protocol 实验

引物 V3 4x10-2 μL
Tag 酶 0.1μL
Tag 酶在常温下也会起反应 ，故配制体系最后再加入
在 PCR 仪上进行扩增 5min95°c→39cycle 95°c 30s 65°c 30s → 10min72°c →12°c 72°c 30s 琼脂糖凝胶电泳：根据目的 DNA 的碱基对数选择配制 1%的琼脂糖凝胶 1. 称量 1g 琼脂糖粉于锥形瓶中 2. 称量 100mlTAE 至锥形瓶中 3. 将托板备好，插入梳子，把锥形瓶放入微波炉中煮热至冒泡融化即可 4.将锥形瓶取出冷却加入溴化乙锭（EB）7µl 5. 将琼脂糖倒入备好的托板挑去小泡 冷却 30min 6. 电泳 将已凝胶的托板放入电泳槽中，槽中 TAE 适量，略过胶面 加 2µlBuffer 混匀取 10µl 上样量， 盖好电泳仪盖 打开电源电流 100mA 电压 90V 电泳约 25min 即可 曝光验证
5、65～70℃水浴锅预热大的塑料培养皿，同时用烧杯预热蒸馏水。 6、将标本放于预热的培养皿枕垫上，将 50%的硝酸银溶液与 2%的明胶溶液以 2：
1 混匀后，立即滴加到染色体片上，盖上盖片。 7、待反应液由无色透明变黄，最后变成棕褐色（约 2～4min），立即取出玻片，
用预热的蒸馏水彻底冲洗，晾干后镜检。（染色适度的片子染色体呈金黄色， 核仁组织区位黑色。）
终浓度 50Mm Tris PH 7.5 50Mm EDTA PH 8
10ml 5M Nacl 2.5ml 1M DTT 250 1M Spermidiner 50ml 10% SDS
100Mm Nacl 5Mm DTT 0.5Mm Spermidine 1% SDS
储液 Tris ---HCL EDTA Nacl DTT SpμL
TEMED
4μL
8．倒去胶上 ddH2O，加浓缩胶至玻璃上缘 0.5cm 出，插上梳子，待胶凝固。
9．配制蛋白样品
蛋白
5×Loading Buffer
1×Loading Buffer
C6 10μL
2.5μL
0
MT2 5μL
七、血清蛋白样品制备
实验准备：
Agilent Hu 14 MARS
容量：8-10ul 人类血清/血浆 注意：使用期间，柱子填料勿干
1. 两个 50ml 离心管，分别盛放 A 液，B 液。 （每 8-10ul 血清样品约需 A 液 5ml,B 液 2ml）
2. 在针筒上标注”A”和”B” 注意：柱子平衡至室温操作 操作步骤：
还有一只睾丸和附睾 冰冻切片 然后 PFA 固定 1h PBS 5minx3 次 染色过夜 37 度 PBS 5minx3 次 核固红 5min 水冲一下 封片
六、联会复合体铺片硝酸银染色
1、取一个睾丸组织，在 PBS 中用镊子去除薄膜，将组织移入事先配好的 HEB 中，用镊子将组织轻轻扯开（注意不要剪碎），在 HEB 中放置 20min。
九、Western blot
制胶
1. 清洗制胶玻璃板、梳子，用吹风机吹干。
2. 安装好电泳槽。
3. 配制 12%的分离胶，配方如下：
30.8%AA
4 mL
1.5M Tris（pH8.8） 2.6 mL
ddH2O
3.2mL
10%SDS
100μL
10%APS
100μL
TEMED
4μL
4. 充分混匀后用大号枪头加入玻璃板间隙，速度不宜过快，胶液面高度适宜。
试验物品：引物 Mg2+ DNA 模板 DNTP Buffer Maker Tag 酶
实验仪器：PCR 仪 电泳仪 VDS
实验步骤：1.在 PCR 管内配制反应体系 20μL 体系
水
10..88μL
模板 3μL
Buffer 2μL
dNTP 2μL
Mg2+ 2μL
引物 F1 4x10-2 μL
引物 R2 4x10-2 μL
24.2g/200ml 29.2g/200ml 29.3g/100ml 1.54g/10ml 0.145g/ml 10g/100ml
PH 7.5 PH 8
1M 0.5M 5M 1M
1M 10%
三、PCR 技术
