色和显微镜观察，可以评估DNA的尾巴长度和形态，进而对DNA的损伤程度进行定量分析。
彗星电泳法的步骤1.细胞样品准备：从感兴趣的组织或细胞中获取细胞样品，确保准备成单细胞悬液。
2.碱性裂解：将细胞样品与裂解液混合，并孵育一段时间，使DNA完全解旋并生成碱性单链凝胶。
3.电泳运行：将样品嵌入琼脂糖凝胶中的水平电泳槽中，通过施加电压使DNA向阳极运动，进行电泳分离。
4.染色和显微镜观察：完成电泳后，对凝胶进行染色处理，然后在显微镜下观察和拍照记录。
5.图像分析和结果计算：通过图像处理软件对拍摄的彗星图像进行分析，计算出DNA尾巴长度、形态等参数，从而评估DNA的损伤程度。
彗星电泳法的应用彗星电泳法在生物医学研究领域具有广泛的应用，主要用于以下几个方面：1. 检测环境致突变物质彗星电泳法可以用于评估环境中存在的致突变物质对细胞DNA的损伤程度，如化学物质、辐射等。
通过比较不同处理组织样品的彗星图像特征，可以评估不同处理条件下DNA的损伤程度，进而评估致突变物质的毒性和致突变性。
2. 评估细胞DNA修复能力彗星电泳法可以用于评估细胞对DNA损伤的修复能力。
研究人员可以在不同时间点收集细胞样品，然后通过彗星电泳法评估不同时间点DNA损伤的程度，从而了解细胞DNA修复过程中的动态变化。
彗星电泳方法整理
Comet assay简介单细胞凝胶电泳技术（Single cell gel electrophoresis, SCGE），又称彗星试验（Comet assay），是在核酸沉淀法（Nucleoid sedimentation）和晕圈分析（Holo assay）等检测技术基础上逐步发展起来的一种在单细胞水平检测有核细胞DNA断裂的新技术。
它主要包括Olive等建立的测定DNA双链断裂的中性单细胞凝胶电泳技术和Singh等建立的测定DNA单链断裂的碱性单细胞凝胶电泳技术。
此技术已经被广泛应用于放射生物学、DNA断裂与修复、毒理学、肿瘤治疗评价、细胞凋亡等领域的研究。
是碱性单细胞凝胶电泳可以检测DNA链的断裂和碱不稳定点，请问碱不稳定点是不是DNA上的脱嘌呤/嘧啶位点呀？还有个问题就是彗星试验检测到的DNA断裂其实是DNA损伤与修复的共同作用的结果，而且DNA修复的一个重要方式就是核苷酸切除修复，因此DNA修复过程也会造成DNA链的断裂，所以彗星试验所反映的时间－效应关系，可能并非与真实的DNA损伤有偏差，因为它无法鉴别修复过程中的DNA断裂。
SCGE技术的原理：细胞核中的DNA为负超螺旋结构，而且很致密，通常DNA双链以组蛋白为核心，盘旋而形成核小体。
一般情况下，偶然的DNA单链断裂对核酸分子双股结构的连续性影响不大，而且不易释放出来，但是，如果用去污剂破坏细胞膜和核膜，用高浓度盐提取组蛋白，DNA 残留而形成类核。
如果类核中的DNA有断裂，断裂点将引起DNA致密的超螺旋结构松散，在类核外形成一个DNA晕圈。
将类核置于电场中电泳，DNA断片可从类核部位向阳极迁移，经荧光染色后，在阳极方向可见形似彗星的特征性图像，故称“彗星试验”。
彗星尾部即为迁移出类核的DNA片段。
此时彗星尾部有可能还与头部以单链或双链的形式相连。
DNA损伤越严重，导致DNA超螺旋结构越松散，产生的断裂点越多，DNA片段越小，从而在彗星尾部出现的DNA断片越多，则慧尾的长度、面积和荧光强度越大。
彗星实验步骤Cometassay
彗星实验步骤Cometassay
水稻植株彗星实验步骤
通过将Singh和Gichner等人建立的碱性彗星实验方案应用于水稻（Oryza sativa L.）来确定原发性DNA损伤。
所有的实验步骤都是在冰床上避光进行的。
1、对于每一盆水稻，取鲜叶0.1 g，用刀片切碎，加入2个100 μL装有三羟甲基氨基甲烷盐酸提取缓冲液（Tris-HCl提取液，0.1 M，pH=7.5，4℃保存）的离心管中；
2、每个离心管中取75 μL含细胞核样本添加到150 μL低熔点琼脂糖凝胶（LMPA，1%）中，混合；
3、取75 μL上述混合物，沉积在用正常熔点琼脂糖凝胶（NMPA，1%）制备的载玻片上，然后盖上盖玻片；
4、重复步骤3，每个样品制备3张载玻片，4℃保存15min；
5、在载玻片上添加一层LMPA以保护含有核的凝胶层；
6、将载玻片置于含有强碱性缓冲液（0.3 M NAOH和1 M EDTA，pH＞13）的电泳槽中浸泡15 min，诱导DNA的展开和变性；
7、电泳，电压为25 V，电流为30 mA，持续5 min，将DNA片段从未受损的DNA链中分离出来，温度4℃，避光；
