生物分离工程：电泳.ppt
生物分离工程第八章电泳技术ppt课件
PAGE的具体操作过程
制胶：确定凝胶配方（凝胶、引发剂、增速剂的浓度和缓 冲液），使用灌胶模具灌胶；
样品准备：选择合适的样品缓冲液、确定合适的样品浓度 （1~2mg/L，考染），加样（溴酚蓝）；
电泳：4~6小时，待溴酚蓝前沿到达阳极底部； 检测：紫外扫描或染色（考马斯亮蓝R-250、银染色—灵
凝胶浓度太小，孔径太大，样品中各种蛋白质分子均 随缓冲液推进，不能得到很好的分离；
凝胶浓度与分子量测定的关系
凝胶浓度 (C=2.6%)
5 10 15 20
分子量范围 (kDa) 30~200 15~100 10~50 2~15
凝胶浓度 (C=5%)
5 10 15 20
分子量范围 (kDa) 60~700 22~280 10~200 5~150
凝胶电泳的分离区带或电泳斑点转移到特定的膜上， 如PVDF膜
电泳洗脱仪：回收样品
凝胶扫描和摄录装置：对电泳区带进行扫描，从而给 出定量的结果。
垂直电泳槽及灌胶模具
电泳的一般过程
常规聚丙烯酰胺凝胶电泳
原理：
由于聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是多孔介质，不仅 能防止对流，把扩散减少到最低；而且其孔径大小与 生物大分子具有相似的数量级，能主动参与生物分子 的分离，具有分子筛效应。
工作原理
蛋白质的等电点 蛋白质最主要的特性是它的带电行为，它们在不 同的pH环境中带不同数量的正电或负电，只是 在某一pH时，蛋白质的净电荷为0，此pH即为该 蛋白的等电点（isoelectric point pI）。
生物分离工程前沿 ppt课件
分离技术面临的机遇与挑战
随着生物和医药工程的迅速发展，一批高附加值 的产品不断涌现，品种和产量也在迅速扩大。 “难度大，成本高”。生物技术产品一般具有 多样性、易变性和复杂性。因此，生物物质的 分离除了要达到化学物质分离的纯度和经济性
指标外，还要满足构象和稳定性的要求，特 别要防止生物产品的失活。
单元分离技术，如：亲和法、双水相分配技术、逆胶
束法、液膜法、各种高效层析法
方向二：进行各种分离技术的高效集成化
将双水相分配技术与亲和法结合而形成的效率更高、
选择性更强的双水相亲和分配组合技术、将亲和色谱
及膜分离结合的亲和膜分离技术及可以将离心的处理
量、超滤的浓缩效能及层析的春花能力合而为一的扩
张床吸附技术等。
与温度诱导相分离的集成
与亲和沉淀集成
源自文库 与层析分离的集成
（2）亲和膜分离技术
亲和膜分离技术是将亲和色谱与膜分离技术结合起来的一项新型 分离技术 它把亲和配体结合在分离膜上,利用膜作基质,对其进行 改性,在膜的内外表面活化并藕合上配基,再按吸附、清洗、洗脱 、再生的步骤对生物制品进行分离,当目标蛋白质通过时,就留在 膜上,而杂质则通过膜而离去,再用解离洗脱剂洗脱下目标蛋白质, 然后把解离剂从膜上除去,得以使配基再生,重复进行再分离目标 蛋白。该技术颇有潜力,可以把澄清、浓缩、纯化步骤于一体,也 可以与生物反应器相结合,构成反应一分离新流程。亲和膜分离技 术不仅利用了生物分子的识别功能,可以分离低浓度的生物产品, 而且由于膜的通透量大,能在纯化同时实现浓缩,并有操作方便、 设备简单,便一于大规模生产的特点 日前亲和膜分离技术已应用 单抗、多抗、胰蛋白酶制剂的分离以及抗原、抗体、重组蛋自、 血清白蛋白、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、干扰素等的纯化
电泳技术(共21张PPT)
3 电泳：E 10~25V/cm，0.5～2h
4 显色
