光学显微镜

光沿哪个方向，传播速度都是相同的，媒质只有一
个折射率，这样的媒质称为光学各向同性媒质。 同时还存在另一类媒质，主要是透明晶体物质，如 方解石(化学成分是CaCO3)、石英、云母、硫磺等， 光在其中传播时，沿着不同方向有不同的传播速率，
这样的媒质称为光学各向异性媒质。
光在晶体中的双折射现象就是光学各向异性的表现。
1.8 荧光显微镜
激发滤板 根据光源和荧光色素的特点，可选用以下三类激 发滤板，提供一定波长范围的激发光。 紫外光激发滤板：可使400nm以下的紫外光透过， 阻挡400nm以上的可见光通过。常用型号为UG-1 或UG-5，外加一块BG-38，以除去红色尾波。 紫外蓝光激发滤板：可使300～450nm范围内的光 通过。常用型号为ZB-2或ZB-3，外加BG-38。 紫蓝光激发滤板：可使350～490nm的光通过。常 用型号为QB24（BG12）。
1.7 偏光显微镜
1.7.1 偏光显微镜的特点
将普通光改变为偏振光进行镜检的方法，以 鉴别某一物质是单折射（各向同性）或双折射性 （各向异性）。双折射性是晶体的基本特性。因 此，偏光显微镜被广泛地应用在矿物、化学等领 域，在生物学和植物学也有应用。
★晶体的双折射
有些透明媒质，如玻璃、水、肥皂液等，不论
1.8 荧光显微镜
1.8 荧光显微镜
荧光显微镜是免疫荧光细胞化学的基本工具。广泛 应用于生物、医学等技术领域。
1.8.1荧光显微镜成像原理
基本原理是利用一定波长的激发光对样品进行激发，使之 产生一定波长的荧光，从而用于对样品结构或其组分进行 定性、定位、定量观察检测。
1.8 荧光显微镜
1.8.2 荧光显微镜基本构造
紫外紫光压制滤板：能通过460nm以上波长的荧 光（蓝到红）。
1.8 荧光显微镜
1.8.3荧光显微镜按光路的分类
(1) 透射式荧光显微镜 激发光源是通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光的。 常用暗视野集光器，也可用普通集光器，调节反光镜使激 发光转射和旁射到标本上．是比较旧式的荧光显微镜。
优点—低倍镜时荧光强；
1.8 荧光显微镜
注意： 激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减 和淬灭现象，因此尽可能缩短观察时间，暂时 不观察时，应用挡板遮盖激发光； 末装滤光片不要用眼直接观察，以免引起 眼的损伤； 高压汞灯关闭后不能立即重新打开，需经 5分钟后才能再启动，否则会不稳定，影响汞 灯寿命。
1.8 荧光显微镜
荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、 核蓝色）
偏光显微镜结构示意图
起偏镜:一般安装在可以转动的圆框内，借助手柄转动 调节;作用是把来自光源的自然光变成偏振光; 检偏镜:作用是分辨被偏振光照射于金属磨面后出射 光的偏振状态.
1.7 偏光显微镜
1.7.3 偏光装置的调整
(1)起偏镜位置的调整 调节的目的—使入射光的偏振面呈水平位置，以保证从垂 直照明器平面玻璃反射进入物镜的偏振光强度最大，且仍 为直线偏振光。
1.7 偏光显微镜
1.7.4 偏光显微镜的应用
A、组织与晶粒的显示 各向异性金属的多晶体，其晶粒在正交偏振光下可看到不 同亮度。亮度不同，表明晶粒位相不同，而具有相同亮度的两 个晶粒，有相同的位相。 例如：球墨铸铁的组织中的石墨属于六方点阵，是各向异性的物质，在
同一石墨球中具有许多不同位向的石墨晶粒，这些石墨晶粒在偏振光下可 显示不同的亮度，从而分辨出石墨晶粒的方位、球状和大小。
（３）用低倍镜观察，根据不同型号荧光显微镜
的调节装置，调整光源中心，使其位于整个照明
光斑的中央；
1.8 荧光显微镜
（４）放置标本片，调焦后即可观察； （５）观察：标本内的荧光染色会较快的衰减， 所以要避免长时间的在荧光下观察。 （6）荧光亮度的判断标准：一般分为四级，即 “一”—无或可见微弱荧光。“+”—仅能见明确 可见的荧光。“++”—可见有明亮的荧光。 “+++”—可见耀眼的荧光。
1.9 相衬金相及微差干涉衬度
相衬显微术：就是在显微镜中利用一种特殊
的光学装置来提高物相反差（衬度）的方法。在
生物学方面获得了更广泛的应用。对于不能有效 地腐蚀出显微组织的金相，就可以用相衬方法。
1.9 相衬金相及微差干涉衬度
例题： 1.过共析钢球化退火，渗碳体呈颗粒状分布在铁素体基 体上。因在常用的硝酸酒精溶液腐蚀下，铁素体的溶解 速度要比渗碳体快，因此，渗碳体颗粒凸起在铁素体基 体上。由于铁素体和渗碳体对于光的反射能力相近，则 采用相衬方法，渗碳体是明亮的，而铁素体基体是暗灰 色的。
1.9 相衬金相及微差干涉衬度
微差干涉衬度的应用： （1）利用不同相呈现不同色彩的特点，可以作为相 鉴别的佐证，特别适合于复杂的合金组织；
（2）提高衬度，能显示一般明场观察不到的某些组
织细节； （3）获得衬度良好的图像，适于做自动定量工作； （4）在晶体生长、矿物鉴别、高温显微技术方面具 有广泛的用途。
1.8 荧光显微镜
★换用不同的激发滤片／双
色束分离器／阻断滤片的组 合插块，可满足不同荧光反 应产物的需要。
★优点：视野照明均匀，成
像清晰，放大倍数愈大荧光 愈强。
1.8 荧光显微镜
1.8.4使用注意事项
（１）打开灯源，超高压汞灯要预热几分钟才能
达到最亮； （２）落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入 所要求的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的 插块；
1.7 偏光显微镜
双目偏光显微镜
三目偏光显微镜
三目数码偏光显微镜
1.7 偏光显微镜
定义:
物质发出的光波具有一切可能的震动方向,且各方 向振动矢量的大小相等,称为叫自然光。
偏振光:与自然光不同,当光矢量在一个固定的平面 内只沿一个固定方向作振动时,这种光称为偏振光.
