流式protocol

合集下载

socket函数的三个参数

socket函数的三个参数标题：socket函数的使用方法导语：在计算机网络中，socket函数是一种用于实现网络通信的编程接口。

它是网络应用程序与网络之间的通信端点，通过socket函数可以实现进程间的通信和数据传输。

本文将详细介绍socket函数的三个参数的使用方法，帮助读者理解并能够灵活应用socket函数。

一、参数一：domain（套接字的协议域）在socket函数中，参数domain指定了套接字的协议域。

协议域是一组协议的集合，它定义了套接字可以用于通信的协议类型。

常用的协议域包括AF_INET（IPv4协议）、AF_INET6（IPv6协议）、AF_UNIX（本地通信协议）等。

1. AF_INET（IPv4协议）在使用IPv4协议进行通信时，可以使用AF_INET作为套接字的协议域。

IPv4协议是当前广泛应用的网络协议，它使用32位地址来标识网络中的主机。

2. AF_INET6（IPv6协议）当需要使用IPv6协议进行通信时，可以选择AF_INET6作为套接字的协议域。

IPv6协议是IPv4协议的升级版，它使用128位地址来标识网络中的主机，解决了IPv4地址不足的问题。

3. AF_UNIX（本地通信协议）如果需要在同一台主机上的进程之间进行通信，可以选择AF_UNIX 作为套接字的协议域。

AF_UNIX提供了一种本地通信的方式，不需要通过网络传输数据。

二、参数二：type（套接字的类型）在socket函数中，参数type指定了套接字的类型。

套接字的类型决定了套接字的工作方式和特性。

常用的套接字类型包括SOCK_STREAM（流式套接字）和SOCK_DGRAM（数据报套接字）。

1. SOCK_STREAM（流式套接字）当需要建立可靠的、面向连接的通信时，可以选择SOCK_STREAM作为套接字的类型。

流式套接字提供了一种面向连接的、可靠的通信方式，数据按照顺序传输，不会丢失和重复。

2. SOCK_DGRAM（数据报套接字）如果需要进行无连接的、不可靠的通信，可以选择SOCK_DGRAM作为套接字的类型。

流式细胞术的组织样本，你会处理吗？

流式细胞术的组织样本，你会处理吗？前⾔常常听到流式操作的⽼师说，你细胞数量太少⽆法获取有效数据，或者细胞聚团导致管路堵塞等问题。

本来就好不容易排到队去分析样本，还会被后⾯同学各种嫌弃，1min实验有时候10min都没做出来！细胞数⽬的掌握很难，过于稀释浓度不够，过于稠⼜会在通过细胞仪时影响分析，做不出结果，常常是我们做流式的⼀⼤通病。

特别是从组织中分离样本时，这样的问题常常遇到。

本期就看看如何从不同组织中分离出优质样本。

组织样本的单细胞制备与贴壁或者悬浮细胞相⽐，组织样本的单细胞制备相对有⼀定的难度和复杂性，也是同学们最容易出现问题的地⽅，如细胞数量太少，细胞活性不好，细胞碎⽚太多等。

下⾯就具体看看组织中的细胞如何制备。

⽬前，最常⽤两种⽅法是物理法和酶解消化法。

组织样本的处理⽅法⼀、物理⽅法：原理：是指利⽤物理⽅法（机械法）分散组织，经过滤⽹过滤获得单细胞悬液。

应⽤：常⽤于处理部分软组织例如⾻髓、胸腺、脾脏、淋巴结等，或富含细胞的肿瘤组织----淋巴⾁瘤、视神经母细胞瘤、脑瘤、未分化瘤、髓样瘤以及⼀些软组织⾁瘤等，⽤单纯的机械法就可以获得⼤量⾼质量的单分散细胞。

优势：操作⽅便，耗时短，且能获得⼤量的细胞。

缺点：易造成组织细胞机械损伤，如细胞碎⽚和细胞团块，所以常与其他⽅法配合使⽤；对硬组织或纤维组织效果不好。

⼆、酶解消化法：原理：利⽤酶（主要是胶原酶和蛋⽩酶）破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等、⽔解组织细胞的紧密连接结构的蛋⽩质和粘多糖物质以将实体组织分散为单个细胞的⽅法。