第6页，共21页。
四 薄层电泳
将支持物与缓冲液调制成适当厚度的薄层进行电泳。 常用支持物：淀粉、琼脂、纤维素粉、硅胶等 操作：
1 缓冲液选择 离子强度较高的缓冲液 2 支持物处理 精制品 3 薄层板制作
4加样：挖沟、混合样品、填埋
Aa：茚三酮、靛红
干法、湿法 分类：垂直管型盘状电泳、垂直板型电泳；
1 电泳：带电粒子在电场中向着与其本身电荷相反的电极移动的过程。
4 电泳 5（电泳过程实测）， CH2(NH2)COO－增加，泳动速度增大，很快超过P， P在均一的电位梯度和pH条件下分离
凝胶（如聚丙烯酰胺凝胶）
蛋6的白缓质冲（液P（）巴泳电比动妥速桥缓度冲介水液于p平快H慢8、.离子加之间盖、电压稳定、注意时间
分离测定： 测分子量（与标准蛋白比较）
鉴定样品纯度（条带数目）
测定样品P含量：扫描定量（比色）
第14页，共21页。
凝胶电泳的操作要点
1 凝胶制备 2 电极缓冲液 泳动度：带电颗粒在单位电场强度下的移动速度。
5（电泳过程实测）， CH2(NH2)COO－增加，泳动速度增大，很快超过P， P在均一的电位梯度和pH条件下分离 凝胶（如聚丙烯酰胺凝胶）
CH2(NH2)COOH → (样品胶、浓缩胶pH6.7~6.8） →
生物分离工程 电泳65页PPT
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71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
生物分离工程 电泳
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53、人们通常会发现，法律就是这样 一种的 网，触 犯法律 的人， 小的可 以穿网 而过， 大的可 以破网 而出， 只有中 等的才 会坠入 网中。 ——申 斯通 54、法律就是法律它是一座雄伟的大 夏，庇 护着我 们大家 ；它的 每一块 砖石都 垒在另 一块砖 石上。 ——高 尔斯华 绥 55、今天的法律未必明天仍是法律。 ——罗·伯顿
生物分离工程
生物分离工程
生物分离工程是指采用物理、化学和生物学方法将生物体或其组成部分从混合物中分
离出来，并纯化得到目标物质的一种工程领域。该领域涉及到许多专业知识，包括生物学、生化学、物理化学等多个学科的理论和技术，应用广泛。
生物分离工程的目的是将生物体中的目标物分离出来，以便进行药物发现、分析化学
以及生命科学研究等方面的应用。生物分离工程包括生物分离过程、分离器设备及工艺控
制等多个方面。
生物分离过程是将混合物中的目标物通过特定的工艺流程进行分离，得到纯化的目标
物质。一般包括以下几个步骤：
（1）前处理：对样品进行初步处理，如细胞破碎、离心、过滤等。
（2）初步分离：将混合溶液通过某些技术方法进行初步分离，如各种色谱技术、电泳分离、凝胶柱分离等。
（3）中间分离：在初步分离的基础上，对样品进一步处理，如双向电泳、反渗透膜分离、超重力分离等。
（4）终极分离：最后通过某些技术，将目标物质从混合物中完全分离出来，如聚集素层析、反转移层析、凝胶电泳等。
分离器设备是指在生物分离过程中使用的各种设备，根据不同的分离过程，分离器设
备也有所不同。例如，在分离蛋白质时，最常用的分离器设备是各种色谱技术和电泳分离
设备，而在分离细胞时，采用的设备则主要是离心机、过滤器等。
工艺控制是指对生物分离工程中各个步骤进行控制和调节，以确保分离工艺的有效性
和纯化度的提高。常用的工艺控制手段包括调节温度、压力、流量等系列参数的控制，并
且可以采用自动化操作，进一步提高生物分离工程的自动化程度。
