细菌鉴定的定性与确证试验
临床常见细菌手工鉴定和结果判断
临床常见细菌的手工鉴定和结果判断一．细菌的鉴定步骤1、鉴定的概念：将一个未知的菌株按其生物学特性，经过与所有已知菌种进行比较后划归到一个已知菌种的分析过程。
2、对待鉴定的菌种要明确已经获得纯化培养或者该菌种在血平板上生长良好，有单个菌落可以进行生化试验。
（我们这里一般都是预先纯化培养）+––+b）G，G，c，对待鉴定的菌种进行革兰染色，3、观察形态（Gc，Gb做触酶，氧化酶实验，然后按科，属，种逐步鉴定。
要注意对待鉴定的菌种选择一个合适的鉴定系统，临床常见细菌的快速简单的鉴定系统我们都已经设计好，参考鉴定质控单。
4、按鉴定质控单的要求填写好病人姓名，年龄，性别；标本类型，标本编号，送检日期等。
另外最重要的是要填写好该菌种的菌落形态以及有无溶血。
5、复习革兰染色，触酶实验，氧化酶实验。
⑴．革兰染色：是细菌鉴定过程中最常用最基本最重要的染色方法。
首先要将待鉴定的细菌涂片，固定（目的：杀死细菌，改变细菌对染料的通透性）。
第一步：以结晶紫初染（染色液Ⅰ）第二步：以卢戈氏碘液媒染（染色液Ⅱ）乙醇脱色（染色液Ⅲ）95%第三步：用．第四步：最后用稀释复红复染（染色液Ⅳ）⑵．触酶实验(HO实验)：22a.原理：具有过氧化氢酶的细菌能催化双氧水生成水和初生态氧，继而形成氧分子出现气泡。
b.方法：一般用玻片法，就是挑取菌落在洁净的玻片上涂开，滴加3%过氧化氢数滴，观察结果（立即有大量气泡产生者为阳性，不产生气泡者为阴性）。
要注意不能在血平板上进行实验，这样易出现假阳性；另外陈旧菌落要是进行实验可能会导致假阴性结果；还有不能在接种针或环上进行实验。
c.阳性对照用金黄色葡萄球菌，阴性对照用链球菌；试剂要避光置4℃冰箱保存。
d.应用：绝大多数含细胞色素的需氧和兼性厌氧细菌触酶实验阳性，链球菌属阴性。
临床常见细菌鉴定实验中我们一般用于区别葡萄球菌属（+），微球菌属（+），链球菌属（－）。
⑶．氧化酶实验（Kovac实验）：a. 原理：氧化酶又称细胞色素酶，是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。
细菌的鉴定方法
细菌的鉴定方法细菌是一类微小的单细胞生物，广泛存在于自然界中的各种环境中，对人类和其他生物有着重要的影响。
鉴定细菌的方法对于研究细菌的特性、功能和致病机制至关重要。
本文将介绍几种常用的细菌鉴定方法。
一、形态学鉴定法形态学鉴定法是最常用的细菌鉴定方法之一。
通过观察细菌的形态、大小、颜色、聚集方式等特征，可以初步判断细菌的属种。
典型的形态学鉴定方法包括显微镜观察、染色技术和培养基选择等。
显微镜观察可以帮助观察细菌的形态结构，染色技术如革兰氏染色、抗酸染色则可以帮助区分细菌的革兰氏阴性和阳性。
此外，不同的培养基选择也可以提供有关菌落形态、颜色和营养要求等信息。
二、生理生化鉴定法生理生化鉴定法是通过检测细菌的代谢功能和生化特性来进行鉴定。
常用的生理生化鉴定方法包括氧需求性试验、酶活性检测、代谢产物检测等。
氧需求性试验可以判断细菌的需氧性，酶活性检测则可以通过检测细菌是否产生特定的酶来鉴定其种属。
代谢产物检测可以通过检测细菌的代谢产物如产气、产酸和产色等来进行鉴定。
三、分子生物学鉴定法分子生物学鉴定法是近年来发展起来的一种高效、准确的细菌鉴定方法。
通过提取细菌的DNA，利用PCR、序列分析等技术进行鉴定。
例如，16S rDNA序列分析能够提供细菌的高度保守的序列信息，通过与数据库比对可以确定细菌的种属和亲缘关系。
此外，还有基于DNA指纹图谱的方法如RAPD、AFLP等可以用于快速鉴定细菌。
四、免疫学鉴定法免疫学鉴定法是通过检测细菌与抗原或抗体的特异性反应来进行鉴定。
常用的免疫学鉴定方法包括血清学试验、免疫电泳等。
血清学试验可以通过检测细菌与抗体的凝集、沉淀或荧光反应来进行鉴定。
免疫电泳则可以通过检测细菌的特异性抗原蛋白质条带模式来进行鉴定。
细菌的鉴定方法包括形态学鉴定法、生理生化鉴定法、分子生物学鉴定法和免疫学鉴定法等。
不同的鉴定方法可以相互印证，提高鉴定结果的准确性。
在实际应用中，可以根据需要选择合适的鉴定方法，结合多种方法进行细菌的鉴定，以得到准确可靠的结果。
细菌鉴定的基本思路(全)
细菌鉴定一、标本的处理：1、先按标准操作规程（SOP）对标本进行接种（一般种普通血平板和选择性麦康凯平板；真菌-沙保弱；链球菌-巧克力平板，CO2温箱；结核菌-罗氏;粪-SS）。
一般细菌置于35℃培养24h；真菌置于30℃培养2、后将标本涂片，进行革兰染色，判断是革兰阴性或阳性，杆状，球状，短杆，球杆及弧状。
二、根据菌落形态，颜色，光滑与否，边缘，大小，是否有溶血环等初步判断所属菌属。
三、生化鉴定（最主要的依据）定向实验(最重要两实验)API微生物鉴定系统生理生化鉴定：根据微生物对各种生理条件（温度、pH、氧气、渗透压）、生化指标（唯一碳氮源、抗生素、酶、盐碱性）代谢反应进行分析，并将结果转化成软件可以识别的数据，进行聚类分析，与已知的参比菌株数据库进行比较，最终对未知菌进行鉴定的一种技术。
