免疫共沉淀(Co-IP)protocol
解析免疫共沉淀(Co-IP)技术：深入了解蛋白质相互作用及生物药物领域的突破性进展
解析免疫共沉淀（Co-IP）技术：深入了解蛋白质相互作用及生物药物领域的突破性进展蛋白质是生物体内执行重要功能的基本分子。
它们通过相互作用形成复杂的网络，调控生物过程的发生与发展。
了解蛋白质相互作用对于揭示细胞的功能和疾病的机制至关重要。
免疫共沉淀（Co-IP）技术是一种常用的方法，通过该技术可以研究蛋白质之间的相互作用关系，并在生物药物领域取得了一系列突破性进展。
一、Co-IP技术的基本原理。
Co-IP技术基于免疫学原理，利用特异性抗体将目标蛋白质与其相互作用的伴侣蛋白质结合，并通过免疫沉淀的方式将复合物从细胞提取物中富集出来。
该技术的核心是选择合适的抗体，使其能够高效、特异性地结合目标蛋白质。
随后，通过洗涤去除非特异性结合的蛋白质，最终得到目标蛋白质及其相互作用伴侣的复合物。
二、质谱技术在蛋白质片段表征中的应用。
质谱技术在蛋白质片段的表征中具有广泛的应用，它可以帮助我们确定蛋白质的氨基酸序列，识别和定量翻译后修饰，确定蛋白质的三维结构等。
这些信息对于理解生物药物的作用机制，评估药物的有效性和安全性，以及优化药物设计都具有重要的价值。
三、突破性进展：揭示蛋白质相互作用及生物药物研发。
Co-IP技术在蛋白质相互作用研究和生物药物研发中取得了重要突破。
以下是几个关键应用领域的例子：1.研究蛋白质复合物及信号通路：Co-IP技术可以帮助鉴定蛋白质复合物中的成员和相互作用方式，从而揭示细胞内复杂的信号通路网络。
例如，通过Co-IP技术，科学家们发现了许多关键的细胞信号通路，如MAPK和PI3K/Akt通路等，为深入理解这些通路的功能和调控机制提供了重要线索。
2.鉴定潜在药物靶点：利用Co-IP技术，研究人员可以筛选和鉴定与疾病相关的蛋白质相互作用伴侣，从而发现潜在的药物靶点。
这种方法在药物研发中具有重要的意义，可以加速新药的发现和开发过程。
3.生物药物研发：Co-IP技术在生物药物研发中的应用也非常广泛。
CO-IP免疫共沉淀
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
用抗体将相应特定分子沉淀的同时，与该分子特异性结合的其他分子也会被带着一起沉淀出来的技术。
这种技术常用于验证蛋白质之间相互特异性结合。
过程：免疫共沉淀（Co- Immunoprecipitation, Co-IP）是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的Protein A或G特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段的现象开发出来的方法。
其基本原理是，在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Agarose珠上的Protein A或G，若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—Protein A或G”，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。
然后经免疫印迹或质谱检测目的蛋白。
这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的，符合体内实际情况，得到的结果可信度高。
这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
免疫共沉淀优点（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
免疫共沉淀缺点（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
免疫共沉淀实验流程（1）转染后24-48 h 可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白免疫共沉淀酶抑制剂），冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C，最大转速离心30 min后取上清；（2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；（3）取10μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次3,000 rpm离心3 min；（4）将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连；（5）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液，沸水煮5分钟；（6）SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。
免疫共沉淀Co-IP实验操作步骤
免疫共沉淀Co-IP实验操作步骤一、原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。
如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose 的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
二、准备工作：预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2h室温孵育12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl"过渡抗体"（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）15. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。
免疫共沉淀(CoIP)
标签：免疫共沉淀蛋白质免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）可以：（1）测定两种目标蛋白质是否在体内结合；（2）确定一种特定蛋白质的新的作用搭档；（3）分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
详细实验方法免疫共沉淀(Co-IP)实验方法原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。
如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
目前多用精制的proreinA预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的proreinA就能吸附抗原达到精制的目的。
这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
实验材料蛋白质试剂、试剂盒RIPA BufferPBSProtein Aagarose琼脂糖考马斯亮蓝染色液仪器、耗材离心机摇床EP管细胞刮子离心管培养板电泳仪电泳槽高效液相色谱仪实验步骤一、试剂准备1. 预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机。
2. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS。
3. 加入预冷的RIPA Buffer(1 ml/107个细胞、10 cm培养皿或150 cm2培养瓶，0.5 ml/5×106个细胞、6 cm培养皿、75 cm2培养瓶）。
4. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15 min（EP管插冰上，置水平摇床上）。
5. 4℃，14000 g离心15 min，立即将上清转移到一个新的离心管中。
6. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠。
免疫沉淀、免疫共沉淀(Co-IP )protocal 操作流程