生物分离工程的应用非常广泛，包括生命科学研究、药物研发、食品工业以及纯化工程、环境保护等方面。例如，在药物研发中，生物分离工程用于分离制备药物，提高药物
第03章 萃取分离技术 生物分离工程ppt
3.4.1 双水相系统
当两种聚合物水溶液互相混合时， 两种被混合分子间如 存在空间排斥力，表现出不相溶性(incompatibillty)；当聚合 物浓度达到一定值时，在达到平衡后就不能形成单一水相， 而形成分别富含不同聚合物的两相。
2．盐的种类和浓度
盐的种类和浓度对分配系数的影响主要反映在对 相间电位和蛋白质疏水性的影响。
双聚合物系统中，无机离子具有各自的分配系数 。 可以看出，不同电解质的正负离子的分配系数不同 ，因此在两相间形成电位差。由于两相均应各自保持 电中性，这对带电生物大分子，如蛋白质、核酸等的 分配产生很大影响。
K0
通过测定不同盐类存在下分 配系数与pH之间的关系曲线 的交点，可测定蛋白质、细 胞器以及微粒的等电点，该 方法为交错分配法(cross partitioning)。
BSA的交错分配曲线，箭头所指为交点处的pH和K值
4.4％PEG 6000／7％Dex T—500，20℃ (O) 0.1mol／L NaCl； (●)0.05mol／L Na2SO4
2．疏水作用
蛋白质表面均存在疏水区。 不同蛋白质具有不同的相 对疏水性。 pH为等电点的双水相中，蛋白质主要根据表面 疏水性的差异产生各自的分配平衡。
生物分离工程
绪论
1、生物分离工程的定义：从发酵液或酶反应液或动植物细胞培养液中分离、纯化生物产品的过
程。
2、生物分离工程特点：1发酵液或培养液是产物浓度很低的水溶液；2培养液是多组分
的混合物；3生化产品的稳定性差；4对最终产品的质量要求高。
3、生物分离工程可分为几大部分，分别包括哪些单元操作？
答：1、发酵液的预处理与固液分离，过滤(filtration) 、离心(centrifugation) 2、初步纯化，沉淀(precipitation) 、萃取(extraction) 、吸附(adsorption )、膜分离(membrane separation) 3、高度纯化，色谱(chromatography )、电泳(electrophoresis) 4、成品加工，结晶(crystallization) 、干燥(drying)。
4、在设计下游分离过程前，必须考虑哪些问题方能确保我们所设计的工艺过程最为经济、可靠？答：1、产品价值2、产品质量3、产物在生产过程中出现的位置4、杂质在生产过程中
出现的位置。5、产品和主要杂质独特的物化性质6、不同分离方法的技术经济比较。
5、阐述生物分离工程的发展动向。
答、1、基础理论研究2、提高分离过程的选择性3、开发分离介质4、提高分离纯化技
术5、清洁生产6、规模化、工程化研究
6、分离效率的评价：目标产物的浓缩程度、分离纯化程度、回收率
第二章细胞分离与破碎Cell isolation and disruption
1 如何预处理发酵液？
答：1.高价无机离子的去除方法去除钙离子：通常使用草酸。去除镁离子：加入三聚
蛋白质电泳技术PPT课件
• 种类 分离原理 特性
物质
薄膜类 电荷密度 化学惰性 纸、醋酸纤维素薄膜、
对流扩散小
聚酰胺薄膜
凝胶类 电荷密度 同上+多孔性分 （淀粉）、聚丙烯酰 分子大小 子筛效应 胺凝胶、琼脂糖凝胶、 新型凝胶介质
.
7
5.检测-染色方法
• 考马斯亮蓝：常用 • 荧光染料：灵敏 • 硝酸银：灵敏 • 酶活性 • 免疫学：专一 • 特殊蛋白质
o 电泳速度 o 分离度
v=μepE=μepJ/K
R UeLff U 4 2 LD 4 2 D
.