生物梅里埃API试剂类型•API 20E革兰氏阴性杆菌鉴定•API 20NE非发酵菌鉴定•API STAPH葡萄球菌及微球菌常用5种•API STREP链球菌鉴定•API CORYNE棒状杆菌•API 20C AUX酵母菌•API 20A厌氧菌•API LISTERIA李斯特菌•API CAMPY弯曲菌属•API CH芽胞杆菌/乳酸杆菌三、药敏试验（辅助鉴定及指导临床用药）最常用的纸片扩散法即K-B法。
原理：该法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加，抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成浓度梯度。
同时，纸片周围抑菌浓度范围内的菌株不能生长，二抑菌范围外的菌株则可以生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈，不同的抑菌药物的抑菌圈直径因受药物在琼脂中扩散速度的影响而可能不同，抑菌圈的大小可以反映测试菌对药物的敏感程度，并与该药物对测试菌的MIC呈负相关。
结果分为敏感S、耐药R及中介I。
利用某些菌对某些药物天然耐药进而辅助鉴定结果正确与否,如嗜麦芽窄食单胞菌对亚胺培南(碳青霉烯类)天然耐药。
微生物检验结果报告注意事项
微生物检验结果报告注意事项一、涉及定性项目的检验结果报告沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠杆菌O157：H7、空肠弯曲杆菌、副溶血性弧菌（定性）等，如果检样是称重取样，则最后检测结果一定报告为检出/25g或未检出/25g。
如果检样是体积取样，则最后检测结果一定报告为检出/25mL或未检出/25mL。
检测标准要求g必须要小写，mL中m必须小写，L则必须大写。
记录中所有有用的信息必须填上，无法填充的用“/”划掉。
二、菌落总数检验结果报告1.菌落总数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约以整数报告，如80.5CFU可修约报告为81CFU;80.4CFU则修约报告为80CFU。
2.菌落总数大于等于100CFU时，左边数第3位数字采用四舍五入原则修约后，取前2位数字，后面位数用0代替，也可用10的指数形式表示：如10-2两平板平均菌落数为238CFU/g，可修约为240CFU/g，最后报告为24000CFU/g或2.4×104CFU/g。
3.霉菌、酵母菌、乳酸菌、蜡样芽孢杆菌、产气荚膜梭菌报告形式和菌落总数一样。
4.称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。
三、大肠菌群检验结果报告。
LST初发酵，产酸产气，接种BGLB复发酵后仍产酸产气，则证明样品受到了大肠菌群污染，可检索MPN表，得出相应结果。
检测时如果采用（10-1，10-2,10-3）三个稀释度，最后BGLB产气管为（2，0，0），查MPN表可得出大肠菌群检测值为9.2MPN/g；检测时如果采用（100，10-1,10-2）三个稀释度，最后BGLB产气管仍为（2，0，0），查MPN表可得大肠菌群检测值为0.92MPN/g；如果采用（10-2，10-3,10-4）三个稀释度，最后BGLB产气管仍然为（2，0，0），查MPN表可得大肠菌群检测值为92MPN/g。
称重取样以MPN/g为单位报告，体积取样以MPN/mL为单位报告。
菌种鉴定标准操作规程
菌种鉴定标准操作规程目的：建立菌种鉴定标准操作规程范围：适用于******鉴定标准操作职责：内容：1整体操作步骤1.1纯化、分离待鉴定菌用接种环挑取待鉴定菌落或少许含菌溶液到相应的培养基上（如TSA），划线分离，以出现微生物单菌落为止。
1.2挑取纯化后的单菌落，进行革兰染色、镜检，以确定待鉴定菌的革兰属性。
1.3如镜检结果为革兰阴性杆菌，则先进行发酵实验。
如发酵实验结果为阴性，则选用API20NE试剂条进行鉴定；如发酵实验结果为阳性，则在经过细胞色素氧化酶实验后选用API20E试剂条进行鉴定。
1.4如镜检结果为革兰阳性球菌，则先进行过氧化氢酶实验。
如实验结果为阴性则选用API Strep试剂条进行鉴定，如实验结果为阳性则选用API Staph试剂条进行鉴定。
1.5假如镜检结果为革兰阳性杆菌并且有内生芽胞，则选用API 50CHB试剂条进行鉴定；否则，根据运动性实验和过氧化氢酶实验结果选用API Coryne或其他试剂条进行鉴定。
1.6选定正确的试剂条以后，根据不同的API试剂条的标准操作规程准备接种物，进行接种、培养等操作并将结果形成数码，用API鉴定软件鉴定或查询待检菌的名称均可。
鉴定结果应记录，必要时，给出相应解释。
2革兰氏染色2.1染色剂的配制2.1.1结晶紫染色液：甲液：结晶紫 1.0g95%的酒精20ml乙液：草酸铵0.8g水80ml将甲液和乙液混合均匀，静置48h使用，置密闭棕色瓶中储存。