应⽤：既可⽤于普通单层的传代细胞也适合致密的组织样本，如上⽪、肝、肾等或含有⼤量结缔组织的肿瘤----⾷管癌、乳腺癌、⽪肤癌等。

优势：适⽤于⼤部分组织样本获取单细胞，酶的种类多选择空间⼤。

缺点：操作步骤⽐较繁琐，消化时间⽐较长且难控制。

不同的组织样本酶种类、浓度、消化时间的选择需要不断摸索优化。

下⾯具体介绍这2种⽅式的操作步骤：⼀物理⽅法1. 吹打：⽤移液枪或注射器反复吹打组织以获得单个细胞的⽅法。

流媒体协议

流媒体协议流媒体协议是指用于在网络环境下传输音频、视频等媒体数据的通信协议。

流媒体协议在实时性、带宽控制以及适应不同网络环境等方面都有一定的特殊要求，下面我们来介绍一些常见的流媒体协议。

首先是RTSP协议（Real-Time Streaming Protocol）。

RTSP协议是用来控制流媒体服务器的，它可以实现对媒体流的播放、暂停、快进等操作。

RTSP协议使用了常见的应用层协议，如HTTP、TCP等作为传输方式。

它适用于需要实现对媒体流控制的场景，比如视频监控、视频会议等。

另一个常见的流媒体协议是RTMP协议（Real-Time Messaging Protocol）。

RTMP协议是Adobe公司开发的一种用于流媒体传输的协议，它支持实时音频、视频的传输，并且对带宽控制较为灵活。

RTMP协议常用于视频直播、在线游戏等应用场景。

此外，HTTP协议（Hypertext Transfer Protocol）也可以用于流媒体传输。

虽然HTTP协议是一种非实时的协议，但是通过HTTP协议可以实现流式传输，即在接收者每次请求媒体数据时，服务器会分块发送数据，实现边下载边播放的效果。

流媒体的高延迟和缓冲时间可以通过HTTP协议来减少。

同时，HLS协议（HTTP Live Streaming）也是一种基于HTTP 协议的流媒体协议。

HLS协议将整个视频切成若干个小的文件片段，每个文件片段都有自己的URL地址。

在播放时，客户端会按照一定的规则请求这些文件片段，然后按照顺序播放。

HLS协议通过切片的方式，可以实现更好的适应带宽、适应网络恶化等情况。

最后还有WebRTC协议（Web Real-Time Communication）。

WebRTC协议是一种基于网页的实时通信协议，它可以实现浏览器之间的点对点音视频通信。

WebRTC协议使用了一种名为ICE（Interactive Connectivity Establishment）的技术，可以在不同网络环境下建立起通信连接。

流式细胞仪(Flow Cytometer)基本原理

流式细胞术的特点
检测对象：单细胞悬液或生物颗粒；检测参数：多参数；检测特点：单细胞水平分析；检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒；检测结果：精度高、准确性好；可对目标细胞进行分选；
2、流式细胞术光信号检测
光信号的类型散射光信号：与标记荧光素无关，
是细胞的固有参数。
FL1-FITC stain
D、 FMO对照
多色实验中，阴性对照和单染对照并不是严谨的设门对照， FMO对照区分阴性群体和阳性群体更准确。
Fluorescence Minus One 荧光减一对照
(-) PE
FITC
PE
补偿调节引起背景荧光增强。颜色越多背景荧光越强，限制了多色流式技术的发展。
C、单标对照 Single Staining Control
由于荧光素的宽发射谱特点，荧光通道间有光谱重叠现象。多色流式实验的时候需要通过补偿调节消除光谱重叠影响。
FL1 530/30 FL2 585/42
FITC 发射谱
PE 发射谱
Wavelength
补偿调节方法：
FL-2(PE)
1、流式细胞术简介
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。
流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集细胞与分子生物学、流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种高科技仪器。
粘连细胞死细胞
死细胞或碎片
肿瘤细胞株FSC/SSC散点图
加药处理后FSC/SSC散点图

流式实用技巧-merckmillipore

Sample Flow
硬件系统——光学系统原理
激发和收集光信号
激发组件
激光器：光源，产生和发射激发光透镜和棱镜：将激光器产生的激发光照到细胞样品上
收集组件
滤光片：收集相应波长的从细胞样本上激发出的光收集器：光电倍增管（PMT）
Guava独特的光学系统——双激光共线性
以Guava easyCyte 8HT为例
FL3
软件系统
仪器清洗、维护，数据获取和分析
Muse独特的人机对话方式——触摸屏

MUSE 独特全触屏式控制系统加强操作的简便性五步触控即完成细胞分析
开机
调整设置
导入样本信息
获取数据
输出结果!
Overview of Flow Cytometer
Agenda
• Flow Cytometry Introduction • Tips in Flow Cytometry
• FMO
(Fluorescence-minus-one controls)
Step 3：染色流程
临床样本加入50 µL样本科研样本样本+表面抗原抗体
加入20ul mAb 涡旋振荡, 避光孵育15 min 加450ul BDFACS 溶血素
固定穿膜胞内抗体
涡旋振荡, 孵育15 min 信号采集和分析
复合染料容易降解降解因素包括：光照、甲醛固定剂、温度升高选择专用固定剂、 APC-H7 批次差异大不同批次补偿不同
B. Without CD8 APC-Cy7:
Step 2：试剂选择
抗体的选择：
单克隆抗体直接标记的抗体特异性克隆混合性克隆
抗体来源

流式细胞仪(FlowCytometer)基本原理汇总.