8、观察载玻片，每张载玻片分析30个核，利用连接到图像分析系统的摄像机对彗星进行了检测，并利用图像软件分析；
9、彗星尾部端点强度（TI）与DNA损伤水平呈线性关系。
彗星电泳法在植物原生质体凋亡检测中的应用
彗星电泳法在植物原生质体凋亡检测中的应用随着现代生物学的快速发展，植物细胞因凋亡受到了广泛的关注。
随着技术的进步，已经发现了许多用于检测凋亡的方法。
其中，彗星电泳法是一种广泛应用于生物凋亡领域的工具。
本文将介绍彗星电泳法及其在植物原生质体凋亡检测中的应用。
一、彗星电泳法简介彗星电泳法是一种用于检测DNA单链断裂的常用技术。
该技术最早由S. Singh等人在1988年发明。
该方法通过将细胞暴露在DNA损伤诱导剂中，使DNA受到损伤。
然后将细胞嵌入裂解芯片中，接着施加电场，将碎片化的DNA拖成“彗星状”，并通过成像系统观察。
1. 彗星电泳法的优势彗星电泳法具有许多明显的优势。
首先，它可以非常敏感地检测出DNA单链断裂。
其次，它可以通过变幻实验条件来检测不同类型的DNA断裂。
例如，它可以通过调整彗星的长度，来检测不同类型的DNA断裂。
另外，彗星电泳法还可以检测DNA断裂的位置，从而精确定位DNA损伤。
2. 彗星电泳法对植物细胞的应用在植物细胞中，彗星电泳法被用于检测DNA损伤和凋亡。
它可以用于检测机械损伤、化学损伤或热激损伤等损伤类型。
另外，它还可以检测由紫外线等外部应激因素引起的DNA损伤。
此外，它已被证明是一种非常有效的检测植物细胞凋亡的方法。
彗星电泳法已被广泛应用于植物原生质体凋亡的研究中。
以水稻为例，研究人员使用H2O2处理原生质体样品以诱导凋亡，并使用彗星电泳法来检测样品中DNA损伤的程度。
结果显示，处理后的样品的DNA断裂率大大增加，这表明经过H2O2处理的原生质体已经开始凋亡。
因此，这项研究显示，彗星电泳法可以用于检测植物原生质体凋亡。
三、总结。
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Comet assay简介单细胞凝胶电泳技术（Single cell gel electrophoresis, SCGE），又称彗星试验（Comet assay），是在核酸沉淀法（Nucleoid sedimentation）和晕圈分析（Holo assay）等检测技术基础上逐步发展起来的一种在单细胞水平检测有核细胞DNA断裂的新技术。
它主要包括Olive等建立的测定DNA双链断裂的中性单细胞凝胶电泳技术和Singh等建立的测定DNA单链断裂的碱性单细胞凝胶电泳技术。
此技术已经被广泛应用于放射生物学、DNA断裂与修复、毒理学、肿瘤治疗评价、细胞凋亡等领域的研究。
是碱性单细胞凝胶电泳可以检测DNA链的断裂和碱不稳定点，请问碱不稳定点是不是DNA上的脱嘌呤/嘧啶位点呀？还有个问题就是彗星试验检测到的DNA断裂其实是DNA损伤与修复的共同作用的结果，而且DNA修复的一个重要方式就是核苷酸切除修复，因此DNA修复过程也会造成DNA链的断裂，所以彗星试验所反映的时间－效应关系，可能并非与真实的DNA损伤有偏差，因为它无法鉴别修复过程中的DNA断裂。
SCGE技术的原理：细胞核中的DNA为负超螺旋结构，而且很致密，通常DNA双链以组蛋白为核心，盘旋而形成核小体。
一般情况下，偶然的DNA单链断裂对核酸分子双股结构的连续性影响不大，而且不易释放出来，但是，如果用去污剂破坏细胞膜和核膜，用高浓度盐提取组蛋白，DNA 残留而形成类核。
如果类核中的DNA有断裂，断裂点将引起DNA致密的超螺旋结构松散，在类核外形成一个DNA晕圈。
将类核置于电场中电泳，DNA断片可从类核部位向阳极迁移，经荧光染色后，在阳极方向可见形似彗星的特征性图像，故称“彗星试验”。
彗星尾部即为迁移出类核的DNA片段。
此时彗星尾部有可能还与头部以单链或双链的形式相连。
DNA损伤越严重，导致DNA超螺旋结构越松散，产生的断裂点越多，DNA片段越小，从而在彗星尾部出现的DNA断片越多，则慧尾的长度、面积和荧光强度越大。
通过测量彗星尾部的长度、面积或荧光强度等指标，可以对DNA的损伤程度进行定量分析。
随着SCGE技术的发展，可测量的指标也越来越多，而且更准确。
目前，用于SCGE分析的指标主要分为四类，包括形状指标、距离指标、强度指标和矩类指标。
其中形状指标有彗星细胞率；距离指标包括彗星尾长、彗星全长、彗星头部半径、尾部半径；强度指标包括头部DNA百分含量、尾部DNA百分含量、头部面积、尾部面积等；矩类指标包括尾矩、Olive尾矩等。