2.1.2碘液：碘 1.0g碘化钾 2.0g水300ml配制时先用3～5ml水将碘化钾溶解，再加入碘，用力摇匀，使之全部溶解后，再加水稀释至300ml，摇匀，分装在棕色瓶中储存。
2.1.3稀石碳酸红溶液:碱性品红 1.0g石碳酸 5.0ml95%乙醇10.0ml配制时用乙醇溶解碱性品红，然后加入石碳酸溶液，使用时加水稀释至100ml，摇匀。
2.2操作:2.2.1涂片：用接种环挑取液体培养物中菌体在载玻片上涂成薄层，固体培养物则先在载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水，用接种环挑取少量菌体在载玻片上涂成薄层。
抗菌药物敏感试验下
一、β-内酰胺类（β-lactam）
化学结构中含有β-内酰胺环的抗生素。 β-内酰胺抗生素分子侧链的组成形式多样 ，形成了抗菌谱不同、临床药理学特性各 异的多种不同β-内酰胺抗生素。
青霉素的母核
β-内酰胺类药物种类
♣青霉素（penicillin）类：青霉素G、 甲 氧 西 林 、
阿莫西林、替卡西林、派拉西林等
二、 ESBLs检测
ESBLs：扩大了原来的底物谱，可以水解青 霉素和一、二、三代头孢菌素以及单环类抗 生素。 1.纸片法检测 双相纸片试验 2.液体稀释法检测
筛选试验：头孢泊肟、头孢他啶、氨曲南、 头孢噻肟
确证试验：头孢他啶、头孢他啶/克拉维酸 头孢噻肟 头孢噻肟/克拉维酸
双纸片协同法（初筛试验）
五、磺胺类
1.种类
磺胺嘧啶、甲氧苄胺嘧啶、复方新诺明等
2.作用机制
影响核酸合成，抑制细菌生长繁殖
六、其他抗生素
1.四环素类
种类：四环素、土霉素、多西环素（强力） 作用机制：与细菌30S亚基结合，抑制蛋
白质合成
2.氯霉素类
种类：氯霉素、甲砜霉素 作用机制：与细菌50S亚基结合，抑制蛋白
32 - - - - - -
16 + - - - - -
8
+ +- - - -
+ ++- - -
4
+ +++- -
2
+ + + + +-
0 甲药 0 0.5 1 2 4 8 乙药
第五章 细菌的分类与命名
第一节 概述 一、基本概念 1.分类 （1）人为分类法：以形态、生理生化特征为依据 （2）系统分类法：以细菌大分子物质结构的同源
环境微生物菌种鉴定
环境微生物菌种鉴定微生物是地球上数量最多的生物，它们在我们的生活和环境中无处不在。
为了更好地利用和保护这些微生物资源，我们需要对它们进行鉴定和分类。
本文将介绍环境微生物菌种鉴定的基本方法和应用领域。
一、微生物菌种鉴定的基本方法1、形态学鉴定形态学鉴定是根据微生物的形态、大小、颜色、生长速度等特征对其进行分类和鉴定的一种方法。
通过观察菌落的形状、大小、质地、颜色、边缘特征等，可以初步判断微生物的种类。
2、生理生化鉴定生理生化鉴定是通过测试微生物对各种底物的发酵反应和代谢产物的性质，判断其生理生化特性，从而对其进行分类和鉴定的一种方法。
常见的生理生化试验包括糖发酵试验、柠檬酸盐试验、吲哚试验等。
3、分子生物学鉴定分子生物学鉴定是基于微生物基因组序列差异对其进行分类和鉴定的方法。
该方法通过提取微生物基因组DNA，进行PCR扩增，然后进行序列比对，判断微生物的种类和亲缘关系。
二、环境微生物菌种鉴定的应用领域1、环境保护环境微生物菌种鉴定在环境保护方面具有广泛的应用。
例如，在污水处理中，通过鉴定微生物的种类和数量，可以优化污水处理工艺，提高处理效率。
在土壤污染治理中，通过鉴定能够降解特定污染物的微生物种类，可以针对性地设计生物治理方案。
2、生物多样性研究环境微生物菌种鉴定在生物多样性研究中具有重要意义。
通过对不同生态环境中的微生物进行鉴定，可以揭示不同地区和不同气候条件下的生物多样性特征，为保护生物多样性和生态平衡提供科学依据。
3、生物技术应用环境微生物菌种鉴定在生物技术领域具有广泛的应用。
例如，在生物制药中，通过鉴定微生物的种类和代谢产物，可以发现新的药物资源和开发新的药物。
在农业微生物肥料开发中，通过鉴定微生物的种类和生理生化特性，可以研制出具有特定功能的微生物肥料。
三、总结环境微生物菌种鉴定是微生物资源保护和利用的重要手段。
通过形态学、生理生化和分子生物学等方法对微生物进行分类和鉴定，可以更好地了解和利用这些资源。
细菌鉴定的方法和步骤
细菌鉴定的方法和步骤
细菌鉴定是通过一系列方法和步骤来确定细菌菌种的过程。
以下是常用的细菌鉴定方法和步骤：
1. 收集样品：从目标环境或感染部位收集细菌样品，如血液、尿液、唾液、食物等，以便后续实验。
2. 培养：将细菌样品接种到适当的培养基上，提供足够的营养物质和环境来促进细菌的生长。
3. 纯化：将单个细菌菌落分离出来，并通过连续的传代培养使其得到纯化，以避免不同细菌种类的混杂。
4. 形态观察：观察细菌在固体培养基上的形态特征，如菌落的形状、颜色、大小等，以及在显微镜下的细胞形态，如形状、大小、结构等。
5. 染色：将细菌样品进行染色，如革兰氏染色、抗酸染色等，以便观察不同细菌的染色特征。
6. 生理生化试验：进行一系列生理生化试验，如代谢产物的产生、酶活性、氧需求等，以确定细菌的代谢特征。