SSC方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称90度散射光，其信号强度反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化。
散射光的作用
实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
粒细胞单核细胞淋巴细胞
通过FSC/SSC散点图，gate出目标细胞进行分析。
1、流式细胞术简介
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。
流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集细胞与分子生物学、流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种高科技仪器。
FL1
5% 默认阈值
32% 升高阈值后
荧光素和荧光信号
荧光：荧光素的电子吸收光的能量由低能态转变为高能态，再回到低能态时释放出的光。
＜激发波长
Excitation wavelength
发射波长(荧光波长) Emission wavelength
常用荧光素
<499nm ：蓝色荧光（Blue）；
流式细胞术的特点
检测对象：单细胞悬液或生物颗粒；检测参数：多参数；检测特点：单细胞水平分析；检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒；检测结果：精度高、准确性好；可对目标细胞进行分选；
2、流式细胞术光信号检测
光信号的类型散射光信号：与标记荧光素无关，
是细胞的固有参数。前向散射光(forward scatter, FSC)；侧向散射光(side scatter, SSC)。

流式检测细胞周期protocol

PI染色检测细胞周期
1、HepG2细胞培养至70%左右，细胞铺板（60mm小皿），8万/皿，饥饿48小时，加药处理96h（加药组10万/皿）
2、收集培养基，2ml胰酶消化细胞，新培养基3ml重悬，收集细胞悬液，1000rpm，5min离心
3、弃去上清，加入1ml预冷的PBS充分重悬细胞，转移到1.5ml的EP管
4、混匀，4°，600g，5min离心
5、弃去上清，用250ul预冷的PBS重悬细胞，充分重悬，加入至750ul冰浴的无水乙醇，轻轻吹打混匀；
6、用封口膜封口，—20°，4h，最好过夜，可在—20°保存1w左右；
7、染色：
㈠、除去封口膜，加入500ulPBS重悬细胞，4°，600g，5min离心；
㈡、弃去上清，加入1ml预冷的PBS洗涤一次；
㈢、同上离心，弃去上清；
㈣、每管加入200ul PBS +2ul RnaseA（100µg/ml）溶液缓慢充分混匀后，室温，避光孵育30min, 再加2.5ul PI(250µg/ml)，室温避光15min；
㈤、24h内流式检测。

试剂：RnaseA，beyotime,10mg/ml,ST576
PI, beyotime,20 mg/ml,ST512。

流式细胞仪试剂介绍

FITC＋PE：最常用的双色组合 FITC＋PE＋PE-Cy5：最常用的三色组合，进行多色荧光染色时荧光光谱重叠补偿很小 FITC＋PE＋PerCP+APC：BD最常用的四色组合 FITC＋PE＋ECD+PE-Cy5:贝克曼库尔特公司最常用的四色组合 FITC＋PE＋ECD+PE-Cy5+PE-Cy7：贝克曼贝克曼库尔特公司最常用的五色组合，而且PE-Cy7与FITC 、PE、PE-Cy5标记的抗体一同使用时的荧光补偿小 PE-Cy5可与FITC、PE同时使用，但不能与APC同时使用，二者之间荧光干扰太大
Red APC APC-Cy7 UV DAPI Hoechst

Innovation – First Commercial Tandem Conjugates
APC Alexafluor™700 APC Alexafluor™750 PE-Texas Red PE-Cy7™
1985
性对照应为Mouse IgG1-FITC
如何看懂试剂的说明
临床试剂
RD1=PE
标记的荧光素
试剂包装规格大小
如何看懂试剂的说明
科研试剂
科研试剂，以mg/g表示试剂包装大小，需要做滴度实验，摸索最佳实验所需试剂量
如何看懂试剂的说明－试剂的货号识别
6开头的试剂为美国库尔特生产
200 of 208 New Drugs Are PKIs
The Competition: Western Blot vs Flow Cytometry
Western Blot
Untreated Treated
Flow Cytometry

流式细胞仪操作规程-SOP

流式细胞仪操作规程目录
1：淋巴细胞亚群测定及绝对计数
2：活化淋巴细胞亚群、记忆T及纯真T的检测
3：HLA-B27测定
4：CD55／CD59测定
5：干细胞检测和绝对计数
6：白血病免疫分型测定
7：淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4测定8：细胞周期分析
9：活化血小板检测
10：血小板抗体测定
11：红细胞抗体测定
12：粒细胞抗体测定
淋巴细胞亚群测定
(流式细胞仪)
医院检验科
操作规程文件号：
200 年月日起实施
第1版
(共3页)
本规程每2年复审一次
复审日期：年月日
复审人：
规程编写者：
审批者：
批准日期：年月日
文件分发部门和／或个人
院档案室保管者：
检验科主任：
检验科实验室：
淋巴细胞亚群测定
点击
点击
3色
点击
（命名，点击save）画图
此图为CD45圈门
填写Flow-Count的浓度
活化淋巴细胞亚群、记忆T及纯真T的测定
HLA-B27测定
点击
点击
X-Mean=17.1 negative(-)
X-Mean=1.2 X-Mean=5.8
CD55/CD59测定
2.RBC: abnormal
干细胞检测和绝对计数
白血病免疫分型测定
T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4检测
细胞周期分析
2.画图
血小板膜表面抗体测定
红细胞膜蛋白结构测定（红细胞抗体）
粒细胞抗体测定。

