8高效毛细管电泳仪

即电泳迁移率
毛细管壁(以熔融石英毛细管柱为例 ： 毛细管壁 以熔融石英毛细管柱为例)： 以熔融石英毛细管柱为例
pH>3时， SiOH+H2O SiO-+H3O+
紧密层
Zeta电势ξ Zeta电势ξw 电势
剪切面
扩散层 δ
♥ 电场作用下，毛细管柱中出现：电泳现象和电渗 电场作用下，毛细管柱中出现：
高效毛细管电泳仪
（high performance capillary electrophoresis, HPCE） ）
主要内容
电泳的基本原理 电泳的影响因素 毛细管电泳的基本结构 毛细管电泳的分离模式 毛细管电泳的临床应用
一、电泳的定义
电泳（ 电泳 （ electrophoresis， EP） 是指带电荷 ， ） 的溶质或粒子在电场中向着与其本身所带电 荷相反的电极移动的现象。 荷相反的电极移动的现象。 利用电泳现象将多组分物质分离、 利用电泳现象将多组分物质分离 、 分析的技 术 叫 做 电 泳 技 术 （ electrophoresis technique） ）
三、电泳原理
物质分子在正常情况下一般不带电， 物质分子在正常情况下一般不带电 ， 即所带 正负电荷量相等故不显示带电性。但是在一 定的物理作用或化学反应条件下，某些物质 分子会成为带电的离子（或粒子），不同的 物质，由于其带电性质、颗粒形状和大小不 同，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速 度也不同，因此可使它们分离。 度也不同，因此可使它们分离。
由上式可以看出,粒子的移动速度 泳动速度 由上式可以看出 粒子的移动速度(泳动速度 与电 粒子的移动速度 泳动速度V)与电 场强度(E)和粒子所带电荷量 成正比,而与粒子的半 和粒子所带电荷量(Q)成正比 场强度 和粒子所带电荷量 成正比 而与粒子的半 及溶液的粘度(η)成反比 径(r)及溶液的粘度 成反比。 及溶液的粘度 成反比。
流现象。 流现象 电渗流（electroosmotic flow,EOF)：在毛细管 电渗流（ ： 中，溶液中的正电荷与毛细管壁表面的负电荷之 间的作用形成双电层 双电层， 间的作用形成双电层，引起流体朝一个方向移动 的现象. 的现象
+ EOF
-
电渗流的速度、 电渗流的速度、方向 电渗流淌度： A. 电渗流淌度： 电渗的大小受到电势和介质粘度的影响 受到电势和介质粘度的影响， 电渗的大小受到电势和介质粘度的影响，一般 说来，电势越大，粘度越小，电渗流值越大． 说来，电势越大，粘度越小，电渗流值越大．在不 少情况下，电渗流的速度是泳流速度的5一 倍 少情况下，电渗流的速度是泳流速度的 一7倍。 B.电渗流方向 电渗流方向： B.电渗流方向： 在通常的熔融石英毛细管区带电泳中， 在通常的熔融石英毛细管区带电泳中，电渗流 正极流向负极. 由正极流向负极.
等速电泳(isotachophoresis,ITP) 等速电泳
是一种分离组分与电解质一起向前移动， 是一种分离组分与电解质一起向前移动，同时进行分离的电泳方法 常用于分离小离子、小分子、 常用于分离小离子、小分子、肽类及蛋白质
等速电泳
采用两种不同浓度的电解质组成， 采用两种不同浓度的电解质组成，一种前导 电解质迁移率高于任何样品组分， 电解质迁移率高于任何样品组分，充满整个 毛细管柱； 毛细管柱；另一种尾随电解质迁移率低于任 何样品组分， 何样品组分，置于一端的电泳槽中 被分离组分按其不同的迁移率夹在中间， 被分离组分按其不同的迁移率夹在中间，在 强电场的作用下， 强电场的作用下，各被分离组分在前导电解 质与尾随电解质之间的空隙中移动， 质与尾随电解质之间的空隙中移动，实现分 离 等速电泳在毛细管中的电渗流为零
等电聚焦电泳
蛋白质分子在不同pH下的解离状态 蛋白质分子在不同 下的解离状态
NH3+ Hale Waihona Puke Baidu COOH
OHH+
NH3+ P COO-
OHH+
NH2 P COO-
pH＜pI ＜
pH＝pI ＝
pH＞ pI ＞
等电聚焦电泳