7. 耐受性检测：测试细菌对温度、pH值、氧气和抗生素等环境因素的耐受性，以进一步确认鉴定结果。
8. 分子生物学分析：利用分子生物学技术，如PCR、序列分析等，通过对细菌的基因组或特定基因进行分析，来确定细菌的物种。
9. 鉴定结果：根据以上步骤的结果和参考文献，将细菌归类到已知的菌属或菌种中，最终得出细菌的鉴定结果。
需要注意的是，细菌鉴定是一个复杂的过程，通常需要准备鉴别试剂和设备，以及具备相关实验操作的技术和经验。
clsi-m100-s20_2010抗菌药物敏感性试验解释标准(中文)
内部交流资料
Vol . 30 No .1 M1 0 0 - S 20
抗微生物药物敏感性试验的执行标准； 第二十版信息增刊 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twentieth Informational Supplement
抗微生物药物敏感性试验执行标准； 第二十版信息增刊
Volume 30 Number 1
Franklin R. Cockerill, III, MD Karen Bush, PhD Michael N. Dudley, PharmD,FIDSA George M. Eliopoulos, MD Dwight J. Hardy, PhD David W. Hecht, MD Janet F. Hindler, MCLS, MT(ASCP) Janet A. Hindler. MCLS, MT(ASCP) Jean B. Patel, PhD, D(ABMM) Mair Powell, MD, FRCP, FRCPath, MHRA Richard B. Thomson, Jr., PhD John D. Turnidge, MD Melvin P. Weinstein, MD Barbara L. Zimmer, PhD Mary Jane Ferraro, PhD, MPH Jana M. Swenson, MMSc
细菌鉴定的原理
细菌鉴定的原理
细菌鉴定的原理是基于细菌的形态特征、生理生化特性和分子遗传特征进行分析和比对。
具体步骤如下：
1. 形态特征鉴定：观察细菌的形态特征，包括细胞形状、大小、颜色等。
常用的方法有显微镜观察、染色和细菌培养。
2. 生理生化特性鉴定：通过检测细菌的生理生化特性，如营养需求、代谢产物和酶活性等，来鉴定细菌种类。
常用的方法有碳源利用能力测试、酶活性检测和药敏试验。
3. 分子遗传特征鉴定：利用分子生物学技术对细菌的基因组进行分析，包括16S rRNA序列分析、全基因组测序和PCR扩
增等。
这些方法能够揭示细菌的亲缘关系和物种分类。
细菌鉴定的原理是通过对细菌的多个特征进行综合分析，从而确定其分类和身份。
由于不同种类的细菌在形态、生理和遗传特征上存在差异，因此通过比对已知的参考菌种和数据库中的细菌数据，可以辨认未知细菌的种属。
细菌鉴定在医学、食品安全、环境监测和农业等领域具有重要应用价值。
微生物检验实验室细菌鉴定操作规程
微生物检验实验室细菌鉴定操作规程
1．目的
规范细菌鉴定标准操作规程。
2．适用范围
革兰阴性菌、革兰阳性菌等。
3．职责
检验人员严格执行本程序。
4．程序
4.1 观察菌落大小、颜色、气味、溶血、形态特征等，观
察内容应记录在《细菌鉴定流程表》。
4.2 涂片，革兰染色，观察染色性及细菌形态、大小和排列，球菌、杆菌或螺形菌等，观察内容记录在《细菌鉴定流程表》。
4.3 初步生化反应根据菌落特征和涂片结果选择初步生化反应，如氧化酶、触酶、凝固酶（玻片法）等。
4.4 制定细菌鉴定方案
4.4.1 仪器鉴定方案（以VITEK2为例）
革兰阴性杆菌：选择GN卡（阴性菌鉴定卡）。
革兰阳性球菌：选择GP卡（阳性菌鉴定卡）。
酵母菌：选择YST卡（酵母菌鉴定卡）。
需氧芽孢杆菌：选择BBL卡（需氧芽孢杆菌卡）。
4.4.2 手工细菌鉴定法
氧化酶阳性革兰阴性杆菌，选择非发酵鉴定生化反应组合：葡萄糖O/F、木糖、麦芽糖、硝酸盐、动力、七叶苷等生化反应。
氧化酶阴性革兰阴性杆菌，选择肠杆菌科细菌鉴定生化反应组合：触酶、硝酸盐、葡萄糖O/F、动力、乳糖、VP、吲哚、甲基红、枸橼酸盐、精氨酸、鸟氨酸、赖氨酸等生化反应。
疑不动杆菌氧化酶阴性革兰阴性杆菌，选择非发酵鉴定生化反应组合。
革兰阳性球菌，选择革兰阳性球菌鉴定生化反应组合：触酶、葡萄糖O/F、胆汁七叶苷、蔗糖、木糖、甘露醇、硝酸盐、脲酶等。
细菌鉴定的方法和步骤
细菌鉴定的方法和步骤细菌鉴定是确定或确认细菌属种的过程，它是微生物学中非常重要的一部分，有助于了解细菌的特征、生态习性和其对人类的影响。
下面，我将介绍细菌鉴定的一般方法和步骤。
一、准备实验室条件和材料在进行细菌鉴定之前，需要准备好实验室条件和所需的材料。
实验室应具备洁净、无菌环境，预防细菌污染。
所需的材料包括培养基、培养皿、平板、显微镜、油浸物镜、背景颜色固定剂、染色试剂、耗材等。
同时，实验人员需要佩戴实验手套和口罩，保证操作的无菌性。