分离脾脏组织细胞及胞内流式的protocol

分离脾脏组织细胞及胞内流式的protocol1.准备六孔板，1xPBS溶液，50ml离心管，15ml离心管, 1.5ml管子，70um滤器,把淋巴细胞分离液拿到室温放着2.杀小鼠，分离脾脏和肺组织，肺用OCT包埋，至于-80度保存，脾脏放入六孔板3.用10ml注射器的头将其研碎，匀浆4.将其转移到装有70um滤器的50ml离心管中5.在15ml离心管底部铺上一份淋巴细胞分离液，与细胞悬液之比为1:26.500g, 15度，升降速为0，分离15分钟7.吸取乳白色细胞层，至于1.5ml离心管中8.加入PBS重悬，500g离心15分钟，重复两次9.配置10%培养基，将细胞悬浮其中待用10.500g, 离心10分钟，弃上清11.加入2ml 1xPBS重悬，离心，重复洗2次，并转移至2ml离心管中12.在离心过程中，配置穿孔液，还有固定液，表面抗体的稀释液13.从重悬细胞中吸取部分细胞作为Blank，吸取部分做表面抗体单染：比如CD4、IFN-γ、IL-414.表面染色标记各流式样品和CD4单染样品，4度避光孵育20-30分钟15.加入1ml 1xPBS中和抗体，离心，CD4单染样品加入流式染色液避光放置16.流式样品和IFN-γ、IL-4单染在避光条件下，各加入100ul IC Fixationbuffer，轻轻弹一弹，室温避光孵育20分钟17.每管加入2ml 1xpermeabilization buffer,300g 室温离心5min，弃上清18.2ml 1xpermeabilization buffer 重悬，300g 室温离心5min, 弃上清19.用1xpermeabilization buffer配IFN-γ、IL-4抗体，分别加入到每管中，单染只加一种抗体即可，室温避光孵育20-30分钟20.每管加入2ml 1xpermeabilization buffer,300g 室温离心5min，弃上清21.每管加入2ml 1xPBS,300g 室温离心5min，弃上清22.加适量1xPBS（300-500ul）重悬，避光放置等待上机检测23.软件分析结果。

