生物分离工程：电泳.ppt
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生物分离工程第八章电泳技术ppt课件
– SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试 剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠 ，破坏蛋白质分子的二级、三级结构；而强还原剂 ，如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇能使半胱氨酸残基之 间的二硫键断裂。
– 因此，在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白 质分子被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基 酸侧链与SDS结合后，形成带负电的蛋白质-SDS胶 束，所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量，消 除了不同分子间的电荷差异；同时，蛋白质-SDS聚 合体的形状也基本相同，这就消除了在电泳过程中 分子形状对迁移率的影响。
电泳的简单原理
蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中 ，它们的净电荷取决于介质的H+浓度或与其它 大分子的相互作用。
带电粒子在电场中的迁移方式主要依据分子尺 寸大小和形状、分子所带电荷或分子的生物学 与化学特性。
电泳迁移率
电泳迁移率（mobility）:在电位梯度E的影响下 ，带电颗粒在时间t中的迁移距离d。
工作原理
蛋白质的等电点 蛋白质最主要的特性是它的带电行为，它们在不 同的pH环境中带不同数量的正电或负电，只是 在某一pH时，蛋白质的净电荷为0，此pH即为该 蛋白的等电点（isoelectric point pI）。
蛋白质的等电点取决于它的氨基酸组成和构象， 是一个物理化学常数。
可以利用等电点差异来进行蛋白质的分离、分析
其中区带电泳是目前常用的电泳系统。
区带电泳的主要技术
区带电泳中的常用技术
– 载体电泳：粉末电泳、纸电泳、凝胶电泳、 聚焦电泳
– 无载体电泳：自由电泳、毛细管电泳
凝胶电泳
作为电泳支持介质必须具有：化学惰性、不干扰大分 子的电泳过程，化学稳定性好、均匀、重复性好、电 内渗小等特性。
– 因此，在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白 质分子被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基 酸侧链与SDS结合后，形成带负电的蛋白质-SDS胶 束，所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量，消 除了不同分子间的电荷差异；同时，蛋白质-SDS聚 合体的形状也基本相同，这就消除了在电泳过程中 分子形状对迁移率的影响。
电泳的简单原理
蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中 ，它们的净电荷取决于介质的H+浓度或与其它 大分子的相互作用。
带电粒子在电场中的迁移方式主要依据分子尺 寸大小和形状、分子所带电荷或分子的生物学 与化学特性。
电泳迁移率
电泳迁移率（mobility）:在电位梯度E的影响下 ，带电颗粒在时间t中的迁移距离d。
工作原理
蛋白质的等电点 蛋白质最主要的特性是它的带电行为，它们在不 同的pH环境中带不同数量的正电或负电，只是 在某一pH时，蛋白质的净电荷为0，此pH即为该 蛋白的等电点（isoelectric point pI）。
蛋白质的等电点取决于它的氨基酸组成和构象， 是一个物理化学常数。
可以利用等电点差异来进行蛋白质的分离、分析
其中区带电泳是目前常用的电泳系统。
区带电泳的主要技术
区带电泳中的常用技术
– 载体电泳：粉末电泳、纸电泳、凝胶电泳、 聚焦电泳
– 无载体电泳：自由电泳、毛细管电泳
凝胶电泳
作为电泳支持介质必须具有：化学惰性、不干扰大分 子的电泳过程，化学稳定性好、均匀、重复性好、电 内渗小等特性。
电泳技术参考课件_PPT幻灯片
1983年，Schwartz等人根据DNA分子弹性弛豫时间(外推为零的滞 留时间)与DNA分子大小有关的特性，设计了脉冲电场梯度凝胶，交替 采用两个垂直方向的不均匀电场，使DNA分子在凝胶中不断改变方向， 从而使DNA按分子大小分开。后来，Carle等改进了电泳技术，并发现 周期性的反转换电场(periodic inversion of the electric field) 亦能使大分子DNA通过电泳分开。电泳系统是由一个水平式电泳槽和两 组独立，彼此垂直的电极组成，一组电极负极为N，正极为S；另一组 负极为W，正极为E 。