等电聚焦电泳具有很高的分辨率， 等电聚焦电泳具有很高的分辨率，在等电点 上只有有0.01pH单位的差异就能准确地分离 上只有有 单位的差异就能准确地分离 特别适合分离分子量相近而等电点不同的蛋 白质组分 特点： 特点：
电泳原理
若将带净电荷Q的粒子放入电场， 若将带净电荷 的粒子放入电场，则该粒子所受 的粒子放入电场 到的电荷引力为： 到的电荷引力为： F引=E Q F阻=6πrηV 当F引=F阻时 EQ= 6πrηV （6-3） ） V = EQ/6πrη （6-1） ） （6-2） ） 在溶液中,运动粒子与溶液之间存在阻力 在溶液中 运动粒子与溶液之间存在阻力F阻 运动粒子与溶液之间存在阻力
四、影响电泳的因素
电场强度：电场强度越大， 电场强度：电场强度越大，带电粒子泳动越快 溶液的pH值 值离等电点愈远， 溶液的 值：pH值离等电点愈远，粒子所带静电荷 值离等电点愈远 越多，电泳速度愈快。 越多，电泳速度愈快。 等电点（ 等电点（isoelectric point, pI): 当溶液的酸碱度处 于某一特定pH值时 它将带有相同数量的正负电荷， 值时， 于某一特定pH值时，它将带有相同数量的正负电荷， 致使蛋白质分子在电场中不会移动，此特定的pH值 致使蛋白质分子在电场中不会移动，此特定的 值 被称为~。 被称为 。 溶液离子强度：强度愈高，电泳速度愈慢。 溶液离子强度：强度愈高，电泳速度愈慢。适宜强 度0.02~0.20mol/kg.
散热快 可以用很 分析速度加快 分离效能提高
熔融石英毛细管
毛细管外径 毛细管内径
1.毛细管电泳的工作原理 毛细管电泳的工作原理
毛细管电泳是在一根内径为25-75µm，长几 ， 毛细管电泳是在一根内径为 十厘米熔融石英玻璃毛细管 进行的电泳。 毛细管内 十厘米熔融石英玻璃毛细管内进行的电泳。 是在外加电场的作用下， 是在外加电场的作用下，在毛细管中按荷电 粒子淌度或分配系数的差异 淌度或分配系数的差异而进行分离的新 粒子淌度或分配系数的差异而进行分离的新 技术。 技术。
毛细管电泳技术
传统电泳存在的缺陷？ 传统电泳存在的缺陷？ 不能克服因高电压引起的焦耳热 焦耳热！ 不能克服因高电压引起的焦耳热！ 引发的问题： 引发的问题： 分离效能低 分析时间长
在高压电场下， 在高压电场下，电解质会产 生自热现象， 生自热现象，该热量称为焦 耳热
毛细管的特点： 毛细管的特点： 比表面积大 高的电压
二、电泳发展简史
1、1937年 瑞典科学家 A. 、 年 Tiselius首先提出的，后 首先提出的， 首先提出的 来．A. Tiselius又和他的同 又和他的同 事们一起第一次从人的血清 中分离出白蛋白、 球蛋白、 中分离出白蛋白、α球蛋白、 球蛋白、 球蛋白， β球蛋白、γ球蛋白，由于 A. Tiselius对电泳技木发展 对电泳技木发展 和应用的杰出贡献， 和应用的杰出贡献，使他成 为1948年诺贝尔化学奖的得 年诺贝尔化学奖的得 主．
t∆U dB = uB L 两物质移动的距离差为： 两物质移动的距离差为： d = (d − d ) = (u − u ) t∆U ∆ A B A B
L
u=
v d /t dL = = E ∆U / L t ∆U
t∆U d A = uA L
由此可知，物质 和 能否分离 能否分离， 由此可知，物质A和B能否分离，决定于两者的迁移 率。
四、影响电泳的因素
电渗：液体相对于固体支持物的移动。 电渗：液体相对于固体支持物的移动。泳动方向 与电渗方向一致时，则加快泳动速度； 与电渗方向一致时，则加快泳动速度；当颗粒的 泳动方向与电渗方向相反时， 泳动方向与电渗方向相反时，则降低颗粒的泳动 速度。 速度。 温度：温度每升高1 迁移率增加 迁移率增加2.4% 温度：温度每升高 0c,迁移率增加 迁移率： 迁移率：
v = d /t
电场强度E为单位距离内的电位差（ ），设L为两 ），设 为两 电场强度 为单位距离内的电位差（∆U 为单位距离内的电位差 极间的距离， 极间的距离，即
E=∆ U / L