二、选择适当的培养基不同的细菌在不同的培养基上生长出不同的菌落，因此选择适当的培养基是细菌鉴定的关键。
常用的培养基有营养琼脂培养基、血琼脂培养基、马铃薯蔗糖琼脂培养基等。
根据需要鉴定的菌株特性和需求，选择适当的培养基。
三、样品采集和拮抗在开始鉴定之前，需要采集样品并进行扩培。
样品来源可以是病人的体液、环境中的土壤、水源、食品等。
样品采集最好是在无菌环境中进行，避免外来的细菌干扰结果。
四、制备纯培养物为了获得纯种细菌，需要将样品进行拮抗并分离。
拮抗是指将细菌分离成单独的菌落，并在新的培养基上获得单个菌种的纯培养物。
常用的方法有稀释再悬浮平板法、分离斑点法、筛选法等。
通过将菌落接种到培养基上，经过单菌的选择和培养，最终得到纯种菌株。
五、观察菌落特征观察菌落形态是进行细菌鉴定的重要步骤之一。
菌落特征包括菌落大小、形状、质地、边缘、颜色等。
通常使用肉眼或显微镜对菌落进行观察，并记录下菌落的特征。
六、进行染色处理染色是细菌鉴定中常用的方法之一。
根据细菌细胞壁的性质，通常使用革兰氏染色、苏木精-伊红染色等常规方法进行染色处理。
通过染色，可以初步了解细菌的形态、结构和染色特性。
七、观察细胞的形态和结构将已染色的细菌样本放置在显微镜下，使用油浸物镜进行镜片调焦。
观察细菌细胞的形态特征，如形状（球形、棒状、螺旋形等）、大小、连杆性等。
此外，还可以观察细菌细胞的结构、附属结构（如鞭毛、菌毛等）以及内部结构（如胞浆、核质等）。
ESBLs检测的筛选与确证试验
肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和大肠埃希菌中
ESBLs检测的筛选与确证试验
ESBLs是英文Extended-Spectrum β-lactamase的缩写，中文意思是超广谱β-内酰胺酶，它是当前抗生素出现的新的耐药趋势之一。
目前大肠埃希氏菌（大肠杆菌）、肺炎克雷伯氏菌是最常见的产ESBLs菌株的细菌，其次，阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌、弗劳地枸橼酸菌、铜绿假单孢菌也可出现产ESBLs菌株的细菌。
脚注:
头孢他啶/克拉维酸(30/10μg)纸片与头孢噻肟/克拉维酸（30/10μg）纸片的制备：使用克拉维酸1000μg/ml的原液（新鲜制备或者从－70℃冰冻中取出已分装在小瓶中的），把10μl的克拉维酸加到头孢他啶（30μg）和头孢噻肟（30μg）的纸片上。
在纸片贴于平板之前1个小时内，用微量加样器把10μl原液加到头孢他啶和头孢噻肟纸片上，允许有30
分钟的时间以利于克拉维酸的吸收和纸片在贴之前保持足够的干燥。
制备完成后立即使用纸片，否则丢弃；不能保存。
（1）CAZ CAZ/棒酸，CTX CTX/棒酸。
一种大于5MM，另一种小于5MM或相等，可确认为ESBL阳性。
（2）加棒酸的药片抑菌圈直径反而小于不加的，可能是片间差异，应认为ESBL阴性。
《微生物鉴定指导原则》解读与介绍
微生物来源
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微生物表型的表达，除受 遗传基因控制外，还与分 离环境、培养基和生长条 件等因素有关。
表型微生物鉴定常需要大 量的纯培养物，一些从初 始培养物中刚分离出的受 损微生物还不能完整地表 达其表型属性。因此应注 意采用的培养基、培养时 间和传代次数。
非无菌产品的控制菌检查一般应达到种属的水平 无菌试验结果阳性和无菌生产模拟工艺（如培养基灌装）失败时，
对检出的微生物鉴定至少达到种属水平，必要时需达到菌株水平
8
微生物鉴定
微生物鉴定根据所需达到的鉴定水平选择鉴定方法：
表型微生物鉴定 基因型微生物鉴定 必要时采用多种鉴定方法确定
方法的局限性与数据库局限性息息相关：
— — 《微生物鉴定指导原则》
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微生物鉴定方法的确认
方法确认
确认（Validation）：对产品的各项相关事项作出科学性的评价 及书面记录的过程
验证（Qualification）：为确认的一个环节，目的是保证仪器在 使用的过程当中，符合原设计的要求并达到原拟的目的，亦即 产 生可信赖的量测结果
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溯源分析
菌株水平的鉴定非常重要：
在污染调查过程中，尤其是产品中的微生物数量高于建议水平或 出现异常高的微生物检出情况时
在无菌工艺中，尤其是无菌试验结果阳性和培养基灌装等模拟工 艺失败时
污染调查等应以基因型特征鉴定为主，表型特征鉴定为 辅。
同一地点同种菌表型和基因型特征是基本一致的 不同地点的同种菌表性特征可能基本一致，但保守及可变区域的
分类 培养物 形态学
生理学 生化反应 抑制性 血清学 化学分类 生态学
菌种鉴定原理实验报告
菌种鉴定原理实验报告实验介绍菌种鉴定是一项重要的微生物学技术，用于确定特定菌株的种属及分类。