目前多用琼脂糖为电泳支持物 (1)琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可
(2)琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大(约占98-99%)，近似自由电泳， 样品扩散度较自由电泳 小，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨
(3)琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯监测
(4)电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长
由于醋酸纤维素薄膜电泳操作简单、快速、价廉。目前已广泛用于分析 检测血浆蛋白、脂蛋 白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、酶、多肽、核酸及其 他生物大分子。
第三节 琼脂糖凝胶电泳
天然琼脂(agar)是一种多聚糖，主要由琼脂糖 (agarose,约占80%)及琼脂胶(agaropectin)组成。 琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不 带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和 羧基的强酸性 多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产 生较强的电渗现象，加之硫 酸根可与某些蛋白质作 用而影响电泳速度及分离效果。
的泳动度。
泳动度与带电颗粒所带净电荷的数量，颗粒大小和形状有关。一般说，
净电荷数量愈多，颗粒愈小，愈接近球形，泳动度愈大。被分离的球形分子
目前多用琼脂糖为电泳支持物 (1)琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可
(2)琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大(约占98-99%)，近似自由电泳， 样品扩散度较自由电泳 小，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨
(3)琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯监测
(4)电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长
由于醋酸纤维素薄膜电泳操作简单、快速、价廉。目前已广泛用于分析 检测血浆蛋白、脂蛋 白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、酶、多肽、核酸及其 他生物大分子。
第三节 琼脂糖凝胶电泳
天然琼脂(agar)是一种多聚糖，主要由琼脂糖 (agarose,约占80%)及琼脂胶(agaropectin)组成。 琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不 带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和 羧基的强酸性 多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产 生较强的电渗现象，加之硫 酸根可与某些蛋白质作 用而影响电泳速度及分离效果。
的泳动度。
泳动度与带电颗粒所带净电荷的数量，颗粒大小和形状有关。一般说，
净电荷数量愈多，颗粒愈小，愈接近球形，泳动度愈大。被分离的球形分子
生物化学《电泳+离心》课件
一般低速离心，转速以r/min(revolution per minute, rpm) 表示；高速或超速离心 ，转速以相对离心力表示，真正反映颗粒 在离心管中所受到的离心力。
相对离心力（relative centrifugal force， RCF，FR ）是指在离心力场的作用下，颗 粒所受离心力相当于地球重力的倍数，单位 是重力加速度g（9.8m/s2）。
FR=1.119 ×10-5×R×（RPM）2
四、离心机的分类
按转速（每分钟转数，revolution perminute，rpm ）不同可将离心机分为三类：
①普通离心机：转速一般不超过10，000rpm，用于 收集易沉淀的大颗粒；
②高速离心机：转速一般不超过30,000rpm，用于 分离各种沉淀物、细胞碎片及较大的细胞器等；
PH稳定性降低。
电场强度(electric field intensity)