2
影响电泳的环境因素
电泳速度 v=μepE= εζE/(Cη)
o C: 6πor 4π
•E • pH: pI(~4-7), 缓冲溶液pH(~8-9.5), 向？极泳动 • 离子强度I: 0.02-0.2 • 电渗 • 温度：焦耳热 • 介质：孔径、制胶重复性等
o 蛋白质转移-固定基质(硝酸纤维素膜等)
• 电泳印记转移
o 封闭-蛋白质溶液处理封闭“印记”上剩余 的疏水结合位点
o 免疫检测
• 目标蛋白抗血清结合，洗去未结合一抗 • 标记二抗与一抗结合 • 不同方法检测标记物
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36
个人观点供参考，欢迎讨论！
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Leabharlann Baidu
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电泳PPT课件
（三）电 泳
将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上 （点样面朝上），另一端平贴在阳极端支架上(见下图)。 要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。
连接好电泳仪。在室温下电泳，打开电源开关，调节电 压为130伏10分钟，160电泳伏50分钟，总共50分钟。电 泳后，调节旋钮使电压为最低，关闭电泳仪切断电源。
SO3Na
R-250
Βιβλιοθήκη BaiduG-250
考马斯亮蓝R-250是通过范德瓦尔键与蛋白质结合，尤 其适用于SDS电泳微量蛋白质染色。它与不同蛋白质结合 呈现出基本相同的颜色，并且在比较宽的范围内（15—20 g），扫描峰的面积与蛋白量呈线性关系。
考马斯亮蓝G-250染色灵敏度不如R-250，其优点是在三 氯乙酸中以胶体形式存在，能选择性地和蛋白质形成复合 物，染色迅速，着色深的蛋白质区带在数秒内即可显现出 来，约45分钟后着色最深，本底低，重复性好，适用于定 量分析。
血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱示意图
（五）记录和分析实验结果
漂洗完毕后将薄膜取出, 放在滤纸上。 将薄膜上的5条色带根据其颜色深浅、形 状、大小及相对位置进行描述、记录在 预习本上，并判断分析其结果。
六、注意事项
1、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。 2、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，
实验一 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳
电泳技术PPT课件2
医用检验技术及应用
电泳技术
第六节 免疫电泳
电泳技术与免疫技术相结合，大大扩大了 其临床应用的范围，于1953年Grabar和 Williams首次将凝胶扩散置于直流电场中进行， 让电流来加速抗原与抗体的扩散并规定其运行 方向，并与免疫沉淀反应相结合,该技术有两大 优点，一是加快了沉淀反应的速度，二是将某 些蛋白组分利用其带电荷的不同而将其分离开， 再分别与其对应抗体反应，以此作更细微的分 析。
第二维电泳，即SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)，使电泳迁移率主要取决于蛋 白质或亚基分子量的大小。
医用检验技术及应用
电泳技术
第四节 二维电泳
• 检验医学中的应用
医用检验技术及应用
电泳技术
一个问题：如何确定某个条带
是什么蛋白质？
图 6-1 正常血清蛋白电泳图谱
上图：箭头示电泳方向，右侧示各条带的主要组分； 下图：光密度扫描后电泳图谱；HP：触珠蛋白；CP：铜蓝蛋白
chromatography, MECC)
– 等电聚焦电泳（isoelectric focusing, IEF) – 等速聚焦电泳 (isotachophoresis, ITP) – 毛细管电色谱（capillary electrochromatography, CEC） – 亲和毛细管电泳（affinity capillary electrophoresis, ACE） – 电动色谱(electrokinetic chromatography, EKC) – 非水相毛细管电泳（non-aqueous capillary electrophoresis,
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳ppt课件
。SDS与蛋白质形成复合物（1g蛋白质与1.4g SDS结合），而
SDS的负电荷大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而掩盖了
不同种蛋白质间原有的电荷差别，使复合物都带上相同密度
的负电荷。SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质
.
16
胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取 决于分子量的大小。由于蛋白质－SDS复合物在单位长度上 带有相等的电荷，它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离 胶，进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，蛋白质 大小与泳动速率成反比。 •当蛋白质的分子量在15-200kD之间时，电泳迁移率与分子量的 对数呈线性关系。 •蛋白质被考马斯亮蓝染成蓝色，醋酸脱去凝胶上的蓝色而使背 景无色。
5
灌胶
.
6
SDS-PAGE电泳模具
灌胶室（上槽） 玻璃板
螺栓 滑块
旋钮
上盖
制胶架
下槽
.
7
步骤2：制胶
.