本实验旨在介绍菌种鉴定的原理和相关实验操作。
实验原理菌种鉴定的原理主要基于菌株的形态特征、生理生化特性和分子遗传学特征等方面。
1. 形态特征通过观察和描述菌落形态、菌丝形态、孢子形态、色素形成等特征，可以初步确定菌株的分类。
2. 生理生化特性通过菌株在不同培养基、温度、PH值和抗生素等条件下的生长特性和代谢特点，可以进一步缩小菌株的分类范围。
3. 分子遗传学特征利用分子生物学技术，比如PCR扩增和DNA测序，可以分析菌株的核酸序列，进一步明确菌株的种属。
实验步骤1. 采集样本选择需要鉴定的菌种样本，可以从土壤、水体、食物或患者体液等来源采集。
2. 培养菌株将采集到的样本分离出菌株，进行培养，得到纯种菌株。
培养基的选择根据菌株的特性而定，可以是常用的营养琼脂、马铃薯蔗糖琼脂或专门的选择性培养基等。
3. 形态特征观察观察菌株的菌落形态、颜色、边缘形状、透明度等特征，以及显微镜下的菌丝形态、孢子形态等特征。
4. 生理生化特性测试选择适当的生理生化特性测试方法，如氧气需求量测试、革兰氏染色、酸碱产气试验、产色素能力等，来进一步确认菌株的分类。
5. 分子遗传学分析如果需要，可以进行分子遗传学分析，如PCR扩增特定基因片段，进行测序，通过与数据库中的序列进行比对，确定菌株的种属。
实验结果与讨论根据上述步骤，我们鉴定了所收集的菌株，并得到了以下结果：1. 形态特征观察结果表明菌株的菌落为白色、圆形，边缘光滑，具有乳状透明度。
2. 生理生化特性测试结果显示菌株属于革兰氏阴性菌，氧需求量较低，不产生酸碱气体，具有色素产生能力。
3. 分子遗传学分析结果表明菌株的18S rRNA序列与数据库中的XX属菌株序列高度相似，可以确定该菌株属于XX属。
据此，我们可以初步确定该菌株的分类为XX属，但仍需进一步的实验确认。
实验结论菌种鉴定是一项复杂而重要的技术，通过观察菌株的形态特征、生理生化特性和分子遗传学特征等，可以初步确定菌株的种属和分类。
微生物鉴定确认试验
Table of Contents目录1.PURPOSE 目的 (2)2.SCOPE 范围 (2)3.REFERENCE 参考资料 (2)4.DEFINITIONS 定义 (2)5.AUTHORITY/RESPONSIBILITY 权责 (2)6.PROCEDURE 程序 (2)7.RELATED DOCUMENTS 相关文件: (8)8.RELATED RECORDS 相关记录: (8)9.REVISON RECORDS 修订记录: (8)10.ATTACHMENT 附件: (9)1. PURPOSE目的本程序旨在阐明微生物实验结果的鉴别程序和操作规范，确保鉴别结果的准确性和可靠性。
2. SCOPE范围所有用于检测的以及在检测中发现的微生物，包括细菌（需氧菌、厌氧菌）、酵母菌和霉菌。
3. REFERENCE参考资料产品说明书4. DEFINITIONS定义不适用5. AUTHORITY/RESPONSIBILITY权责5.1 QC主管有责任保证此程序的执行。
5.2 实验室所有微生物人员有责任严格按此程序执行。
6. PROCEDURE程序6.1 方法分类微生物实验结果的鉴别方法分为：菌落形态检查、显微镜检查、基础生化试验鉴别、API鉴别。
其中API是建立在生化鉴别试验基础上的一种简便、快捷的鉴别方式。
6.2 方法选择微生物鉴别是微生物实验室重要的步骤之一，同时也是物料释放的主要参考依据，因此微生物鉴别方法的选择和具体的鉴别操作必须严格按照相应的标准操作程序执行，从而保证鉴别结果的可靠性。
在无明确规定的情况下，首先应当依次进行菌落形态检查和显微镜检查以确认微生物的大类，然后根据初步确认结果选择合适的API系统进行鉴定，必要时进行基础生化试验鉴别以辅助确认微生物种类。
6.3 鉴别步骤6.3.1 菌落形态检查菌落形态检查主要采用肉眼直接对有形的菌落形态进行辨识，主要包括菌落大小、颜色、菌落表面光滑度和菌落外形等，必要时可以借助放大镜。
细菌的推断试验和确认试验
问题描述：
我没有恒温培养箱。有什么无需恒温培养箱就能进行微生物学试验的方法吗？
问题解答：
为了提供目标微生物生长的合适条件和抑制非目标微生物的生长，保持恒定的温度是必须的。如果温度过高，微生物可能死亡。如果温度过低，微生物可能无法正常生长而非目标微生物却可能大量繁殖。使用恒温培养箱保持恒定的温度是保证结果准确性的唯一方法。用于产硫化氢细菌的PathoScreen介质和用于多种细菌的BART检测剂是唯一对温度没有严格要求的试验。BART检测剂可以在室温下培养，而PathoScreen可在25至35℃范围内培养
我需要什么来测定可以作为报告提交的pH值？
问题描述：
我要测定pH值并将结果报告给管理机构。为此我需要什么？
问题解答：
如果你要将结果报告给USEPA这样的机构，你必须使用pH电极和pH计，例如sensION型pH计。pH计可以给出最佳的准确度和灵敏度，可以在全pH范围内测量，而且适用于大多数水样。但是需要用pH缓冲溶液对它们进行日常标定。Hach的pH计配有缓冲溶液，并附有对于简化的标定方法的详细说明。