电场强度与电泳速率成正比 增大电场强度会引起通过介质的电流增加，从
而导致电泳过程中的热量增大，对电泳分离造 成多种影响。 冷却装置：高压电泳（500~1000V或是更高）
电渗现象（electroosmosis）
离心机 Eppendorf管放置、重量的平衡
2.注意事项
①工作转速在允许范围内。 ②严格平衡，每只离心管内的溶液量应相同，
对称放置。 ③加盖，防止离心管飞出伤人。 ④发现异常立即关机。 ⑤离心管盛液不宜过满，避免腐蚀性液体溅出
腐蚀离心机，同时造成离心不平衡。
电泳技术
electrophoresis
定义：带有电荷的微粒在电场中的移动，这种现象称 为电泳(electrophoresis)。
许多生物分子如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸等在 溶液中均带有一定的电荷，因此，电泳技术广泛应用 于这些物质的分离与鉴定。
相对离心力（relative centrifugal force， RCF，FR ）是指在离心力场的作用下，颗 粒所受离心力相当于地球重力的倍数，单位 是重力加速度g（9.8m/s2）。
FR=1.119 ×10-5×R×（RPM）2
四、离心机的分类
按转速（每分钟转数，revolution perminute，rpm ）不同可将离心机分为三类：
①普通离心机：转速一般不超过10，000rpm，用于 收集易沉淀的大颗粒；
②高速离心机：转速一般不超过30,000rpm，用于 分离各种沉淀物、细胞碎片及较大的细胞器等；
PH稳定性降低。
电场强度(electric field intensity)
电场强度与电泳速率成正比 增大电场强度会引起通过介质的电流增加，从
而导致电泳过程中的热量增大，对电泳分离造 成多种影响。 冷却装置：高压电泳（500~1000V或是更高）
电渗现象（electroosmosis）
离心机 Eppendorf管放置、重量的平衡
2.注意事项
①工作转速在允许范围内。 ②严格平衡，每只离心管内的溶液量应相同，
对称放置。 ③加盖，防止离心管飞出伤人。 ④发现异常立即关机。 ⑤离心管盛液不宜过满，避免腐蚀性液体溅出
腐蚀离心机，同时造成离心不平衡。
电泳技术
electrophoresis
定义：带有电荷的微粒在电场中的移动，这种现象称 为电泳(electrophoresis)。
许多生物分子如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸等在 溶液中均带有一定的电荷，因此，电泳技术广泛应用 于这些物质的分离与鉴定。
生物分离工程 电泳65页PPT
财富 ❖ 丰富你的人生
71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
生物分离工程 电泳
51、没有哪个社会可以制订一部永远 适用的 宪法， 甚至一 条永远 适用的 法律。 ——杰 斐逊 52、法律源于人的自卫本能。——英 格索尔
53、人们通常会发现，法律就是这样 一种的 网，触 犯法律 的人， 小的可 以穿网 而过， 大的可 以破网 而出， 只有中 等的才 会坠入 网中。 ——申 斯通 54、法律就是法律它是一座雄伟的大 夏，庇 护着我 们大家 ；它的 每一块 砖石都 垒在另 一块砖 石上。 ——高 尔斯华 绥 55、今天的法律未必明天仍是法律。 ——罗·伯顿
71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
生物分离工程 电泳
51、没有哪个社会可以制订一部永远 适用的 宪法， 甚至一 条永远 适用的 法律。 ——杰 斐逊 52、法律源于人的自卫本能。——英 格索尔
53、人们通常会发现，法律就是这样 一种的 网，触 犯法律 的人， 小的可 以穿网 而过， 大的可 以破网 而出， 只有中 等的才 会坠入 网中。 ——申 斯通 54、法律就是法律它是一座雄伟的大 夏，庇 护着我 们大家 ；它的 每一块 砖石都 垒在另 一块砖 石上。 ——高 尔斯华 绥 55、今天的法律未必明天仍是法律。 ——罗·伯顿
生物化学技术__电泳_PPT教案
固定和谱带检测
固定：7%乙酸或12.5%三氯乙酸 谱带检测
染色法 荧光探针法 特殊试剂染色法
根据支持介质形状不同，可分为： •薄层电泳 •板电泳 •柱电泳
• 据用途不同，可分为： •分析电泳 •制备电泳 •定量电泳 •免疫电泳
第一节 电泳的基本原理
▪ 电泳是在电场作用下产生的物质运动。
在一定的电场强度下，带电颗粒(分子)在电 场中的迁移方式主要依据分子大小和形状、分 子所带电荷或分子的生物学与化学特性。
核黄素经光照后再被痕量氧氧产生自由基， 引发聚合反应。
丙烯酰胺聚合时常用的催化系统
引发剂
过硫酸铵 （AP）
加速剂 N,N,N′,N′-四甲基乙二胺 （TEMED）