protocol_08 流式细胞计数

A. Sample PreparationPrepare cells according to cell type.BLOOD(Human, Mouse or Rat)•For each 1 ml of blood, add 14 ml of room temperature FCM Lysing solution (sc-3621) to lyse the red blood cells. The cells will not lyse correctly if the solution is cold.•Incubate for 5 minutes at room temperature on a rotator. Do not exceed 5 minutes, as the white blood cells will begin to lyse beyond 5 minutes.•Centrifuge for 5 minutes at 1000 RPM for human blood, 2000 RPM for mouse or rat blood.•Carefully aspirate supernatant, then resuspend pellet in approximately 50 ml cold 1X PBS. Take a small sample to perform a cell count.•Centrifuge for 5 minutes at 1000 RPM for human blood, 2000 RPM for mouse or rat blood.•Aspirate supernatant.Mouse Spleen or Other Tissue•Harvest organ or tissue and prepare single cell suspension.•Pass cell suspension through a 70 µM cell strainer.•Centrifuge for 5 minutes at 1000 RPM.•Discard supernatant and add 5 ml of room temperature FCM Lysing solution (sc-3621).•Incubate for 2-3 minutes at room temperature, allowing larger pieces to fall to the bottom of the tube.•Carefully pipette the suspension out and deposit into a clean tube. Take a small sample to perform a cell count.•Centrifuge for 5 minutes at 1000 RPM.•Aspirate supernatant.Suspension Cell Line•Pipette off cells, rinsing plate to ensure maximum recovery. Take a small sample to perform a cell count.•Centrifuge for 5 minutes at 1000 RPM.•Aspirate supernatant.Monolayer/Adherent Cell Line•Vacuum off media. Rinse plate once with 1X PBS. Vacuum off PBS.•Add approximately 5 ml of 0.2% EDTA (in PBS) to plate. Using a Trypsin/EDTA solution in the place of 0.2% EDTA may compromise any cell surface staining.•Wait for cells to “round up.” Placing the cells in an incubator may speed up this process. Check the plate(s) every 5 minutes.•Add approximately 5 ml of media to neutralize EDTA.•Pipette off cells, rinsing plate to ensure maximum recovery. Take a small sample to perform a cell count.•Centrifuge for 5 minutes at 1000 RPM.•Aspirate supernatant.B. CELL STIMULATIONStimulate cells as necessary.C. STAIN PREPARATIONFix cells or prepare live cells for staining.NOTE: It is very important to block Fc receptors for certain cell types including, but not limited to, mouse and rat blood, mouse spleen, mouse bone marrow, etc. For mouse or rat tissues, use sc-18867 L.Live Staining•Once supernatant is aspirated from cell preparation, resuspend pellet in enough 1X PBS to have a final cell concentration of 10 million cells/ml.•Block by incubating the cell suspension with 1 mg of sc-18867 L per 1 ml of cell suspension for 10 minutes. Do not rinse. Proceed with staining.Fixed and Permeabilized Cells for Intracellular Staining•Once supernatant is aspirated from cell preparation, resuspend pellet in enough 1X PBS to have a final cell concentration of 10 million cells/ml.•Block by incubating the cell suspension with 1 µg of sc-18867 L per 1 ml of cell suspension for 10 minutes.•Resuspend pellet in approximately 50 ml 1X PBS to wash away any excess blocking antibody.•Centrifuge for 5 minutes at 1000 RPM.•Once supernatant is aspirated from cell preparation, resuspend pellet in FCM Fixation Buffer (sc-3622). Use 1 mL per million cells.•Incubate for 30 minutes at room temperature on a rotator.•Centrifuge for 5 minutes at 1500-2000 RPM. Cells get more buoyant after fixation. If pellet is too small, spin again at a higher RPM, but do not exceed 3000 RPM.•Pour off supernatant. Cells may be lost if aspirating from this point on, so always decant. Use a quick motion and don’t allow the supernatant to wash back and forth over the cells.•Resuspend pellet in approximately 50 ml 1X PBS to wash away any excess Fixation Buffer.•Centrifuge for 5 minutes at 1500-2000 RPM.•Decant supernatant. At this point, cells can be resuspended in a small amount of PBS and stored for up to 1 month at 4° C. To permeabilize at this time, proceed to next step.NOTE: You should only proceed with permeabilization if you can stain immediately afterwards.•If cells have been stored in PBS, centrifuge for 5 minutes at 1500-2000 RPM and decant supernatant.•Break up cell pellet and dropwise add the same amount of COLD (stored at -20° C) FCM Permeabilization Buffer, sc-3623 at 1 ml per 1 million cells. Vortex while adding.•Incubate for 5 minutes only at RT on a rotator.•Immediately centrifuge for 5 minutes at 2000-2500 RPM. Cells are more buoyant after permeabilization and much care must be excercised to maintain volume of cells.NOTE: Important: If a pellet is not recovered at this step, be sure to spin again and try to recover more cells.•Decant supernatant and add approximately 50 ml 1X PBS to wash away any excess Permeabilization Buffer.•Centrifuge for 5 minuntes at 2000-2500 RPM.•Decant supernatant and resuspend pellet in enough FCM Wash Buffer, sc-3624, for a final cell concentration of10 million cells/ml. In the staining steps, use FCM Wash Buffer in place of 1X PBS.D. STAININGFollow protocol for direct or indirect staining.DIRECT STAINING(With Fluorochrome - Conjugated Antibodies)•Label tubes.•Add 20 µl of fluorochrome-conjugated antibodies to tubes.•Add 100 µl of the prepared cell suspension (equal to 1 million cells) to each tube.•Vortex and incubate for 15-30 minutes in a covered ice bucket.•To wash off excess antibody following staining, add 1.5-2 ml of 1X PBS to each tube.•Centrifuge in tabletop microfuge for 5 minutes at 2000 RPM. This speed should be increased to 3000 or 4000 RPM for intracellular staining.•Aspirate supernatant, being careful not to disturb pellet.•Resuspend pellets in 500 µl of 1% paraformaldehyde. Tubes can be stored in the dark for 24 hours (maximum for intracellular staining) to 1 week (maximum for surface staining).INDIRECT STAINING(With Fluorochrome - Unconjugated Primary Antibodies and Fluorochrome - Conjugated Secondary Antibodies)•Label tubes.•Add unconjugated primary antibodies to tubes. Use approximately 1 µg per tube.•Add 100 µl of the prepared cell suspension (equal to 1 million cells) to each tube.•Vortex and incubate for 15-30 min in a covered ice bucket.•To wash off excess antibody following staining, add 1.5-2 ml of 1X PBS to each tube.•Centrifuge in tabletop microfuge for 5 minutes at 2000 RPM (or 3000-4000 RPM for intracellular staining).•Aspirate supernatant, being careful not to disturb pellet.•Add 100 µl of 1X PBS to each tube. Add fluorochrome-conjugated secondary antibodies to tubes. Use 0.5-1 µg of antibody.•Vortex and incubate for 15-30 minutes in a covered ice bucket.•To wash off excess antibody following staining, add 1.5-2 ml of 1X PBS to each tube.•Centrifuge in tabletop microfuge for 5 minutes at 2000 RPM (or 3000-4000 RPM for intracellular staining).•Aspirate supernatant, being careful not to disturb pellet.•Resuspend pellets in 500 µl of 1% paraformaldehyde. Tubes can be stored in the dark for 24 hours (maximum for intracellular staining) to 1 week (maximum for surface staining).E. ACQUIREAcquire within 24 hours.。

流式细胞术

流式细胞术流式细胞术(flow cytometry)是利用流式细胞仪(flow cytometer)快速定量分析细胞群的物理化学特征以及根据这些物理化学特征精确分选细胞的新技术。

流式细胞仪通过接收激光照射后液流内细胞的散射光信号和荧光信号反映细胞的物理化学特征，如细胞的大小、颗粒度和抗原分子的表达情况等。

原理：流式细胞术是特定波长的激光束直接照射到高压驱动的液流,产生的光信号被多个接收器接收,一个是在激光束直线方向上接收到的散射光信号(前向角散射),其他是在激光束垂直方向上接收到的光信号,包括散射光信号(侧向角散射)和荧光信号。

液流中悬浮的直径从0.2~150μm的细胞能够使激光束发生散射光,细胞上结合的荧光素被激光激发后能够发射荧光。

散射光信号和荧光信号被相应的接收器接收,根据信号的强弱波动就能反映出每个细胞的物理化学特征。

三大要素：流式细胞术有三大要素,分别为流式细胞仪、样品细胞和荧光染料或者荧光素偶联抗体。

流式细胞术是在流式细胞仪上操作的,流式细胞仪根据其功能的不同可以分为分析型流式细胞仪和分选型流式细胞仪,前者只能流式分析,不能分选纯化目标细胞,后者能够同时进行流式分析和流式分选。