合并上面两式： 合并上面两式： 设有A和 两种带电粒子 两种带电粒子， 设有 和B两种带电粒子，它们能否在电场中电泳分 可由它们的移动距离的差值来判断， 离，可由它们的移动距离的差值来判断，设A和B的 和 的 电泳移动距离分别为 dA和 dB，
毛细管电泳中， 毛细管电泳中，离子迁移的顺序
V总= V + VEOF
都是从负极流出
正离子：电泳方向与电渗流方相同，最先流出； 正离子：电泳方向与电渗流方相同，最先流出； 中性粒子：电泳速度为零，随电渗流流出。 中性粒子：电泳速度为零，随电渗流流出。 负离子：电泳方向 负离子： 与电渗流方向相反； 与电渗流方向相反 N NN + N V>VEOF，无法流出 EOF， N EOF N V<VEOF，在中性粒子后流出 EOF， N
等电聚焦电泳（ 等电聚焦电泳（isoelectric focusing ,IEF) 等电聚焦就是在电泳介质中放入载体两性电 等电聚焦就是在电泳介质中放入载体两性电 解质，当通以直流电时，两性电解质即形成 当通以直流电时， 一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度， pH梯度 一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，在此 体系中， 体系中，不同的蛋白质即移动到或聚焦于其 相当的等电点位置上， 相当的等电点位置上，也就是说被聚焦于一 个狭的区带中， 个狭的区带中，电泳技术中的等电点聚焦也 称为聚焦电泳。 称为聚焦电泳。 两性电解质：就是在不同PH环境下 环境下,电解质 两性电解质：就是在不同 环境下 电解质 可酸性电离,也可碱性电离 如磷酸(二 氢钠 也可碱性电离,如磷酸 可酸性电离 也可碱性电离 如磷酸 二)氢钠
五、常用的电泳方法
纸电泳： 纸电泳：用滤纸作为支持载体的电泳方法 醋酸纤维素薄膜电泳： 醋酸纤维素薄膜电泳：纤维素的羟基乙酰化 形成的纤维素醋酸酯制成的薄膜作支持载体 凝胶电泳：琼脂糖、 凝胶电泳：琼脂糖、聚丙烯酰胺
06-02 平卧式电泳槽装置示意图
06-03
血清蛋白的电泳图谱
平板电泳槽
垂板电泳槽
电泳原理
电泳迁移率（ ），表 电泳迁移率（Electrophoreticmobility, µ），表 ）， 示单位电场下带电粒子的运动速度。 示单位电场下带电粒子的运动速度。 μe=v/E μe=q/6πηr
对于一定的荷电粒子或离子，电泳迁移率是该粒子的特征 对于一定的荷电粒子或离子， 常数。颗粒带净电荷量越大或其直径越小， 常数。颗粒带净电荷量越大或其直径越小，其形状越接近 球形，在电场中泳动的越快；反之，则越慢。 球形，在电场中泳动的越快；反之，则越慢。 为粒子电泳移动距离， 为电泳时间， 设d为粒子电泳移动距离，t为电泳时间，则 为粒子电泳移动距离 为电泳时间
等电聚焦电泳（ 等电聚焦电泳（isoelectric focusing ,IEF) 利用具有pH梯度的支持介质分离 利用具有 梯度的支持介质分离等点电不同 梯度的支持介质分离等点电不同 的蛋白质的电泳技术。 的蛋白质的电泳技术。 各种蛋白质各自都有一个等电点,在一特殊的 各种蛋白质各自都有一个等电点 在一特殊的 pH环境中 蛋白质分子呈电中性 在电场中不 环境中,蛋白质分子呈电中性 环境中 蛋白质分子呈电中性,在电场中不 会迁移。 会迁移。
2、 1948年 Wieland和 Fischer重新发展了以 、 年 和 重新发展了以 滤纸作为支持介质的电泳方法， 滤纸作为支持介质的电泳方法 ， 对氨基酸的 分离进行过研究。 分离进行过研究。 3、1959年Raymond 和Weintraub 利用人工 、 年 合成的凝胶作为支持介质， 创建了聚丙烯酰 合成的凝胶作为支持介质 ， 胺凝胶电泳， 胺凝胶电泳 ， 极大地提高了电泳技术的分辨 开创了近代电泳的新时代。 率，开创了近代电泳的新时代。 4、1967年 Hjerten最先提出在高电场强度， 最先提出在高电场强度， 、 年 最先提出在高电场强度 直径为3mm的毛细管中作自由溶液的区带电 直径为 的毛细管中作自由溶液的区带电 泳(CZE,capillary zone electrophoresis)。 。