3-二甲胺丙腈
3-二甲胺丙腈亚硫酸盐
应用范围 AP
酸性系统
核黄素
TEMED
碱性系统 （光聚合）
化学聚合与光聚合的比较
加样需注意
制备样品时，离子浓度不宜太高 蔗糖浓度小于20% 样品液中的沉淀和混浊需除去 阴离子系统用溴酚蓝作指示剂，负极在上；
阳离子系统用甲基绿或次甲基绿作指示剂， 正级在上。
一般操作
步骤：
摆好玻璃管 制备分离胶 预电泳：除去AP、未聚合丙烯酰胺、杂质 制备浓缩胶 加样 电泳：先低电流，样品进胶后，调至所需电流 取胶 固定和谱带检测 迁移率测定 谱带保存
微量TEMED的加入，可使过硫酸铵形成自由基，这些 自由基的产生可引发丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的聚合、 交联反应，形成有一定平均孔径的聚丙烯酰胺凝胶。
化学催化——酸性系统
引发剂：过硫酸铵(AP) 过氧化氢
加速剂：硫酸亚铁-抗坏血酸（Vc)
光聚合催化系统
引发剂：核黄素 加速剂：TEMED可以加速聚合
生物分离工程电泳
影响泳动速度的因素-4
• 溶液的离子强度
I = (∑cizi2 )/2 — 保持足够缓冲能力前提下，离子强度要最 小
— 溶液的离子强度越高，带电颗粒泳动速度 越
慢，反之越快
— 最适离子强度0.02 – 0.2
12
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影响泳动速度的因素-5
• 电渗作用
在电场中液体对固体支持物的相对移动
恒定泳动速度:
v = EZe/(6пrη)
6
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区 带 电 泳
7
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影响泳动速度的因素
外加电流电压
Voltage
+
-
+
-
Friction
Charge
分子量分子形状
分子的等电点
8
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影响泳动速度的因素-1
• 带电颗粒的性质
所带净电荷的数量 颗粒大小 形状
恒定泳动速度: v=EZe/(6пrη)
浓缩层胶体中的三个主要作用角色
Glycine: Negative charged
No net charge
Chloride ion:
Proteins:
小分子
第二十二页，共30页
大分子
22
SDS Gel Elecrtophoresis
23
第二十三页，共30页
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子量
• PAGE凝胶电泳分离、检测蛋白质 根据蛋白质分子大小、形状及净电荷
Mol mass
kD
300
200
100 80
60 50
40 30 20
10
kD
kD
330
15 .电泳
•分子筛效应
水平板式电泳槽
垂直板式电泳槽
操作步骤： 1.制备PAGE胶柱
•灌分离胶，封水 •灌浓缩胶，封水
2.上样，电泳 3. 染色，观察结果
2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)
原理：SDS为阴离子去垢剂，与蛋白质分子结合，使 蛋白质分子所带电荷相同，并使蛋白质结构变得松 散，形状趋于一致。蛋白质的迁移率与分子大小有 关。
①纸电泳：指用滤纸作为支持介质的电泳方法。是最 早使用的区带电泳。
②醋酸纤维素薄膜电泳：
分离速度快、电泳时间短、样品用量少，比纸电泳分辨率高。 适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。
以上二种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没
有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行 分离。
淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析，天然淀粉经加工处
SDS-PAGE的应用
测定未知蛋白质分子量 以不同分子量的标准蛋白进行SDS-PAGE电泳得到 不同标准蛋白的电泳迁移率，制作标准校正曲线， 然后对未知蛋白在相同条件下进行SDS-PAGE电泳， 测定迁移率，从标准曲线得到相应的分子量；
在一定的凝胶浓度下，
标准蛋白分子量
多肽链分子量的对数与
多肽链的相对迁移率成 线性关系，所以可以通
琼脂糖凝胶：