检测对象：流式细胞术检测的对象是细胞,而且是呈独立状态的悬浮于液体中的细胞,即单细胞悬液。

流式细胞术不能直接检测组织块中的细胞，要检测脏器或组织中的细胞,必须先用各种方法将脏器或组织制备成单细胞悬液,然后标记上荧光素偶联抗体,才能被流式细胞仪检测。

流式细胞术不能直接检测分子,但是用人工合成的颗粒代替细胞,然后将该分子的抗体与人工颗粒结合，可以间接检测分子,如用CBA法检测细胞因子等。

流式细胞术可以定量检测样品细胞的物理化学特征,其定量是以光信号为基础的,通过分析接收到的激光照射到细胞后的散射光信号和荧光信号完成定量分析。

样品细胞只有标记荧光染料或者荧光素偶联抗体进而被激光照射后才能发射荧光信号,从而得到样品细胞表达某抗原分子强弱情况等化学特征,否则只能通过分析散射光信号得到样品细胞体积大小和颗粒度等物理特征。

流式细胞术检测样品制备方法

• 细胞周期测定 • 细胞凋亡测定
细胞周期分析
Normal Cell Cycle
G2 M
G1 G0
DNA Analysis
s
C o u n t
G0G1
s
0 200 400 600
G2 M
800 1000
4N 2N DNA content
A typical DNA Histogram
G0-G1 # of Events S
• 3.洗涤：
– 常用 FBS 做洗涤液，内加一定浓度的 5%10%小牛血清，除了封闭非特异性结合外，还有助于保持细胞活性。 – 0.2% 的 NaN3 防止抗原抗体反应后发生联合解离。 – 染色后充分洗涤防止假阳性和假阴性。 – 防止混合剧烈以免破碎细胞过多，导致非特异性荧光。 – 注意离心速度，减少细胞粘连。
流式细胞术检测样品制备方法
FCM 样品制作步骤
1.实验标本的处理 2.荧光染料的选择 3.抗体的选择 4.实验对照的设计 5.实验操作过程中的注意事项 6.具体例子
（一）FCM单细胞标本的制备
• FCM实验检测对象是单细胞悬液，因此，在组织化学和免疫组织化学实验中需把样品制备成细胞悬液，并要求被检细胞大小为 0.2 ～ 80pm ，每个样品中至少有 20000 个细胞，细胞浓度为 105 ～ 107 个／ ml 。制备成的单细胞悬液经荧光或免疫荧光标记即可上机检测。
长约为615nm。
• 1、离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次。 • 2、加入预冷70%乙醇，于4℃固定过夜，或-20℃长期固定。 • 3 、细胞染色：离心收集细胞，以 1mL 的PBS 洗细胞一次，加入 500uLPBS 含 50ug/mL PI ， 100ug/mL RNase A ， 0.2% Triton X-100， 4℃避光孵育30分钟。 • 4、流式分析：以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数 2-3万个细胞。

流式细胞术最全攻略：从protocol到问题解决

流式细胞术最全攻略：从protocol到问题解决文献中我们经常能看见这种图，也就是流式结果分析图，美观、简单、一目了然。

流式细胞术（flow cytometry）是20世纪60年代后期开始发展起来的利用流式细胞仪快速定量分析细胞群的物理化学特征以及根据这些物理化学特征精确分选细胞的新技术，主要分为流式分析和分选2部分。

今天我们主要介绍流式分析中基本操作与技巧，首先简要了解一下什么是流式细胞术。

一、流式细胞术的3大要素1. 流式细胞仪：现在市面上有多种型号的流式细胞仪，但其基本结构都是相同的，分析性流式细胞仪有液流系统、光路系统、监测分析系统。

（1）液流系统（2）光路系统光路系统始于激光器，其分类分法很多，最常用的分类方法是根据其发射的激光的波长来分，如常见的有488nm的蓝激光器、635nm的红激光器和405nm的紫激光器，不同的激光器发出的激光照射到细胞后产生的光信号会经过不同的光路系统被不同的通道接收。

流式细胞仪采集的光信号包括散射光信号和荧光信号，散射光信号也就是我们常说的FSC（前向散射光，反应细胞的大小）、SSC（侧向散射光，反应细胞的复杂程度）；荧光信号是细胞上结合有荧光素，被激光激发以后，会发射荧光信号。

（3）检测分析系统：流式细胞仪的检测分析系统就是以通道为单位将细胞的各个通道的光信号汇总分析，最后得出样品群体中细胞的物理化学特征。

通道，我们可以理解为就是光电倍增管，有2个作用，①将光信号转变为电子信号；②放大电子信号。

可以分为散射光通道（FSC通道、SSC通道）和荧光通道，一个激光器下可以有多个荧光通道，一个通道对应多个荧光染料，例如以beckman的DXflex机器的638nm 红激光器为例，APC通道可以接收APC、Alexa Fluor647、eFluor660荧光信号，原则上，这3种荧光素不能同时标记一个样品，否则，就无法分析该通道上的信号是来自于哪种荧光素。

另一个重要组成部分就是计算机分析系统，例如BD的DIVA系统。

pb流式反序列化

在编程领域，"pb流式反序列化"涉及到对Protocol Buffers（简称Protobuf）数据的处理。

Protocol Buffers是Google开发的一种数据序列化协议（类似于XML、JSON、YAML等），它更小、更快、更简单，因此也更受开发人员和公司的青睐。