Co-IP ProtocolOverview:Day1 45min1.复苏2.铺板（晚上）Day2 40min3.转染（上午）4.换液（6小时候）Day4 1h5.48hr收细胞6.Co-IP(day1)到加抗体O/N7.Co-IP(day2) Day5 3-4h8.WB(day1)至一抗孵育Day5 or Day6 all day9.WB(day2),显影Day6 3-4hProcedures:1.Co-transfect myc-A and HA-B in 6 wells；2.Aspirate the medium and wash with PBS once (Careful not to the shake the cells off)；3.Harvest cells on ice with PBS+1%triton+Protease Inhibitor(100x) 300µl per well；4.Move liquid to 1.5ml EP tube；5.ice bath，Sonicate 8 strokes， 3-4 times every tube，open 2 secs，stop 2 secs；6.Rotate in cold room rotor for 20min；7.Centrifuge at max speed 20min, at 4°C；8.Collect supernatant. Get OFFER ( get 56 µl，add 14 µl 5xLoading Dye )。
OPTIONAL: PRECLEAR9.Pre-clear 150 µl supernatant with 60 µl protein-G beads for 1hr in cold room rotor.10.Centrifuge at 5000 rpm for 1 min at 4°C.11.Transfer the supernatant to a new tube.12.Add 2 µl of myc-Ab to IP；adding PBS to 800µl；13.Incubate O/N in cold room rotor；14.Add 60~100 µl of Protein-G beads；15.Incubate 2hrs in cold room rotor；16.Centrifuge 5,000rpm for 15min at 4°C；17.Wash with PBS + 1% triton for 4 times，every time centrifuge 3,000 rpm -5,000rpm for2-5min at 4°C；18.Wash three times with PBS，every time centrifuge 3,000 rpm -5,000rpm for 2-5min at4°C；19.Elude protein with 65 µl of 5x SDS loading buffer；20.Boil for 5 mins；21.Load 20 µl per hole to run western-blot for myc, HA and stim1。
Co-IP免疫共沉淀
Co-IP免疫共沉淀“ 此文回应小伙伴关于Co-IP的咨询。
”日常科研中，我们常需要研究多个蛋白（例如蛋白A、B、C）在细胞内的相互作用，会尝试解释其A、B、C上下游关系，那么必然需要涉及一个问题，即这3个蛋白是否能够互相结合。
对于已经研究成熟的蛋白而言，它们之间的相互作用是已确定的，所以蛋白之间能否相互作用这个问题被弱化了。
可是，当我们需要探索蛋白D和蛋白E之间未知的作用及可能存在的调控关系时，则必须要证明在生理情况下蛋白D和蛋白E能否互相结合，这是大前提。
在写免疫共沉淀（即Co-IP，Co-Immunoprecipitation）之前，首先得了解一下免疫沉淀（即IP，Immunoprecipitation）。
IP与Co-IP的原理都是借助抗原-抗体之间的专一性作用，形成抗原-抗体复合物，以此为基础研究蛋白质的经典方法。
从下面的流程图就能看出，Co-IP和IP的实验过程很类似，Co-IP是对IP的具体应用，二者还是有区别的。
IP是为了通过免疫沉淀，获得单个蛋白分子。
(IP流程，图片来自网络)Co-IP 是通过免疫沉淀获得已知的蛋白及其互相作用的蛋白，以确定这两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的方法。
(Co-IP流程，图片来自网络)有了上面的铺垫，更方便推出今天的主角，Co-IP。
设想一下。
例如，我们要研究蛋白X和蛋白Y之间是否存在相互作用，可以使用蛋白X的特异性抗体Z去结合蛋白X，假如蛋白Y能够与蛋白X 结合后相互作用，那么理论上蛋白X、Y和Z将形成一个X-Y-Z抗原抗体复合物。
此时，我们再使用protein A-琼脂糖珠耦合抗体Z，离心后就能得到protein A-琼脂糖珠-X-Y-Z复合物，加入上样缓冲液之后再煮沸，可以将protein A-琼脂糖珠-X-Y-Z复合物分解为protein A、琼脂糖珠、蛋白X、蛋白Y、蛋白Z。
然后再通过western blot电泳，可以在条带上显示出蛋白应该存在的位置。
Co-IP（免疫共沉淀）实验对照设计及结果分析介绍
Co-IP（免疫共沉淀）实验对照设计及结果分析介绍Co-IP是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，可以确定在生理状态下细胞内相互作用的蛋白质。
在蛋白复合物的研究中，不仅可以用于验证其存在，还可以发现新的蛋白符合物。
Co-IP的原理及操作当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。
假如细胞内存在XY蛋白复合物，用X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也被沉淀下来。
沉淀经多次洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，煮沸后离心收集上清，对上清进行免疫印迹（Western blot，WB）检测Y蛋白的存在，如果Y出现，则说明蛋白X与蛋白Y存在相互作用。
如果Co-IP实验的目的为验证两个已知蛋白之间的相互作用，则也可以分别给两个已知蛋白融合特定的标签，利用标签抗体实现蛋白的沉淀及沉淀复合物中目的蛋白的检测。
例如，分别使蛋白X及蛋白Y融合HA、c-Myc标签，利用HA标签的特异性抗体沉淀HA-X融合蛋白，随后利用c-Myc标签的特异性抗体对沉淀下来的复合物进行c-Myc标签的检测，如果存在c-Myc标签，则说明蛋白X与蛋白Y存在相互作用。
Co-IP实验对照设置为了确保最终得到的结果是天然状态下的相互作用，而不是由于某些方面造成的人工相互作用（也就是“假阳性”），在Co-IP的实验设计过程中，需要设置正确的对照。
假设Co-IP实验的实验组为“磁珠+抗X抗体+靶蛋白X+目的蛋白Y”，则可能出现的“假阳性”及对应需要设置的实验对照如下表所示：可能出现的“假阳性”需要设置的对照实验磁珠与蛋白X非特异性结合“磁珠+抗体X+抗体Y”磁珠与蛋白Y非特异性结合“磁珠+蛋白Y”抗X抗体和Y非特异性结合“磁珠+抗体X+蛋白Y”抗X抗体（或磁珠）会和细胞裂解液内其它蛋白结合“磁珠+抗体X+未转染质粒的宿主细胞裂解液”抗体的非特异性结合“normal IgG+蛋白X+蛋白Y”上述为了避免出现“假阳性”的对照称为阴性对照，除此之外Co-IP实验还会设置一个阳性对照组（Input组），Input组为直接利用抗体X（抗体Y）对细胞裂解液进行WB检测，验证细胞裂解液中存在蛋白X（抗体Y）。
（完整版）CO-IP说明书
（完整版）CO-IP说明书说明书（CO-IP26149）Pierce免疫共沉淀（Co-IP）试剂盒 261492181.6 描述26149 Pierce 免疫共沉淀（Co-IP）试剂盒，包含⾜够进⾏ 50 次免疫沉淀反应的试剂（每次使⽤ 25ul 树脂固相化抗体）试剂盒组分：加强型AminoLink偶联树脂，2 mL 固相树脂以50%的浆液形式提供（例如，100ul 50%的浆液含有50ul固相树脂）20×交联缓冲液，25mL，使⽤时稀释⾄：0.01M Na ，0.15MNaCl；pH 7.2氰基硼氢化钠溶液（5 M），0.5 mL淬灭缓冲液，50 mL ，1M Tris-HCl洗涤缓冲液，60 mL，1M NaClIP 裂解/洗涤缓冲液，2 50mL，0.025MTris，0.15M NaCl，0.001M EDTA，1% NP-40，5%⽢油；pH 7.4改良型杜⽒PBS （20×），25mL，使⽤时稀释⾄：0.008M Na 、0.14MNaCl、0.01M KCl；pH7100×条件缓冲液，5mL，中性pH 缓冲液洗脱缓冲液，50 mL，pH 2.8，含有伯胺⾮还原型泳道标记上样缓冲液，（5×），5 mL，0.3M Tris?HCl，5% SDS，50%⽢油，泳道标记⽰踪染料；pH 6.8Pierce 离⼼柱-带螺帽，100 个柱⼦，包含相应配件微量离⼼收集管，2 mL，100个微量离⼼样品管，1.5mL，50个Pierce对照⽤琼脂糖树脂（4％琼脂糖珠交联），2 mL 固相树脂以50%的浆液形式提供（例如，100ul50%的浆液含有50ul的固相树脂）⼲燥保存。