从琼脂中精制分离出的胶状多糖，对于分子量较大的样 品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂 糖凝胶进行电泳分离。 琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比 聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。
三、常用电泳技术介绍
1.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
原理：
（1）工作原理
蛋白质的等电点 利用蛋白质和氨基酸等两性电解质具有等电点， 在等电点（PI）的pH下呈电中性，不发生泳动的 特点进行电泳分离。 蛋白质的等电点取决于它的氨基酸组成和构象， 可以利用等电点差异来进行蛋白质的分离、分析。
电泳分离PPT课件
胎盘球蛋白，优点是简便迅速，便于保存照相， 比纸电泳分辨率高。
❖以上两种类型的电泳，由于介质的孔径 度大，没有分子筛效应，主要靠被分离 物的电荷多少进行分离。
4
第54页/共48页
③琼脂糖凝胶电泳：从琼脂中精制分离出的胶状多
糖，一般用于核酸的分离分析。
（1）琼脂糖凝胶孔径较小，具有分子筛效应； （2）机械强度高：可以在浓度1%以下使用； （3）无毒； （4）染色、脱色程序简单，背景色较低； （5）热可逆性； （6）生物中性：一般不与生物材料结合。
四、等电聚焦 ( isoelectric focusing，IEF )
利用蛋白质具有不同等电点的特性，以 聚丙烯酰胺为电泳支持物，在其中加入载体 两性电解质（商品名：Ampholine，一种含有 各种连续 pI 的小分子混合物）的电泳方法称 聚丙烯酰胺等电聚焦电泳（IEF-PAGE）。
32
第332页/共48页
2）光催化系统：核黄素－光
催化剂: 核黄素（维生素B2）
引发剂: 光
.
TEMED的存在，可加速聚合。
15
第165页/共48页
聚丙烯酰胺凝胶： 丙烯酰胺＋N,N’－甲叉双丙烯酰胺聚合而成
16
第176页/共48页
凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系
凝胶的机械强度、弹性和透明度、粘着 度取决于凝胶总浓度（T）和交联度（C）。
因此，蛋白质—SDS复合物(SDS-denatured protein) 在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只 与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。
24
第254页/共48页
两者关系：蛋白质的迁移率与分子量的对
数呈线性关系，符合下式：logMW=C-bm MW：分子量；m：迁移率；C、b均为常数
❖以上两种类型的电泳，由于介质的孔径 度大，没有分子筛效应，主要靠被分离 物的电荷多少进行分离。
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③琼脂糖凝胶电泳：从琼脂中精制分离出的胶状多
糖，一般用于核酸的分离分析。
（1）琼脂糖凝胶孔径较小，具有分子筛效应； （2）机械强度高：可以在浓度1%以下使用； （3）无毒； （4）染色、脱色程序简单，背景色较低； （5）热可逆性； （6）生物中性：一般不与生物材料结合。
四、等电聚焦 ( isoelectric focusing，IEF )
利用蛋白质具有不同等电点的特性，以 聚丙烯酰胺为电泳支持物，在其中加入载体 两性电解质（商品名：Ampholine，一种含有 各种连续 pI 的小分子混合物）的电泳方法称 聚丙烯酰胺等电聚焦电泳（IEF-PAGE）。
32
第332页/共48页
2）光催化系统：核黄素－光
催化剂: 核黄素（维生素B2）
引发剂: 光
.
TEMED的存在，可加速聚合。
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聚丙烯酰胺凝胶： 丙烯酰胺＋N,N’－甲叉双丙烯酰胺聚合而成
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凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系
凝胶的机械强度、弹性和透明度、粘着 度取决于凝胶总浓度（T）和交联度（C）。
因此，蛋白质—SDS复合物(SDS-denatured protein) 在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只 与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。
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两者关系：蛋白质的迁移率与分子量的对
数呈线性关系，符合下式：logMW=C-bm MW：分子量；m：迁移率；C、b均为常数