试验原理：以拟扩增的 DNA 分子为模板，以一对分别与模板 5'末端和 3'末端相互补的寡核 苷酸片段为引物，在耐热 DNA 聚合酶作用下以半保留复制的方法沿模板链延伸至完成新的 DNA 合成，重复此过程即可使目的 DNA 片段得到扩增。
第二天 取出 EP 管离心 8min 11000rpm 准备两个 EP 管，标明小鼠标号 标记包括对比标号 1 组加 1ml 100% coldEtoA 另一组加 750ul70%cold EtoA 将离心后上清液移入 100%EtoA 管中 倒置混匀 DNA
将 DNA 黏液用移液管吸出 加入 70%EtoA 摇晃，涡旋 离心 13000rpm 5min
2、处理玻片。将玻片插入事先配好的溶液（甲醇 40ul+HCL10ul），拿出后用电 吹风吹干。
3、取 1.5ml 的 EP 管，剪去上方开口部分，在其中加入 100mM 的蔗糖，从 HEB 中将组织移入蔗糖，并用剪刀剪成悬液。
4、在处理好的玻片上滴 1ml1%的 PFA，使聚于中央，在吸取 10ul 组织悬液滴于 PFA，左右摇晃使其铺满整张片子，放于湿盒，4℃过夜。
一、提取 RNA
1、 从液氮罐取出组织，放入盛有液氮保温瓶中 2、 用杵击碎组织，取小块放入刺破盖子的 EP 管，放入液氮中。 3、 将装有组织的 EP 管取出，组织倒入研磨器内，将其磨碎。 4、 磨碎组织中加入 350ul 裂解液，放入冰槽中充分反应。 5、 转移至 EP 管，离心 12000g×3min 6、 取上清液至 DNA 柱，离心 10000g×30s 7、 弃 DNA 柱，向流出液中加入 350ul 70%乙醇，转移至 RNA 柱，离心 10000g×15s 8、 弃流出液，加 700ul RW1 Buffer,离心 10000g×15s 9、 弃流出液，加 500ul RPE Buffer, 离心 10000g×15s 10、 弃流出液，加 500ul 80%乙醇，离心 10000g×2min 11、 弃流出液，换新管，干燥空转，离心 12000g×5min 12、 弃流出液，换 1.5mlEP 管，加 15ul Rnase free water ,离心 12000g×1min 13、 提取的 RNA2ul 加 98ul 的 Rnase free water ,配好后测定其浓度。
4. 孵育
室温静置柱子 5 分钟
5. 洗柱，收集流出液 F1 填料上方加入 400ul Buffer A， 离心 100g, 2.5 min 收集 F1 置之前的管子（此时，共 600ulF1）
6. 洗柱，收集流出液 F2 柱子置于另一收集管，标注”F2” 加 400ul buffer A, 离心 100g, 2.5 min 收集 F2
柱子干燥的处理： 如果离心过程中或者注射器洗脱时填料干燥,将 A 液重推入柱子
Tips: 1.滤器，针筒使用前润洗。 2.气泡入内结合不完全，去除高丰度蛋白效率可能下降，所以注意气泡。
保护柱子注意事项： 1. 填料勿干！ 2. 严禁 A，B 液外的任何物质接触柱内填料
3. 离心力 100g，超过 1000g 则损毁柱子
四、大鼠造模信息
1， 配药信息
2ug/kg/d 母液：称取 10mgBPA 溶于 1mlDAMSO 则 10ug/ul
子液：取 10ul 母液溶于 1mlDAMSO 则 1ug/ul ，30ul 分装，-20 度保存
2， 造模信息：
第一批：对照组三笼，实验组三笼，取点已经完成
第二批：对照组四笼，实验组三笼，信息如下：
5. 在胶面上方加入饱和正丁醇，压平液面，减少气泡。
6. 待胶凝固后，倒去正丁醇，用 ddH2O 洗 1~2 次，末次水不倒掉，防止配浓缩胶期间分离
胶干掉。
7. 配制 5%浓缩胶，配方如下：
30.8%AA
0.67mL
0.5M Tris（pH6.8） 500μL
ddH2O
2.7mL
10%SDS
40μL
7. 准备洗脱 移去 F2 管，接 Luer-Lock adapter