常温运输。
产品简介 Thermo Scientific Pierce免疫共沉淀（Co-IP）试剂盒通过将纯化的抗体直接固定在琼脂糖基质上，从细胞裂解液或其它复杂混合物中分离天然蛋⽩复合体。
免疫沉淀
免疫沉淀（IP） vs 免疫共沉淀（coIP）及ProtocolImmunoprecipitation (IP) is a method that uses the antigen-antibody reaction principle to identify a protein that reacts specifically with an antibody from mixture of proteins so that its quantity or physical characteristics can be examined.The target of IP is one specific individual protein.Steps of IP:1. Form the antigen-antibody complex (immune complex) by incubating specific antibody with the antigen-containing sample for 1 hour to several hours.2. Capture the immune complex on an immobilized Protein A or Protein G agarose gel support by incubation for 0.5-2 hours.3. Remove any non-bound protein (non-immune complex sample components) from the precipitated complex by washing gel support with additional sample buffer.4. Boil gel support in reducing SDS-PAGE sample loading buffer.5. Recover sample eluted in loading buffer from gel support and analyze by SDS-PAGE.6. Perform Western blot analysis, probing with antigen-specific antibody.Co-immunoprecipitation (Co-IP) is a popular technique for the analysis of protein interaction.Co-IP works by selecting an antibody that targets a known protein that is believed to be a member of a larger complex of proteins. By targeting this known member with an antibody it may become possible to pull the entire protein complex out of solution and thereby identify unknown members of the complex. So, Co-IP is one type of IP, which study the interaction of proteins.（可以说，coIP是“醉翁之意不在酒”的IP！）Steps of coIP:1. Lyse cells and prepare sample for immunoprecipitation.2. Pre-clear the sample by passing the sample over beads that are not coated with antibody to soak up any proteins that non-specifically bind to the beads.3. Incubate solution with antibody against the protein of interest. Antibody can be attached to solid support before this step (direct method) or after this step (indirect method). Continue the incubation to allow antibody-antigen complexes to form.4. Precipitate the complex of interest, removing it from bulk solution.5. Wash precipitated complex several times. Spin each time between washes or place tube on magnet when using superparamagnetic beads and then remove supernatant.6.After final wash, remove as much supernatant as possible.7. Elute proteins from solid support (using low-pH or SDS sample loading buffer).8. Analyze complexes or antigens of interest. This can be done in a variety of ways:SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) followed by gel staining.SDS-PAGE followed by: staining the gel, cutting out individual stained protein bands, and sequencing the proteins in the bands by MALDI-Mass SpectrometryTransfer and Western Blot using another antibody for proteins that were interacting with the antigen followed by chemiluminesent visualization.Protocols下载：Immunoprecipitation protocol 点击下载（Abcam）IP常见问题解析（Abcam）1. High backgroundCarry over of proteins that are not detergent solubleRemove supernatant immediately after centrifugations. This should leave insoluble proteins in the pellet. If resuspension occurs, centrifuge again.Incomplete washingWash well at relevant stages by placing a lid on the tube and inverting several times before centrifuging.Non