"流式反序列化"通常是指在接收数据流的过程中实时进行反序列化操作，而不是等待整个数据流接收完毕后再进行反序列化。

这种方式在处理大型数据集或持续数据流时特别有用，因为它允许程序更早地处理数据并减少内存使用。

具体到"pb流式反序列化"，这通常意味着你正在使用Protocol Buffers的流式API来读取和反序列化数据流。

在Python中，这可以通过protobuf库中的parse_from_bytes或parse_from_string等方法实现，这些方法允许你从字节流中读取并反序列化Protocol Buffers消息。

请注意，为了正确地进行流式反序列化，你需要知道数据流中消息的结构（即.proto文件）。

如果你没有这些文件，你将无法正确解析数据流中的消息。

流式protocol

收获P3代生长状态良好细胞，0.25%胰酶消化，4 ℃离心，1 000 r/min，5 min。

↓用PBS(含1%BSA)清洗细胞3次，计数细胞。

↓各管依次加入单克隆抗体CD29、CD34、CD45、CD90。

↓同时每管样品设立同型阴性对照。

↓避光冰上孵育45 min。

↓用PBS(含1%BSA)洗涤细胞3次，以除去未结合抗体，用500 μL PBS(含1%BSA)重悬细胞，流式细胞仪进行检测分析。

（四个CD抗原分子，四个阴性对照，一个空白对照。

九个EP管）细胞一定要足够量，一般要求1×106个细胞。

对于直接标记单色样本，应该设置空白对照、阴性对照（同型抗体对照）和待测样本。

对于直接标记多色样本，在单色基础上另加补偿对照。

阴性对照的设置：在实验过程中，假设做直接标记法，可将实验组细胞，取一管，加上与实验抗体所标记的荧光颜色相同的同型对照来作为阴性对照。

空白对照：即不进行任何标记的细胞。

但是我们买的是pe和fitc荧光标记的抗体，那一管样品内可以同时加两中不同标记的抗体，那它们的同型对照怎么设置？我们的样品可以放在EP管里面吗？检测时，样品至少需要多少量？取第3代第3～5d BMSCs，胰蛋白酶-EDTA消化成为单细胞悬液；↓PBS（1到2ml）洗三次，离心，1000rpm，5min弃液；↓4%多聚甲醛1ml室温下固定40min，1000r/min,离心5min后弃去上清液↓PBS（1到2ml）洗两次，离心，1000rpm，5min弃液；↓分别加入500ul已经稀释的大鼠CD29、CD34、CD45及CD90单克隆抗体；↓避光孵育30min↓用PBS洗涤细胞两次，以除去未结合抗体；↓用PBS重悬细胞，流式细胞仪进行检测分析。

PBS洗涤细胞的过程中细胞丢失？解决办法有：（1）尽量采用尖底的离心管和水平离心机（2）离心后尽量用吸管吸取上清，不要倾倒；吸上清时最好残留1mm左右的水膜，不要吸完。

流式细胞仪Protocol

第一章流式细胞仪的结构和原理第1节流式细胞术发展史纵观历史，几乎没有哪一门科学技术象流式细胞术这样凝结了众多不同学术背景、不同科研领域科学家的心血。

从流式细胞术的发明、改进、革新，到今天在各个领域应用的拓展，每一步都是诸如生物学、生物技术、计算机科学、流体力学、激光技术、高等数学、临床医学、分子生物学、有机化学和生物物理学等学科知识综合运用的结晶。

现代流式细胞术更是由于结合了单克隆抗体技术、定量细胞化学技术和定量荧光细胞化学，使其在生物学、临床医学、药物学等等众多研究领域中的应用有了更加突飞猛进的发展。

临床流式细胞术发展趋势可归纳为：①流式细胞仪从单纯大型仪器发展为适应各种实际应用的便携式、台式、高分辨率、高质量分选的研究型流式细胞仪；②对流式细胞术检测荧光参数，从采用荧光单色、双色分析发展为多色分析，目前最多可同时检测15 种荧光信号；③从检测参数的相对定量发展为绝对定量；④从检测参数的手动人工分析发展为计算机软件的自动分析；⑤所采用的荧光试剂，从非配套试剂发展为配套的试剂盒试剂。

而这一切，就要求我们流式细胞仪使用者和科研人员一定要不断地有意识地学习上述各门学科知识，只有这样才能更好地将流式细胞术应用到生物医学的临床实践和基础科学研究工作中去。