在使用硝酸镉还原法检测时，对于含盐样品总得到偏低的结果。我该怎么办？
问题解答：
如果样品中的氯化物浓度高于100mg/L，将减慢与NitraVer5和NitraVer6试剂的反应速度。要解决这个问题，您可以通过用已知浓度的NO3－标准溶液(该标准溶液与被测样品一样含有相同浓度的氯化物)来校准仪器，或是改换另一种分析方法。
由于多种原因，人们使用不同的化学形态表达同样的结果。其中有些情况是特别规定的。Hach的多数色度计和分光光度计都是以PO43-作为磷的默认化学形态，但通过从键盘或触摸屏上进行选择，它们也可以显示以其他形态表示的浓度。
细菌鉴定的定性与确证试验
细菌鉴定的定性与确证试验1、ESBLs试验初筛法：酶复合抑制剂纸片奥格门汀（安美汀）或氨苄西林/舒巴坦（优立新）试验纸片头孢他啶头孢噻肟氨曲南头孢拉定（或头孢曲松）奥格门汀与其余任何一个或多个试验纸片出现戒指状抑菌环，或试验纸片抑菌环有向奥格门汀纸片方向扩大现象，即可判定为ESBL（+）。
确证法：酶复合抑制纸片头孢他啶/棒酸（CAZ+C）头孢噻肟/棒酸（CTX+C）试验纸片CAZ30CTX30按CLSI/NCCLS规则，CAZ+C或CTX+C的抑菌环比CAZ30或CTX30的抑菌环≧5即可判定为ESBL （+）。
大肠埃希菌、克雷伯菌、奇异变形杆菌被列入检测范围。
2、头孢西丁纸片法预报meeA介导的苯唑西林耐药试验金黄色葡萄球菌和邓路葡萄球菌：头孢西丁纸片（FOX30）抑菌圈≤21mm，报告苯唑西林R；头孢西丁纸片（FOX30）抑菌圈≥22mm，报告苯唑西林S，并报告MRSA或MRCNS。
除邓路葡萄球菌外的凝固酶阴性葡萄球菌：头孢西丁纸片（FOX30）抑菌圈≤24mm，报告苯唑西林R；头孢西丁纸片（FOX30）抑菌圈≥25mm，报告苯唑西林S，并报MRSE（MRCNS）。
3、杆菌肽敏感试验A群β溶血性链球菌为S≥13mm可报S用血清或乳胶凝集试验分群确证。
4、奥普托欣敏感试验肺炎链球菌为S≥14可报S结合胆汁溶菌和菊糖发酵试验鉴定。
5、CAMP试验B群链球菌（无乳链球菌）为阳性在与金黄色葡萄球菌画线的垂直线上（受试菌）出现箭形溶血为阳性用血清或乳胶凝集试验分群确证。
6、新生霉素试验≥16mm为S（无抗性）≤16mm为R（有抗性）金葡、表葡、溶血葡、中间葡等为S腐生葡、木糖葡、孔氏葡等为R。
7、氧化酶试验即细胞色素氧化酶。
试剂为盐酸四甲基对苯二胺，紫黑色为（+）；肠杆菌科细菌全为（－），非发酵菌中除嗜麦芽窄食单胞菌、不动杆菌属外，均为（+）；弧菌科细菌、奈瑟菌属全为（+）。
8、触酶试验即过氧化氢酶。
产碳青酶烯肠杆菌科细菌筛选和确证试验(改良Hodge试验)标准操作程序
产碳青酶烯肠杆菌科细菌筛选和确证试验（改良Hodge试验）标准操作程序1. 检验目的规范产碳青酶烯肠杆菌科细菌筛选和确证试验，可用于感染控制和流行病学调查。
2. 适用范围肠杆菌科细菌，当三代头孢菌素（即，头孢哌酮、头孢噻肟、头孢他啶、头孢唑肟和头孢曲松）中一种或多种药物耐药，而碳青酶烯类药物试验结果为中介或耐药时。
3. 样本要求经过纯培养的肠杆菌科细菌体外药敏试验表明对三代头孢菌素耐药而对碳青酶烯类药物敏感。
4. 材料M-H培养基、4.5%无菌盐水、药敏纸片、无菌棉签、35℃孵育箱、比浊仪。
5. 操作步骤5.1 初筛试验5.1.1 纸片扩散法用厄他培南10μg或美罗培南10μg纸片筛选试验菌株，当抑菌圈直径厄他培南19-21mm或美罗培南16-21mm，提示可能产碳青霉烯酶，不管他们是否在当前敏感解释标准范围内。
执行改良Hodge试验，进行确证。
5.1.2 肉汤微量稀释法标准的肉汤微量稀释法测厄他培南或美罗培南或亚胺培南的MIC 值，当厄他培南2μg/ml或美罗培南2-4μg/ml或亚胺培南2-4μg/ml。
试验菌株出现上面列出的MIC值，提示可能产碳青霉烯酶，不管他们是在当前敏感解释标准范围内。
执行改良Hodge试验，进行确证。
5.2 确证试验5.2.1 用大肠埃希菌ATCC25922（指示菌）在生理盐水制备0.5麦氏标准菌悬液，再用盐水1：10稀释按常规纸片扩散法程序接种MH平板。
使平板干燥3-10分钟，根据下面评注和图1和2说明，在平板表面放置适当数量厄他培南或美罗培南纸片。
5.2.2 用10μl接种环挑取在血琼脂平板过夜生长的3-5个试验菌落或质控菌株，从纸片边缘向外划直线接种。
划线至少有20-25mm长。
每个平板试验菌株数量见下面评注和图1和2说明。
5.2.3 孵育条件：35℃，16-20小时。
5.2.4 孵育后，检查MH平板，在抑菌圈与试验菌株或质控菌株划线交叉处出现增强生长（见图1和2）。
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细菌鉴定的定性与确证试验
1、ESBLs试验
初筛法：酶复合抑制剂纸片奥格门汀（安美汀）或氨苄西林/舒巴坦（优立新）
试验纸片头孢他啶头孢噻肟氨曲南头孢拉定（或头孢曲松）