specific proteins are binding to the beadsBeads are not pre-blocked enough with BSA. Make sure the BSA (fraction V) is fresh and incubate fresh beads 1 hour with 1% BSA in PBS. Wash 3-4 times in PBS before using them.Antibody used contains antibodies that are not specific enoughUse an affinity purified antibody, preferably pre-absorbed.Too much antibody used leading to non-specific bindingCheck the recommended amount of antibody suggested. Try using less antibody.Too many cells/too much protein in lysate leading to a lot of non-specific proteins in eluate Reduce the number of cells/lysate used. We recommend using 10-500 μg cell lysate. Non-specific binding of proteins to antibodyIf there are many proteins binding non-specifically, then try reducing the amount of sample loaded onto the beads. You can also pre-clear the lysate by pre-incubating the prepared lysate with the beads before commencing with the immunoprecipitation (please see the protocol). This should clear the lysate of any proteins that are binding non-specifically to the beads. Some researchers also use an irrelevant antibody of the same species of origin and same Ig subclass to pre-clear the lysate.Antigen degrading during immunoprecipitationEnsure fresh protease inhibitors are added when sample is lysed.2. High amount of antibody elutingToo much antibody eluting with the target proteinTry reducing the amount of antibody. Crosslinking the antibody to the beads before the immunoprecipitation and eluting using a gentle glycine buffer gradient should significantly reduce the amount of antibody eluted.3. No eluted target protein detectedTarget protein not expressed in sample used/Low level of target protein expression_r_r_r in sample usedCheck the expression_r_r_r profile of the target protein to ensure it will be expressed in the cells of your samples. If there is low level of target protein expression_r_r_r, increase the amount of lysate used. However, this may result in increased non-specific binding so it would be advisable to pre-clear the lysate before commencing with the IP procedure. Insufficient antibody for capture of the target proteinCheck that the recommended amount of antibody is being used. The concentration of antibody may require increasing for optimisation of results.。
免疫共沉淀protocol
免疫共沉淀实验技术（IP）一、原理：IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。
目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
1、实验仪器：高速组织捣碎机：SWISS KINEMATIC Ltd. Co（型号：PT1600E）电泳仪：北京六一仪器厂（型号：DYY-8C）电泳槽：北京六一仪器厂（型号：DYCZ-24D）转印槽：北京六一仪器厂（型号：DYCZ-40D）低温高速离心机：Sigma 公司（型号：Sigma 2-16k）超低温冰箱：SANYO（型号：MDF-382E）分光光度计：上海尤尼柯（型号：WFZ-UV-2000）脱色摇床：上海琪特分析仪器有限公司（型号：STS-2）2、主要试剂：HRP标记山羊抗小鼠二抗：北京中山（货号：ZB-2305）蛋白质预染分子量marker：FermentasA蛋白-sepharose珠：Pharmacia Biotech公司产品NC膜：Millipore公司（型号：0.45um）化学发光底物底物：PIERCE公司电泳类生化试剂均为美国amresco公司产品其他生化试剂为国药集团上海化学试剂公司产品总蛋白测定试剂盒：南京建成生物工程研究所二、操作流程1、样品准备1）取细胞加入500μl上样Buffer(无溴酚蓝)和50ul 10mg/ml PMSF，混匀，超声波破碎细胞2）4℃，12000rpm离心10min3）取上清夜，-70℃冻存24hr5）4℃12000rpm再次离心10min，取上清分装，一份用于定蛋白，另一份加入溴酚蓝(0.1%(W/V))后于100℃加热4min，后于-20℃保存待用。
2、定蛋白及计算电泳上样量根据总蛋白测定试剂盒说明书操作测定样本中的总蛋白含量，电泳上样量定为40ug3、免疫沉淀1）准备A蛋白-Sepharose珠：用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠2）准备A蛋白-Sepharose珠.一抗复合物：按每50 μl A蛋白-Sepharose珠中加入10ul 一抗，4℃孵育1 h，8000rpm离心5 min，PBS洗涤3次，加50ulPBS3）取100 μg总蛋白，加入50ul A蛋白-Sepharose珠.一抗复合物，4℃轻摇2h，PBS洗涤3次，之后加入50ul 1×SDS凝胶上样缓冲液，100℃变性3 min，以游离抗原、抗体、珠子，8000 rpm室温离心5 min，蛋白上清储于-20℃备用。
免疫共沉淀 Co IP protocol
免疫共沉淀(Co-IP)Protocol一、原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。
如果用蛋白质X 的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