流式细胞术的发展简史：1930年 Caspersson 和 Thorell 开始致力于细胞的计数；1934年 Moldaven 是世界上最早设想使细胞检测自动化的人，他试图用光电仪记录流过一根毛细管的细胞数量；1936年 Caspersson等引入显微光度术；1940年 Coons 提出用结合了荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白；1947年 Guclcer 运用层流和湍流原理研制烟雾微粒计数器；1949年 Wallace Coulter 提出在悬液中计数粒子的方法并获得专利；1950年 Caspersson用显微分光光度计的方法在紫外线（UV）和可见光光谱区检测细胞：1953年 Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理，成功地设计红细胞光学自动计数器；1953年Parker和Horst描述一种全血细胞计数器装置，成为流式细胞仪的雏形；1954年 Beirne和Hutcheon发明光电粒子计数器；1959年B型Coulter计数器问世；1965年 Kamemtsky等提出两个设想，一是用分光光计定量细胞成份；二是结合测量值对细胞分类；1967年 Kamemtsky和Melamed在Moldaven的方法基础上提出细胞分选的方法；1969年Van Dilla，Fulwyler及其同事们在Los Alamos，NM(即现在的National Flow Cytometry Resource Labs),发明第一台荧光检测细胞计；1972年 Herzenberg 研制出一个细胞分选器的改进型，能够检测出经荧光标记抗体染色的细胞的较弱的荧光信号；1975年Kochler和Milstein提出了单克隆抗体技术，为细胞研究中大量的特异的免疫试剂的应用奠定了基础。

流式抗体原理

流式抗体原理流式抗体（Flow Cytometry）技术是一种通过细胞悬液的单个细胞进行快速分析和分类的高通量技术。

它通过将特定的抗体与细胞悬液中的细胞表面分子结合，使用激光器作为光源，通过分析激光反射和透射能力以及荧光发射的颜色和强度，以便谱分析，并了解每个具有荧光信号的单个细胞母细胞。

流式抗体技术基于双激光流式细胞仪，通过细胞自由流经光束中的检测器，同时受到光的激发，特异性荧光标记的抗体搭载在细胞上，通过检测不同类型荧光信号来分析和鉴定细胞表面分子、内部结构、表达模式和细胞数目。

在流式抗体技术中，需要化学荧光染色剂或荧光标记的抗体对样品进行标记。

抗体通常用于成对标记，以确保细胞表面分子可以被测量。

常用的荧光染色剂是基于荧光素的化学成分，在特定光谱范围内发射信号。

流式抗体技术的工作原理涉及样本的针状进入流式细胞仪，通过加压系统将细胞单独分散，然后在光的照射下，分散的细胞穿过光束进行透射或反射。

同样，也可以添加荧光染色剂或抗体并用激光器进行照射，以便激发荧光标记的细胞表面分子。

在获取样品数据的过程中，每个细胞的光学属性都会被检测并识别出，数据被收集到计算机中进行统计和分析，并转换为直方图或散点图。

这些可以用来评估样品中不同的细胞亚群，进一步确定细胞数量的表达模式和细胞表面分子的表达模式。

流式抗体技术的优点流式抗体技术是一种非常强大的细胞分析方法，具有以下优点：1. 高灵敏度：可以对少量的目标样品进行分析。

2. 高稳定性：伴随对细胞和荧光信号的精确分析，流式抗体技术具有非常高的准确性和可重复性。

3. 快速性：可以分析数千个单个细胞，获取高通量数据。

4. 可靠性：对于定量化的目标细胞也具有非常高的精度。

5. 灵活性：可以用于多种样品类型，包括固体和液体样品。

6. 多功能性：可以用于分析细胞表达模式、细胞函数、蛋白质/基因表达、细胞亚群分布等，同时品种繁多的荧光标记抗体和染色剂可以用于多种不同的实验目的。

流式分析方法

Flowjo 是现在最受欢迎的流式数据分析软件，由于它简朴易用并且十分有效。

则本文将其基本操作以及对细胞凋亡和细胞周期的 Protocol 分享给大家。

1.打开 Flowjo 软件双击桌面 FlowJo 软件图标，进入软件工作台。

或软件工作台由菜单栏、惯用工具栏、组空间和样本空间构成。

2.F lowjo 分析单标样本单标记样本数据惯用的显示方式是单参数直方图。

普通横坐标能够是线性标度或对数标度，代表着所检测的荧光或散射光的强度；纵坐标表达的是横坐标某一特定荧光强度的细胞数，有时也用相对比例来体现。

以 3 color comp 文献夹中的 CyPE comp.fcs 进行分析演示。

将此文献夹移至桌面，并把该数据文献夹从桌面拖入 Flowjo 中的组空间中。

在组空间中单击选中“3 color comp”组，此时在样本空间里显示“3 color comp”组中的全部样本。

而后在样本空间中双击“Cy5PE comp.fcs”，出现图形窗口。

此为二维点图，X 轴选择 SSC（侧向散射，细胞内颗粒构造越复杂，质量越大，SSC 越大，反之越小。

）Y 轴选择 FSC（前向散射，细胞越大，FSC 越大；反之越小。

）选择设门工具（矩形门、椭圆门、多边形门、自动门）中的任意一种，在二维点图中选中淋巴细胞。

在图形窗口中双击选中的淋巴细胞，生成新的图形窗口。

在 X 轴选择 Cy5PE:CD4，Y 轴选择 Histogram，选择设门工具（区域门、双分门）中任意一种，在单参数直方图中设门。

3.F lowjo 分析多色标样本多色标记样本，包含双标记、三标记及以上的样本。

横坐标和纵坐标分别代表与细胞有关的两个独立参数，平面上的每一种点表达含有对应坐标值的细胞。

以三标记样本为例，选择 3-color-experiment 文献夹中的 931115-B02- Sample01.FCS 进行分析演示。

同样，在在样本空间中双击“931115-B02-Sample01.FCS”样本，出现图形窗口，显示为二维点图。