张继宗药学三班2013213067简介肌凝蛋白包括一个ATP从属的马达蛋白

张继宗药学三班2013213067 简介肌凝蛋白包括一个ATP从属的马达蛋白，它在细胞进程中比如肌肉萎缩、细胞分裂、囊泡转运和细胞机动性等相关机能转变中发挥了重要的作用。

某些疾病与这些蛋白的功能性改变有关。

人心脏肌球蛋白重链儿（MYH7）的突变与一些心脏疾病有关，尤其肥大性心肌症（HCM），这被人广泛熟知。

将近45%的已知的HCM突变被发现早在MYH7上，但是它们当中的大部分的机能目前还是未知的。

阐明这些突变的机制对研制治疗该病的药物至关重要。

UNC-45分子伴侣蛋白被发现对肌球蛋白的折叠和积累非常必须，比如厚丝状物的组装和肌肉的功能。

UNC-45B蛋白的转化，事实上仅仅可以用来解释脊椎动物，该蛋白与UNC-45B在氨基酸排布顺序上有44%的相似性并且主要表达在心肌和骨骼肌。

最近，UNC-45B在心脏肌球蛋白的稳定性、肌纤维的心肌收缩功能以及心肌疾病的预防上发挥的重要作用被人们所揭示。

而后者是最为常见的人类或者动物的遗传疾病，也是年轻运动员猝死的一个最主要原因。

扩张的心肌病变与UNC-45B的缺乏相联系，并且在肌球蛋白拆卸的实验中被模仿出来，从而表明UNC-45在对心肌疾病的治疗中可能会是一种药物的靶标。

此外，最近UNC-45在乳腺癌肿瘤的增长的过程中发挥的至关重要的作用被人们揭示出来。

由于被观察到在肿瘤细胞中过度表达，约四倍于正常细胞，所以该蛋白在乳腺癌的治疗中可能是一个靶点。

许多肌球蛋白的化学结构X光衍射已经完成。

分子伴娘蛋白与UNC-45/CRO1/She4p(UCS)偶联领域的原子构成最近已经获得两种，即真菌She4p和果蝇UNC-45。

这种偶联的酵母肌球蛋白的抗原决定基，例如Myo3p和Myo4p被定为出来并且锁定在肌球蛋白头部的羧基端区域，但是UNC-45抗原表位却没有被指定。

然而，据悉肌球蛋白偶联在UNC-45的UCS领域。

此外，大部分实验鉴定得出的发生在秀丽隐杆线虫和裂殖酵母上从而影响UCS蛋白功能作为重要调节肌球蛋白活性的突变在UCS领域上被鉴定出来。

UNC-45可以偶联分子伴侣Hsp90和肌球蛋白的事实已经被报道出来。

偶联通过不同种类的领域并且Hsp90在对于UNC-45专属性上具有抑制作用该专属性是指UNC-45直接偶联在肌球蛋白的头部。

UNC-45以这种方式控制着肌球蛋白和肌动蛋白的相互作用，这是因为它与肌球蛋白头部的偶联对体外高效的肌动蛋白偶联非常的重要。

在这之前，与肌球蛋白相互作用的She4p已经在所有的五种酵母的肌球蛋白被绘制出。

She4p的MYo4p相互作用区域已经被报道可以掩盖残基531-631。

此外，更加完美的该相互作用的机制图也已经完成绘制，并且一个包含27-残基的长Myo4p区域也被提出。

这个区域是高度守恒的，不仅是对于所有的五种酵母肌球蛋白而且对于被鉴定的肌球蛋白亚种也同样适用，这其中包括人类的心脏肌球蛋白。

这种Myo4p与UCS区域偶联大概是将近1μM的亲和力。

整个肌球蛋白-UNC-45B复合物的数据显示出一个明显的1.3μM的Kd值，从而证明UNC-45B与肌球蛋白的马达领域存在强烈的相互作用，其中该复合物最近可以通过多种实验技术获得。

更加深入的研究发现，肌球蛋白的偶联位点已经通过不同于上面提到过的技术方法得到改善，总结出马达领域的SH1和SH2片段可能直接或者间接的参与在UNC-45B的相互作用里。

然而，需要注意的是UCS的不同功能已经被提议或假设出来。

这种蛋白第一次作为肌球蛋白折叠的分子伴侣被描述出来。

随后的研究表明UCS被用在保护肌球蛋白防讲解上，并且能够加强肌球蛋白到肌动蛋白微丝的马达领域的偶联。

在这项研究当中，我们以X光数据分析为基础，提出了UNC-45B的UCS二聚体连接两个肌球蛋白马达领域并且因此肌球蛋白与肌动蛋白微丝的步长作为其中之一的决定因素发挥功能作用。

事实上后者确实需要UNC-45-肌球蛋白复合物的形成。

因此，UNC-45-肌球蛋白复合物的原子模型就首要的需要来回答几个重要的问题：（1）这种UNC-45特异性的UCS偶联位点在哪儿，它是怎么样和肌球蛋白发生相互作用的？（2）在这些相互作用里面它们是种间差异吗？（3）假如是表型的心脏病的肌球蛋白突变体，那么UNC-45B偶联是怎样改进的？并且如何反应在肌球蛋白-肌动蛋白的偶联上？为了回答这些问题，对于这件事上我们把精力集中在对野生型的复合物特征进行模型化，通过各种硅片方法。