二、准备工作：预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到 1.5EP 管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP 管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl"过渡抗体"（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）15. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min 变性。
免疫共沉淀中文使用说明书(Pierce26149)
Pierce® Co-Immunoprecipitation (Co-IP) Kit（26149）中文说明书介绍：Thermo 公司的Pierce®免疫共沉淀试剂盒，可通过将铆钉抗体固定在琼脂糖支撑物上，从裂解液中或其他复杂混合物中，分离出天然蛋白复合物。
Co-IP是一种研究蛋白与蛋白相互作用通用的方法，该方法使用一种诱饵蛋白与抗原进行免疫沉淀反应，然后可通过免疫共沉淀任何与诱饵蛋白具有相互作用的猎物蛋白。
传统的Co-IP方法使用蛋白A或G共同洗脱抗体的重链和轻链，这很可能导致将相关的蛋白一起洗脱下来，掩盖一些重要的结果。
Pierce®免疫共沉淀试剂盒通过将共价结合抗体固定在一个胺类活性反应树脂上解决了这一问题。
该试剂盒包含足够的用于蛋白结合和恢复的缓冲液，完成对照试验的高校离心柱和收集管，这些产品进一步缩短了操作实验的时间。
重要产品信息：略Co-IP实验步骤：A.抗体固定注意：以下试验步骤是针对用无胺和其他载体蛋白稀释的10-75μg亲和纯化抗体（参考重要产品信息一节）。
根据实际使用比例参考这一协议步骤。
参考重要产品信息节表1中的建议抗体用量和树脂体积用量。
1.室温平衡胺连接耦合树脂（AminoLink®Plus Coupling Resin）和试剂；2.为每个Co-IP反应准备2ml 1×Coupling Buffer（超纯水稀释20×Coupling Buffer）；3.轻轻涡旋混匀装有AminoLink®Plus Coupling Resin的瓶子，使其处于悬浮状态。
使用大口径（或剪掉一段枪头端），添加50μl树脂悬液到Pierce提供的离心柱中，将离心柱放入微量离心管中，1000g离心1min，弃滤液；4.添加200μl 1×Coupling Buffer 清洗树脂2次，离心弃滤液；5.将离心柱放于纸巾上，轻巧离心柱底部，去除剩余的液体，插上底塞；6.准备10-75μg亲和纯化抗体用于结合蛋白，调整体积至200μl，使用足够的超纯水和20×Coupling Buffer来制备1×Coupling Buffer。
免疫共沉淀
百泰派克生物科技
免疫共沉淀
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）是在免疫沉淀的基础上发展起来的研究蛋白质相互作用的分析技术，是免疫沉淀技术的补充和延伸。
很多刚入门的小白可能对免疫共沉淀Co-IP还不是很了解，所以今天小编带大家一起来了解免疫共沉淀的技术原理。
免疫共沉淀基于抗体与抗原特异结合的原理，利用专一性抗体特异性识别混合体系中两个相互作用的蛋白质中的其中一个，然后将两者一起沉淀出来，用来鉴定两种已知蛋白间的相互作用或者已知蛋白与某种未知蛋白间的相互作用。
该技术使用非变性剂裂解细胞，保留细胞中蛋白质A-蛋白质B间的相互作用，再将其与蛋白A 或B的专一性抗体混合，此时抗体会与蛋白A或B结合使其沉淀，同时蛋白B或A 也被共沉淀下来，这种一次免疫结合沉淀两种相互作用的蛋白的技术就叫免疫共沉淀。
百泰派克生物科技使用Thermo公司最新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪结合Nano-LC，提供免疫共沉淀蛋白互作分析服务，包括IP、Co-IP样品及GST融合蛋白Pull-down等样本中的蛋白/蛋白混合物互作分析，欢迎免费咨询。
免疫共沉淀(Co-IP)
¾ Protein A+G Agarose适合于免疫沉淀所有Protein A Agarose和Protein G Agarose单独可以免疫沉淀的抗体，包括mouse IgG1，IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, rat IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, rabbit IgG, rabbit and goat polyclonal Abs，以及human IgG1, IgG2, IgG3和IgG4。
使用说明：
1. 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)： A. 蛋白样品的准备： A1. 对于10厘米细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，PBS洗涤一次，然后加入500微升至2毫升细胞裂解液 裂 解 细 胞 。 可 以 使 用 碧 云 天 生 产 的 Western 及 IP 细 胞 裂 解 液 (P0013) 或 各 种 RIPA 裂 解 液 (P0013B 、 P0013C 、 P0013D或P0013E)等进行细胞的裂解。 A2. 对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。 A3. 对于悬浮细胞，离心收集细胞后，PBS洗涤一次，然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。 注： 详细的裂解方法参考不同裂解液的详细使用方法。对于不同的培养器材，参考10厘米培养皿的裂解液的用量进 行裂解。如果裂解获得的蛋白样品浓度过高，可以用裂解液或PBS适当稀释，如果蛋白样品浓度过低，在以后 的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量。 B. 去除非特异性结合(可选做)： B1. 取200微升至1毫升蛋白样品，蛋白量约为200微克至1毫克，加入约1微克和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普 通IgG和20微升充分重悬的Protein A+G Agarose，4℃缓慢摇动30分钟至2小时。 B2. 2500rpm(约1000g)离心5分钟，取上清用于后续的免疫沉淀。 注： 所谓种属相同的IgG是指，例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG，则在本步骤中可以加入normal mouse IgG，如 无normal IgG可以加入其它不影响后续检测的其它mouse IgG类型的抗体。通过和normal IgG和Protein A+G Agarose的孵育，可以充分降低非特异性的结合，降低背景。 C. 免疫沉淀： C1. 加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗，4℃缓慢摇动过夜。 C2. 再加入20微升充分重悬的Protein A+G Agarose，4℃缓慢摇动1-3个小时。(为方便后续的洗涤操作可以把加入充 分重悬的Protein A+G Agarose的量调整为40微升。)
免疫共沉淀、DAPI、荧光素酶报告protocol
免疫共沉淀实验（Coimmunoprecipitation）1，细胞接种和质粒转染：将消化完全的293T细胞（8×105）接种于6孔板，待细胞密度达到50-70%时，按照标准磷酸钙沉淀法进行转染；或者将消化完全的BHK细胞或pk15细胞（（8×105）接种于6孔板，按照Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染试剂说明进行转染。
2，细胞蛋白的收取：细胞转染24h-36h后，弃取培养液，并用预冷PBS洗涤两次。
每孔加入200μl蛋白裂解液（50mM Tris.Hcl,PH 8.0；150mM Nacl; 5mM EDTA,1% NP-40; 10% Glycerol, 配制成蛋白裂解基础液。
使用前，加入100×proteinase inhibitor cocktail 和10mM DTT）。
冰上孵育10min，涡旋1min，重复三次。