8
制浓缩胶（每4人制一份）
4%浓缩胶配方
水
30%Acrylamide/Bis
6.1ml
1.3ml
凝胶缓冲液(pH6.8) 2.5ml
10%SDS(W/V) 0.1ml
总体积 10ml
a. 待分离胶完全凝固（约30min，此时分离胶与水层有明显的
混匀，点样。）
电泳介绍PPT课件
超滤系统的优点
▪ 回收电泳涂料，提高涂料的利用率，降低电泳 后清洗纯水的用量。
使用超滤装置，利用超滤液充分洗涤 除去粘附在被涂物上的电泳涂料 实现电 泳后的“封闭回路”水洗，涂料回收利 用率可达98％以上，而不使用超滤装置， 其电泳涂料使用率仅为70％ -80％
超滤系统的优点
▪ 减少污水处理量及处理费用，有利 于环境保护。
电泳示意图
源自文库
电泳的主要应用
▪ 汽车整车、机械零部件 ▪ 建材、五金 ▪ 金属防腐，有色金属防变色处理 ▪ 文教用品工具 ▪ 金属眼镜架 ▪ 文教用品 ▪ 电子、电器产品
ELECTROCLEAR®
透明电泳 保留金属本色或拉丝等表面处理效果， 透明电泳起防腐，耐指纹作用
彩色电泳 在工件表面形成彩色漆膜 达到高光、半哑、亚光的效果
ELECTROCLEAR®
阴极电泳介绍 （阳离子性电泳涂料）
生物分离工程
绪论
1、生物分离工程的定义：从发酵液或酶反应液或动植物细胞培养液中分离、纯化生物
产品的过程。
2、生物分离工程特点：1 发酵液或培养液是产物浓度很低的水溶液；2 培养液是多组
分的混合物；3 生化产品的稳定性差；4 对最终产品的质量要求高。
3、生物分离工程可分为几大部分，分别包括哪些单元操作？
答：1、发酵液的预处理与固液分离，过滤(filtration)、离心(centrifugation) 2、初步纯化，沉淀(precipitation)、萃取 (extraction)、吸附（adsorption）、膜分离(membrane separation)3、高度纯化，色谱（chromatography）、电泳(electrophoresis)4、成品加工，结晶(crystallization)、干燥(drying)。
4、在设计下游分离过程前，必须考虑哪些问题方能确保我们所设计的工艺过程最为经
济、可靠？
答：1、产品价值2、产品质量3、产物在生产过程中出现的位置4、杂质在生产过程中出现的位置。5、产品和主要杂质独特的物化性质6、不同分离方法的技术经济比较。5、阐述生物分离工程的发展动向。
答、1、基础理论研究2、提高分离过程的选择性3、开发分离介质4、提高分离纯化技术5、清洁生产6、规模化、工程化研究
6、分离效率的评价：目标产物的浓缩程度、分离纯化程度、回收率
第二章细胞分离与破碎Cell isolation and disruption
1如何预处理发酵液?
答：1.高价无机离子的去除方法去除钙离子：通常使用草酸。去除镁离子：加入三聚磷酸钠，与镁离子形成络合物。用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。去除铁离子: 加入黄血盐，使其形成普鲁士蓝沉淀而除去。2、杂蛋白质的除去：沉淀、吸附法、变性法、凝聚Coagulation和絮凝flocculation 3.有色物质的去除及其他：使用吸附剂去除有色物质（离子交换剂、离子交换纤维、活性炭等）、用工业酶制剂可净化发酵产物，除去干扰性浑浊物、使用惰性助滤剂、加入反应剂
SDS-PAGE蛋白凝胶电泳ppt课件
EDTA
DTT -巯基 乙醇
1mM 1mM
BCA
5%
10mM
Bradf 0.1% ord
0.1%
0.06%
5mM 1M
选择蛋白质定量方法时应考虑
• 实验对测定所要求的灵敏度和精确度；
• 蛋白质的性质；
• 溶液中存在的干扰物质；
• 测定所花费的时间等。
哺乳类细胞的裂解液-RIPA
• 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), • 150 mM NaCl, • 1% NP-40（乙基苯基聚乙二醇，常用非离 子性去垢剂 ）, • 0.1% SDS
蛋白酶抑制剂
抑制剂 靶蛋白酶
PMSF 苯甲基磺酰氟
EDTA
丝氨酸蛋白酶
金属蛋白酶
Leupeptin 亮肽素
*Acr有神经毒 性
上胶(浓缩胶)5% 3.4ml 0.83ml (1M Tris-Cl pH6.8) 0.68ml 100ml 10ml
TOTAL
10ml
5ml
制备分离胶(下胶)
出现明显界面时， 分离胶凝聚完成 （ 10~20min）
倒出水或正丁醇， 并用加样枪/滤纸 吸干
封水或饱和 正丁醇溶液
3 “拖尾”现象 样品溶解不佳引起或分离胶浓度过大
解决办法： 加样前离心 选择合适的样品缓冲液和凝胶缓冲液 加增溶试剂 降低凝胶浓度