依靠目镜测微尺人工测量彗星距离指标，主观性较强，人为误差较大，而且矩类指标更需要人工通过公式计算得出，使研究人员的工作量加大。
因此，研究人员渴望开发出一种专用的彗星图像分析软件。
近年来，各国研究机构纷纷推出各自的图像分析软件，这些分析软件可以快速提供一系列评价参数，如彗星总长、尾长、尾DNA含量、尾矩和Olive尾矩等，更好地客观定量DNA损伤。
目前，用于彗星分析的软件包括英国Kinetic Imaging公司的Komet5.5、Perceptive Instruments公司的Comet Assay Ⅲ、LAI公司的LACAAS、美国NIH 的ImagJ、TriTek公司的CometScoreTM、印度原子能研究所的SCGE-Pro、奥地利癌症研究所开发的自动分析软件等。
其中的部分软件可以到其相应网站下载，但最好与相应的彗星分析系统硬件设备配套使用，价格昂贵，提高了研究成本。
新近研发的彗星分析软件（Comet Assay Software Project, CASP）很好地解决了这一问题，该软件可以在普通微机上运行，界面友好，使用方便，分析速度快，可以一次同时给出最多达13个指标，分析结果避免了人为误差，更加客观和准确，结果可以以.txt文件直接输出，SPSS等统计软件可以直接读取其输出结果，便于统计学分析，节省大量人力物力。
中性电泳与碱性电泳在适合的实验条件范围内，没有损伤的细胞在中性或碱性条件都不可能做出尾巴。
中性检测DNA双链断裂，碱性检测DNA单链断裂。
根据实验设计的需要，可以选择不同的实验条件，也可以同时选择两种条件，结果进行对比。
拿电离辐射来说，中性和碱性检测的敏感范围不同，碱性SCGE的敏感范围值偏低，如可以小到0.05Gy，而中性SCGE的敏感范围值偏高，它可能检测不到0.05Gy的DNA 损伤，但可以检测大到100Gy的损伤，而相对中性SCGE来说，碱性SCGE在大剂量照射时的各项指标容易形成平台。
从修复方面来说，双链断裂的修复较单链断裂的修复慢，损伤重，后果更严重，双链断裂是后来形成染色体畸变和微核的主要物质基础。
从文献上来看，药物引起的DNA损伤多采用碱性SCGE 检测单链断裂，A：碱性电泳是在1988年建立的，而最开始彗星方法都是在中性条件下做的（1984），所以我认为，这是方法逐步改进的过程。
碱性条件下，DNA解旋，检测出来的应该是双链和单链断裂的综合损伤，这样可以提高试验的灵敏度，也就是您说的可以检测到0.05Gy,而中性电泳做不到这一点。
B：中性条件跑出来的是DNA的双链，单链断裂不会出来，而强碱性条件下，破坏了断裂部位连接碱基的氢键，这样，双链断裂也就成了单链形式，可以说碱性检测的是“双链和单链断裂的综合损伤”，两种电泳条件的最大区别是适用于不同的实验需求。
碱性条件的SCGE 的建立也是为了满足不同实验需要。
实践中要根据DNA致伤因素选择实验条件，如：电离辐射对DNA的损伤以双链断裂为主，应该选择中性SCGE，而且可以排除环境因素对DNA 损伤的影响（因为DNA很容易受到环境因素的影响而断裂－－单链为主），如果用碱性的话，就不能区分哪些是实验因素引起的断裂，哪些是其它影响因素引起的断裂。
如果实验致伤因素是以DNA单链为主，那就应该选择碱性SCGE了。
有一点需要说明一下，碱性SCGE确实增加了检测的敏感性（中性SCGE达不到），但牺牲了特异性，DNA很容易受许多因素的影响而产生断裂，如吸烟、饮酒等不良生活习惯、环境污染等因素。
所以碱性条件很难从实验结果中剔除哪些是非实验致伤因素造成的，对实验结果会或多或少有点影响。
所以说SCGE条件的选择主要还要根据实验的需要来定。
中/碱性单细胞凝胶电泳Unwinding of the DNA and electrophoresis at neutral pH (7-8) predominantly facilitates the detection of double strand breaks and cross links; unwinding and electrophoresis at pH 12.1-12.4 facilitates the detection of single and double strand breaks, incomplete excision repair sites and cross links; while unwinding