奥格门汀与其余任何一个或多个试验纸片出现戒指状抑菌环，或试验纸片抑菌环有向奥格门汀纸片方向扩大现象，即可判定为ESBL（+）。
确证法：酶复合抑制纸片头孢他啶/棒酸（CAZ+C）头孢噻肟/棒酸（CTX+C）
试验纸片CAZ30CTX30
按CLSI/NCCLS规则，CAZ+C或CTX+C的抑菌环比CAZ30或CTX30的抑菌环≧5即可判定为ESBL （+）。
大肠埃希菌、克雷伯菌、奇异变形杆菌被列入检测范围。
2、头孢西丁纸片法预报meeA介导的苯唑西林耐药试验
金黄色葡萄球菌和邓路葡萄球菌：头孢西丁纸片（FOX30）抑菌圈≤21mm，报告苯唑西林R；
头孢西丁纸片（FOX30）抑菌圈≥22mm，报告苯唑西林S，
并报告MRSA或MRCNS。
除邓路葡萄球菌外的凝固酶阴性葡萄球菌：头孢西丁纸片（FOX30）抑菌圈≤24mm，报告苯唑西林R；
头孢西丁纸片（FOX30）抑菌圈≥25mm，报告苯唑西林S，
并报MRSE（MRCNS）。
3、杆菌肽敏感试验A群β溶血性链球菌为S≥13mm可报S用血清或乳胶凝集试验分群确证。
4、奥普托欣敏感试验肺炎链球菌为S≥14可报S结合胆汁溶菌和菊糖发酵试验鉴定。
5、CAMP试验B群链球菌（无乳链球菌）为阳性在与金黄色葡萄球菌画线的垂直线上（受试菌）出现箭
形溶血为阳性用血清或乳胶凝集试验分群确证。
6、新生霉素试验≥16mm为S（无抗性）≤16mm为R（有抗性）金葡、表葡、溶血葡、中间葡等为S
腐生葡、木糖葡、孔氏葡等为R。
7、氧化酶试验即细胞色素氧化酶。
试剂为盐酸四甲基对苯二胺，紫黑色为（+）；肠杆菌科细菌全为（－），
非发酵菌中除嗜麦芽窄食单胞菌、不动杆菌属外，均为（+）；弧菌科细菌、奈瑟菌属全为（+）。
8、触酶试验即过氧化氢酶。
葡萄球菌为较强（+），微球菌、革兰阳性杆菌为较弱（+）；链球菌全为（－）。
9、β-内酰胺酶试验头孢硝噻吩纸片法。
对葡萄球菌、链球菌、嗜血杆菌、奈瑟菌等临床价值较大。
10、O-129敏感试验2，4-二氨基-6，7-二异丙基喋啶纸片（10ug与150ug）接种后35℃18-24h，纸片周围任
何大小的抑菌环均为S。
弧菌属、邻单胞菌属为S，气单胞菌属为R。
11、拉丝试验4%或10%KOH（或NaOH）G+杆菌为（－），G-杆菌为（+）。
12、HP专用鉴定试验脲酶强（+），醋酸吲哚酚（－）马尿酸水解（－）氧化酶（+）。
13、卫星试验血平板卫星试验（具备Ⅹ、Ⅴ因子）阳性（+）为流感嗜血杆菌(Hi)、溶血嗜血杆菌。
M-H平板卫星试验（只具备Ⅴ因子）阳性（+）为副流感、副溶血、副嗜沫、迟缓嗜血杆菌；14、Ⅹ、ⅤⅩ+Ⅴ因子试验流感嗜血杆菌(Hi)、溶血嗜血杆菌需Ⅹ+Ⅴ因子；副流感、副溶血、副嗜沫、
迟缓嗜血杆菌只需Ⅴ因子；杜克雷嗜血杆菌只需Ⅹ因子；嗜沫嗜血杆菌不需Ⅹ、Ⅴ因子。
15、D-试验金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌可能对克林霉素具有天然或诱导耐药，在距红霉素纸片边
缘15-26mm处贴上克林霉素纸片（2ug）35℃18-24h后，如果克林霉素与红霉素相邻一边出现平
顶现象（D-现象），则表明可诱导克林霉素耐药，应报告：克林霉素耐药。
反之则报告敏感。
16、血清凝集试验因抗原为多价，抗体为单价，当抗原抗体达到价数平衡时，凝集试验效果才最佳，故挑取
的量，抗原要适量地少，抗体要适量地多。
一般用于凝集确证试验的有：霍乱弧菌O1、O139，
致病性大肠杆菌，大肠杆菌O157：H7，沙门菌，志贺菌，链球菌分群等。
17、葡萄糖O/F试验①用于G+球菌的鉴别：葡萄球菌+/+微球菌+/-；②用于G-杆菌的鉴别：肠杆菌科、弧
菌科+/+非发酵菌+/-。
18、芽管试验白色念珠菌（+），其余真菌（－）。
19、红四氮唑（TTC）试验主要用于热带假丝酵母菌的鉴定。
热带假丝酵母菌呈红色，白假丝酵母菌无色，
其余介乎两者之间。
20、科玛嘉显色试验主要用于念珠菌的鉴别。
绿色或翠绿色为白色念珠菌蓝灰色或铁蓝色为热带念珠菌粉
红色为克柔念珠菌紫色为光滑念珠菌白色为其它念珠菌。
21、耐盐试验主要用于弧菌属细菌的鉴别。
霍乱弧菌：无盐胨水(+) 6%Nacl(+) 高于6%Nacl(－)，
副溶血性弧菌无盐胨水(－)6%Nacl(+)高于8%Nacl(－)。
22、革兰染色主要把细菌分成G－和G＋两大类。
23、抗酸染色结核杆菌和分枝杆菌（+）奴卡菌（-/+）放丝菌（－）。
24、厐特氏染色主要是对白喉杆菌的鉴别。
25、墨汁负染色主要鉴别隐球菌，尤其是新型隐球菌。
26、鞭毛染色主要是对非发酵菌的鉴别。
铜绿假单胞菌、斯氏假单胞菌、腐败假单胞菌、产碱假单胞菌、类
产碱假单胞菌、皮氏假单胞菌等为单极毛；荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、
洋葱假单胞菌、丛毛单胞菌等为多极毛；产碱杆菌属、人苍白杆菌、鲍特菌属为周毛；不动杆
菌属、莫拉菌属、黄杆菌属无鞭毛。
27、悬滴法、压片法主要观察细菌动力。
28、暗视野映光法主要用于螺旋体的检查。