4℃，12000rpm，离心20min，收集上清，即为收取蛋白液。
3，杂蛋白的去除：向收取蛋白液中加入20μl Gamma Bind TM G Sepharose Beads ,于 4℃旋转摇床作用1h左右，以去除同Beads 非特异性结合的蛋白质。
4，4℃，3000rpm，离心3min，取上清。
BCA法测定蛋白浓度，并取500μg，调整到500 μl。
加入到预先混匀的15 μlBeads 和2μg 抗体中。
颠倒混匀，4℃旋转摇床最慢速度作用，2h至过夜。
5，4℃，3000rpm，离心3min，去除上清，并使用Lysis Buffer 基础液洗涤三次。
最后加入20μl 2X Loading Buffer, 煮沸5-10min。
4℃，3000rpm，离心3min，取上清。
6，选用合适浓度的分离胶电泳。
转印后进行Western blot检测。
激光共聚焦实验（Confocal assay）1，将玻片（Fisher brand，cover slips）预先在培养基中浸润，轻轻放入培养板孔内。
免疫共沉淀(Co-IP)
分离胶 将不同大小的蛋白分离开来
SDS-PAGE
胶板选择
根据样品数 和上样量数选择 适合尺寸的胶板 和相应的样品梳。
小型垂直电泳系统 14
胶浓度选择
根据待检测样品的分子量，选择合适浓度分离胶， 具体配置查阅分子克隆。
分离胶 H2O 30%丙烯酰胺 1.5MTris (pH8.8)
14聚 子阴0m%l合筛离（1后效子0 m形应去L）成。污交剂浓H叉，2缩O 网胶作状为结变构性，剂42m.使7和lml其助产溶生试分剂， 3断.3 m裂l 分子内和3分0%丙子烯间酰胺氢键，0.6去7 m折l 叠，消 2除.5 m电l 荷和分子1结M T构ris (的pH6影.8) 响。0.5 ml
淀实验，环状沉淀实验和凝胶内沉淀实验。
3
免疫共沉淀CoIP：
是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础 的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是 确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作 用的有效方法。
CoIP原理
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内 存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了 下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在 体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
•电泳条件： 70V恒压30 min； 120V恒压1-1.5 h（具体时间根据分子量大
小，及预染Marker指示位置）。
转膜准备工作（湿转法）
•转膜缓冲液配置（预冷） 1 L体系：12.1 g Tris base 14.4 g Glycine 5%-20%甲醇
• 醋酸纤维膜： 略比胶大，根据蛋白质分子量可以选择不同 规格的，0.22μm；0.45 μm
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免疫共沉淀Co-IP
百泰派克生物科技
免疫共沉淀Co-IP
免疫共沉淀，简称Co-IP，是一种广泛应用于发现和检测蛋白质与蛋白质相互作用的技术，优点是可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合物。
百泰派克生物科技提供Co-IP分析蛋白互作的服务。
Co-IP技术通过利用某一特定蛋白（诱饵蛋白）的特异性抗体间接捕获与该诱饵蛋白结合的蛋白，来鉴定天然状态下的蛋白与蛋白相互作用。
作为免疫沉淀（IP）实验技术的一种，Co-IP实验不仅可以捕获和纯化主要目标-诱饵蛋白，而且还可以捕获和纯化通过天然相互作用与诱饵蛋白结合的其他大分子。
相对于其他鉴定蛋白质互作的方法，Co-IP的优点主要是可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合物。
免疫共沉淀（Co-IP）实验步骤
免疫共沉淀实验主要包括了4个步骤：1.制备蛋白质混合物（细胞裂解液或组织提取物）；2.用结合有特异性抗体的亲和珠孵育蛋白质混合物；3.通过多个洗涤步骤清除未结合的蛋白质；4.通过SDS-PAGE，蛋白质印迹或质谱（MS）分析检测相互作用蛋白。
免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)原理及实验方法-英文
Principle:Co-Immunoprecipitation (Co-IP) was developed from the immunoprecipitation technique with which Co-IP shares the fundamental principle of the specific antigen-antiody reaction. Co-IP helps determine whether two proteins interact or not in physiological conditions in vitro. Graphically, the Co-IP principle is as described in the right hand side picture.The known protein (antigen) is termed the bait protein, and the protein it interacts with is called the prey protein. The standard Co-IP protocol is the same as that described for IP, and actually any system designed for IP should also work for Co-IP.After that cells are completely lysed under non-denaturing conditions, proteins that bound together are kept. Therefore if you use anti-X to precipitate protein X through Co-IP, then you can get other proteins that interact with protein Xin situ.Co-IP is applied to test whether two known proteins bind each other in cells, or to find a new protein that interacts with a known protein.Advantages:1.Proteins that interact in a typical Co-IP are post-translationally modifiedand conformationally natural.2.In Co-IP proteins interact in a non-denaturing condition which is almostphysiological.Disadvantages:1.The signals of low-affinity of protein interactions might not be detected.2.There might be a third protein in certain protein-protein interaction.3.To choose an appropriate antibody, the target protein needs to beproperly predicted. Or there would not be a positive result in Co-IP.Reagents and buffers:•PBS•RIPA (RadioImmunoPrecipitation Assay) Lysis buffer:Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4Nonidet P-40 (NP-40): 1%Deoxycholate Na：0.25%NaCl: 120 mMEDTA: 1 mM*PMSF: 1 mM*Leupeptin 1 μg/ml*Aprotinin 1 μg/ml*Pepstatin1 μg/ml*Na3VO4: 1 mM*NaF: 1 mMNote: Ingredients labeled with * should be added right before each use. PMSF degrades to a half after 30min in water.