自然光通过偏振棱镜或人造偏振片可获得偏振光. 利用偏光原理,可对某些物质具有的偏光性进行观察的 显微镜,就称为偏光显微镜.
1.9 相衬金相及微差干涉衬度
2.高速钢刀具热处理时，通常要检查其淬火组织，主要为了 测定奥氏体的实际晶粒度，以判断淬火加热温度是否合适； 其次还要看碳化物的熔解是否充分，这也是与淬火加热温度 直接有关的。在明视场条件下，残余奥氏体晶界比较清晰， 因此不难评定其晶粒度级别。但是，由于碳化物也是明亮的 颗粒，其中一些较大的一次碳化物，不容易和基体分开，因 此在判定碳化物的熔解是否充分时就有一定的困难。在相衬 照明条件下，碳化物颗粒凸起，因此是明亮的，而基体则是 灰暗的。其中奥氏体晶界仍部分隐约可见，碳化物与基体之 间具有良好的反差，因此很容易看出碳化物的数量及其分布 情况。
球墨铸铁的显微组织 （a）30°偏光照片 （b）明场照片
1.7 偏光显微镜
B、多相合金的相分析
两相合金中一相为各相同性，另一相为各相异性，极 易由偏振光鉴别。 两相都属于各相同性，经适当的化学浸蚀后，使一相 被浸蚀后具有光学各相异性，而另一相并不发生浸蚀作用。 例如：55SiMnMo钢，正火后组织为马氏体加贝氏体， 因马氏体较贝氏体难于被浸蚀，故经4%的硝酸酒精浸蚀后， 贝氏体形成倾斜的晶面，在正交偏振光下倾斜的晶面将引 起椭圆偏振，故可观察到明暗不同的贝氏体；因马氏体未 被浸蚀，它不能引起椭圆偏振，呈一片黑暗。
1.8 荧光显微镜
（3）阻断（压制）滤片
阻断滤片的作用： 一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免干扰荧光和损伤眼 睛; 二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。
1.8 荧光显微镜
压制滤板 与激发滤板相对应，常用以下3种压制滤板： 紫外光压制滤板：可通过可见光、阻挡紫外光 通过。
紫蓝光压制滤板：能通过510nm以上滤长的荧光 （绿到红）。
它是由普通光学显微镜加上 一些附件（荧光光源、激发滤片、 双色束分离器和阻断滤片等）组 成的。
（1）荧光光源
―般采用超高压汞灯(50一200W)， 它可发出 各种波长的光 ，
它是用石英玻璃制作，中间呈球形，内 充一定数量的汞，它发射很强的紫外和 蓝紫光，足以激发各类荧光物质，因此， 为荧光显微镜普遍采用。
尼康E800荧光DIC显微镜
1.8 荧光显微镜
（2）激发滤片
★激发滤片：一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片； 放置的原因：由于每种荧光物质都有一个产生最强荧光 的激发光波长，所以加用激发滤片仅使一定波长的激发 光透过照射到标本上，而将其它光都吸收掉。
★激发滤片分薄厚两种，一般暗视野选用薄滤片，亮视 野可选用厚一些。基本要求是以获得最明亮的荧光和最 好的背景为准。
★双折射现象 光线进入光学各向异性媒质(如方解石)后产生 两条折射光线的现象，称为双折射现象。
天然的方解石晶体 是双折射晶体 B
A
方解石
晶体中的双折射现象 e···e o· · ·
o
以入射线为轴转方解石，光点o不动，e 绕o转，用偏振 片检验，二者都是偏振光，且偏振方向互相垂直。
所以，利用双折射现象也可以获得线偏振光。
1.7 偏光显微镜
C、非金属夹杂物的鉴定 金属中长存在各种类型的非金属夹杂物，它们具有 各种光学特性，如反射能力、透明度、非均质性等。 利用偏振光可观察到这些夹杂物的特性，如鉴别钢中 非金属夹杂物。 例如：各向同性的球形透明夹杂物在正交偏振光下会呈现 “黑十字”现象。
钢中SiO2玻璃球夹杂物
（a）明场照明 （b）正交偏光照明
1.9 相衬金相及微差干涉衬度
微差干涉衬度 （简称DIC，differential interference
contrast）是近年来发展的有效方法之一。DIC
是将试样表面微小高度差所造成的光程差，利用
一套特殊的光学装置转变成为人眼及感光材料能
感受的强度差，从而提高组织细节之间的衬度， 使之易于识别。微差干涉可以观察到表面高度差 只有几个埃的纤维组织。目前多利用微差干涉衬 度观察不经腐蚀的相变组织、干涉层金相等。