8. 洗脱 B 针筒吸入 2.5ml Buffer B，连 Luer-Lock adapter; 缓慢推入柱子，以洗脱高丰度蛋白 （注意：不要推入空气，柱体保持湿润） 若液面没有到填料顶端，吸入 1ml 空气，将其推入柱子，至页面到达填料顶端
实验组第一笼 实验组第二笼 实验组第三笼
雄性：2 只
1只
0只
雌性：7 只
5只
4只
对照组第一笼 对照组第二笼
对照组第三笼 对照组第四笼
雄性：2 只
3只
3只
5只
雌性：8 只
4只
1只
5只
3，取点信息：0 7 10 14 18 21 24 27 30 33 35
第一批老鼠每个时间点对照和实验组分别取一只 HE 片观察睾丸发育情况
9. 重新平衡： A 针筒吸入 5ml Buffer A, 连接柱子， 缓慢推入柱子， 柱子上面留液体保湿，进行下一次操作。 如果操作毕，则留 A 液于柱子顶端，盖上上下盖子，4 度储存。
10．超滤：5000g，4℃离心 1h（分两次）浓缩蛋白（3 KDa MWCO） 11．沉淀：按 1:3 体积加入沉淀液，-20℃过夜，次日 20000g，4℃离心 40min。吸干上 层沉淀液（注意沉淀液不能挥发得过干）。 12．复溶：加入 50μl 左右裂解液溶解蛋白。 13．Bradford 法测蛋白浓度。
1. 稀释，过滤样品： 8ul serum + 192ul buffer A = 200ul
两次 16ul serum + 384ul buffer A = 400ul 三次 24ul serum + 576ul buffer A = 600ul 将稀释样品滤过 0.22um 的滤器 (注意: Buffer A 中可以加蛋白酶抑制剂防蛋白降解)
八、小鼠睾丸涂片
1． 脱颈处死小鼠，取睾丸，去包膜。 2． 机械法加 1mL0.01M PBS 制成睾丸悬液。 3． 将悬液吸入 EP 管中。 4． 将悬液离心 1000g×5 min，倒去上清，加入 1mLPBS，混匀，反复 3 次。 5． 加入 DEME 培养液，DNase, Hoechst 染料。 6． 水浴加热 37℃ 20 min。 7． 离心 1000g×5 min，倒去上清，加入 1mLPBS，混匀，反复 3 次。 8． 涂片，镜下观察。
弃 EtoA（真空）确保 EtoA 全部吸出 不损失沉淀 空气中干燥 加 150mlTEBuffer 摇床 1h 37°C
涡旋使溶解 保存于-20°c 以用于 PCR
配方：Cutting-lyste Buffer 500ml 25ml 1M Tris-Hcl PH 7.5 50ml 0.5MEPTA PH8
第二批补全第一批的时间点老鼠，由于第二批实验组雄鼠太少，只能取全一个时间点，对 照组时间点补全
4，第三批已经开始造模，补全实验组标本
五、B-gal 染色
取野生型和杂合子老鼠各一只。野生型的老鼠附睾有着色 睾丸无着色 两侧睾丸和附睾分别做 2 组试验 其中一只睾丸和附睾 PFA 4 度 固定 4h 剪刀轻轻去掉包膜 PBS 5minx3 次 染色 4h 37 度
2. 准备柱子： 打开柱子上面盖子，下面塞子； 接 Luer-Lock adapter； 针筒吸取 Buffer A 4ml，连接柱子； 推入 buffer A, 去除柱内残留气泡； 移液枪吸去柱子顶端残留的 A 液。
3. 上样： 去掉 Luer-Lock adapter； 柱子置于收集管上，标注 ”F1”; 加入 200ul 稀释血清， 100g 离心 1.0 分钟（注意：盖子松） （流过速度<0.2ml/min 去除效果最佳）； 收集液体。 注意: 离心后填料保持湿润
二、cutting lysteDNA 提取
将 0.5cm 小鼠尾巴放于 1.5ml 离心管中，在小鼠耳朵上做记号以辨认 加 500ulCutting-lyste Buffer 于每管 加 20ul 新鲜事先准备的 0.1ng/ml Proteinasek(0.1ng/ml)
溶解于加入 cutting-lyste Buffer 后每管中 50-55°c 摇床，旋转过夜