•Washing buffer :lysis buffer:5M NaCl =100:1 (ensure NaCl not exceed 1M)•protein A/G-agarose beads•Specific antibody (MAb or PAb)Protocol:DAY 11.Carefully wash cultured cells with pre-chilled PBS for 2 times.2.Add in cold RIPA lysis buffer (1ml for 107cells).3.Scrap cells off to clean 1.5ml eppendorf tubes with a clean, cold scraper.Put them on a low-speed rotating shaker for 15 min at 4°C.4.Centrifuge at 14,000 g 4°C for 15min, transfer the supernatant to newtubes immediately.5.Wash protein A/G-agarose beads for 2 times with PBS and make a 50%protein A/G agarose working solution (in PBS)6.Add in 50% protein A/G agarose with ratio of 100μl for a 1ml samplesolution. Shake on horizontal shaker for 10min, 4°C (This step aims to eliminate non-specific binding proteins)7.Centrifuge 14,000g at 4°C for 15min, transfer the supernatant to newtubes and discard protein A/G-agraose beads8.Quantify total protein with BCA assay or other methods.9.Dilute the total protein to 1μg/μl with PBS to decline the concentrations ofdetergents. If you feel the concentration of your target protein is low, you can dilute the total protein to 10μg/μl. (if it’s high enough)10.Add in appropriate amount of primary antibody to approximately 500μltotal volume..11.Slowly shake antigen-antibody complex on rotating shaker at 4°C forovernight.Note: if downstream experiment is enzyme activity assay for kinase or phosphatase, it’s better to change step 11 to a 2h incubation at room temperature.DAY 212. Centrifuge 14,000g for 5s, keep the pellet and wash with pre-chilledw ashing buffer (or cold PBS) for 3 times. (800μl each)13. Collect the supernatant to proceed to SDS-PAGE, western-blot, or mass spectra analysis.Note: This Co-IP protocol is to bind antibody to the Protein A/G-argarose beads and then mix with the antigen. It gives lesser yield than the other one and avoids the problem of co-elution of antibodies. If you want to yield high purity of target protein regardless of non-specific binding, you can mix antibody with protein sample prior to addition of Protein A/G-agarose beads, thus in the end the antibodies are also co-eluted with target protein and interference might occurs in western blot detection.。
Co-IP原理与方法
Co-IP原理与方法免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）原理IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合到抗体（免疫球蛋白）的FC片段的现象开发出来的方法。
目前多用protein A/G预先结合在argarose beads 上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A/G 就能达到吸附抗原的目的。
通过低速离心，可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。
免疫沉淀实验的操作步骤比较多，同时由于在非变性条件下进行实验，所以要得到一个完美的实验结果，不仅需要高质量的抗体，同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。
免疫沉淀实验从：蛋白样品处理；抗体-agarose beads孵育；抗体-agarose beads复基本实验步骤(1）收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上或者4℃裂解30min，12,000g离心30 min后取上清；(2) 取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl proteinA/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；(3）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 g速度离心5 min，将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；(4）SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。
一、样品处理：免疫沉淀实验成功与否，第一步处理样品非常关键。
免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量，浓度以及抗原是否处于天然构象状态。
所以制备高质量的样品以用于后续的抗体-agarosebeads孵育对免疫沉淀实验是否成功非常关键。
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免疫共沉淀(Co-IP)Protocol一、原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。