and electrophoresis at a pH greater than 12.6 expresses alkali labile sites (ALS) in addition to all types of lesions listed above (Miyamae et al., 1997).Lysis and electrophoresis can be performed in alkaline (option A) or neutral (option B) e option A to detectthe combination of DNA single-strand breaks, double-strand breaks and alkali-labile sites in the DNA, and option B to detectonly DNA double-strand breaks.一．玻片处理1.将玻片放入肥皂或洗衣粉水中煮沸20 分钟。
2.用热水将肥皂等污物洗去，再用自来水反复冲洗，最后再用蒸馏水冲洗3 ～5 次。
必要时再置95 ％乙醇中浸泡1 小时，然后擦干或烘干备用。
新玻片常有游离碱质，因此应用清洁液或10 ％盐酸浸泡24 小时，然后分别用自来水及蒸馏水彻底洗涤。
3.用无水乙醇提前浸泡磨砂载玻片和盖玻片，至少过夜（用前最好预热下），再使用，可减少脱胶的问题。
bel slide on frosted end using a pencil, not a pen.二至四步均应在暗处进行，以避免额外的DNA损伤performed under dim yellow lights to prevent DNA damagethe premise is that usual lighting will cause DNA damage buthave no data to support this concern.先准备裂解液，加应用液组分溶解至清澈后放冰箱！二．胶的配制与铺设铺胶后都要加盖片（可不加），目的是使胶平整，凝胶固化后移去盖片，再铺另一层，普通波片表面比较光滑，容易脱胶，文献多用毛玻璃片，应该好一点，但也不能完全避免脱胶。
表1.Sample preparation buffer(for plant tissueslicedwith a fresh razor blade)pH7.4配胶用PBS（0.1MpH7.4）用PBS母液配制第一层：0.75％正常熔点胶，100µl，置于室温>5min使其固化在烧杯里配100ml左右的正常熔点琼脂糖，煮沸之后把玻片放进去，让胶液浸过1/3之后，捞出玻片，用布或者别的什么把一面擦干，然后把玻片水平放置，晾干。
*The slides may be air dried orwarmed for quicker drying. Store the slides at room temperature until needed; avoid high humidity（湿）conditions. Wegenerally prepare slides the day before use.*M. Klaude, S. Eriksson, J. Nygren, and G. Ahnstrom (1996) The cometassay: mechanisms and technical considerations. Mutation Res. 363: 89-96.第二层：0.75％低熔点胶，75µl +25µl样品悬液，置于4℃固化1min（也可以把第二层胶配成1％，然后把细胞和胶按照1：1的比例配，这样细胞多了，终浓度也是0.5%）附：三层胶法：Gently slide off coverslip and add a third agarose layer (75 μL LMPA) to the slide. Replace coverslip and return tothe slide tray until the agarose layer hardens (~3 to 5 minutes). Remove coverslip.凝胶不要提前配置，可以提前称量好，分装，用前加PBS至5ml，反复用，效果不好，不易铺平，铺胶前低熔点胶PBS溶解、煮沸，要温于37度水浴箱，再和细胞混合（低熔点琼脂糖在恒温放久了，铺胶染色后会容易造成背景很脏），不会破坏细胞。