如果用蛋白质X 的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
二、准备工作：预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到 1.5EP 管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP 管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl"过渡抗体"（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）15. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min 变性。
RIPA Buffer配制：基础成分：Tris-HCl（缓冲液成分，防止蛋白变性）NaCl（盐份，防止非特异蛋白聚集）NP-40（非离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液）去氧胆酸钠（离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液；避光保存）注意：准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失。
RIPA蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF）（用异丙醇配制成200mM的储存液，室温保存）EDTA（钙螯合剂；用H2O配制成100mM的储存液，PH 7.4）亮抑酶肽（Leupeptin）（用H2O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存）抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用H2O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存）胃蛋白酶抑制剂（Pepstatin）（用甲醇配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存）RIPA磷酸（酯）酶抑制剂激活的Na3VO4（用H2O配制成200mM的储存液，见Sodium Orthovanadate Activation Protoco）NaF（200mM的储存液，室温保存）注意：在准备做磷酸（酯）酶实验的时候，不加磷酸酯酶抑制剂工作液配制：配制100ml的modified RIPA buffe：1. 称取790mg 的Tris-Base，加到75ml 去离子水中，加入900mg的NaCl，搅拌，直到全部溶解，用HCl调节PH值到7.42. 加10 ml 10%的NP-403. 加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清4. 加1 ml 100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2-8℃保存5. 理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂各100 μl; PMSF, Na3VO4, NaF各500 μl），但是PMSF在水溶液中很不稳定，30分钟就会降解一半，所以PMSF应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。
各种成分在工作液中的终浓度：* Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4* NP-40: 1%* 去氧胆酸钠：0.25%* NaCl: 150 mM* EDTA: 1 mM* PMSF: 1 mM* 抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂: 各1 μg/ml* Na3VO4: 1 mM* NaF: 1 mM三、实验流程为：（1）转染后24-48 h 可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C，最大转速离心30 min后取上清；（2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；（3）取10μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次3,000 rpm 离心3 min；（4）将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连；（5）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液，沸水煮5分钟；（6）SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。
通过免疫共沉淀确定结合蛋白1．用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。
刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。
2．将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上4℃以最大速度离心15 min。
3．收集上清（约30 ml）并加入30μg的适当抗体，4℃摇动免疫沉淀物1 h。
4．加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液，4℃摇动免疫沉淀物30 min。
5．用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重复洗5次。
最后，用NETN洗一次。
6．吸出混合物的液体部分。
加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4 min。
7．将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中，在10 mA的恒定电流下电泳过夜。
8．通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。
9．从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1ml 50%乙腈洗两次，每次3 min。
10．用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱。
11．通过窄孔高效液相色谱分离肽。
将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。
四、注意的问题：（1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40 或Triton X-100)。
每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。
不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。
（2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用（3）使用对照抗体：单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗兔多克隆抗体：正常兔IgG在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性，应注意以下几点：(1) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；(2) 要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀；(3) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。