我们的目标是在原子水平上获得上述这种复合物的分子框架结构。

我们的研究结果表明复合物的形成的稳定性主要依靠类似于表明接触的静电作用来支撑，这很像肌球蛋白和肌动蛋白的复合物。

我们也获得了肌球蛋白偶联决定簇的非常重要的种间差异，并且提出了基于MYH7外显子15-16肥大性心脏病突变的分子模型。

材料和方法同源建模，蛋白分子的准备和静电潜在的运算人类UNC-45B的同源模型和心脏肌球蛋白的马达领域被创建并且经MOE软件经行了很好的修整。

仅仅MYH7的马达领域被模仿了。

对于肌球蛋白，我们用小鸡的肌球蛋白S1和枪乌贼的结晶结构作为模板，这是由于它们与人类的MYH7有很高的顺序相似性（75%）。

UNC-45B偶联肌球蛋白的同时还和ATP偶联，这样我们也包括用菌属肌球蛋白分子来模拟人类肌球蛋白同源模型额ATP酶循环阶段。

对人类UNC-45B同源模型，果蝇的相关分子结构（PDB ID：3NOW）已经被应用。

此外，输出模型的侧链得到很好的改良。

所有的设定都是依据他们的默认值。

Loop-U（571-575 in 2MYS）遗失残基的坐标直接从X光衍射分子3I5F转运，这一变化对UNC-45B-肌球蛋白复合物的形成至关重要，已经解决的在2MYS 中的Loop-U部分具有完全相同的构型。

由此，我们就可以期待一个相似的同样在MYH7中的构造并且这在后来也得到了MYH7分子结构X光衍射的证实。

呈现在2MYS环区域中的其他差异最初被模拟是基于菌类的肌球蛋白分子结构（PDB ID：2JHR），该结构是少数已经被解决了的肌球蛋白结构。

残基205-215和627-646从2MYS中遗失，而且这些环被重新创建和改良。

Loop-U仅仅可能参与在UNC-45B复合物的形成过程中。

所有肌球蛋白其他的环远离偶联的抗原表位，并且它们的构象因而不太可能有太多影响。

最后，UNC-45B和MYH7结构被50ns-long NPT分子动力学（MD）模拟很好的改良，这主要是通过琥珀11包并且应用了琥珀99SB推进领域。

缩短了的八面体盒使TIP3水分子的10 埃缓冲溶剂化并且抗衡离子中和了该系统。

静电力被APBS软件通过默认的参数得到计算。

接触表面区域的衡量基于溶剂可接近的表面（SASA），后者通过VMD软件运用“measure sasa”程序来计算。

Sasa-参数半径被设定在1.4个埃。

氢键、疏水键和离子作用在最小平均结构得到验证，这一过程超过10ns的分子动力学模拟（被命名为模型1，详细请查看支持信息的S5图和表S2），主要通过应用蛋白相互作用计算器来完成。

偶联团抗原表位的预测ICM ODA网络服务已经被用来预测UNC-45B偶联抗原表位，主要通过ODA（最优的基本区域）方法，并结合了APBS计算。

计算的结果是可以通过ICM浏览器得到帮助。

ODA 是在蛋白表面预测蛋白-蛋白相互作用位点的一种方式。

它可以通过最低的对接去溶剂能值预测最佳的面片作为原子溶解参数的计算，这主要衍生于正辛醇和水的转化实验以及调整蛋白-蛋白分子对接来完成。

这种预测器已经检测了66非纯质的游离结构并且这种经过鉴定的相互作用点正确率达到了80%。

偶联位点的识别MOE的位点搜寻工具被用来做肌球蛋白UNC-45复合物的偶联包鉴定。

该工具使用凸面镜的方法使产物包不变的进行原子旋转。

通过三角测量以及用球状物连接每一个结果单体来处理三维的位点。

球的半径与与位点凸面的壳是成比例的。

每一个球以亲水疏水与否进行分类，主要依据球是不是好受体的HB位点。

亲水的球与疏水球互不接近并且由于回应水的结合位点而得到分离。

产生的包包括一个或者更多的开始的球，并且至少一个是疏水的。

默认的设置被应用。

蛋白-蛋白对接原始的UNC-45B到HYH7的方向是通过HEX6.3对接软件获得的。

蛋白-蛋白分子对接运用HADDOCK网络服务来施行，这里用的是默认设定。

重要的Loop-U大小和构造的种间差异被认为对UNC-45B偶联到人类心脏肌球蛋白非常重要，我们没有能够从X光衍射果蝇结构中获得帮助。

事实上，我们通过同源模型运用MYH7结构生成对接方式。

除此之外，一个非常新的研究表明计算的偶联自由能没有能够显示与这些获得的X衍射结构任何有意义的不同。

在符合残基MYH7的631-672基础上，对酵母的肌球蛋白Myo4p上，我们用实验的侦测肌球蛋白偶联抗原表位。

通过ODA方法获得的氨基酸残基被认为最有可能参与在蛋白-蛋白分子相互作用中。

Loop-M和螺旋18-19的残基被选择作为UNC-45B的偶联抗原表位。

剩余的氨基酸残基包含在周围非相互作用的残基族里面。

一个HADDOCk分通过改良以能排列每个对接阶段的结构。

它是一个加权的分子间静电力的总值，范德华力，BSA，去溶剂化和AIR能：刚体分数=1.0×Elec + 1.0×v大W –0.05×BSA + 1.0×Dsolv + 1.0×AIR，最终分数=1.0×Elec + 1.0×vdW + 1.0×Dsolv + 1.0×AIR。

AIR术语在这里代表所谓的模糊的相互作用力限制，被用来驱使对接步骤。

一个AIR被定义为所有的参与在相互作用中的氨基酸残基之间模糊的距离。

作为最顶部的十个群集的输出，每一个都包含十个对接方案。

它们最终被获得并且最低能级的聚类被分选开来。

分子动力学分子动力学和自由能的分子力学泊松一玻尔兹曼/表面自由能(MMPBSA)进行计算使用琥珀11套程序和Amber99SB力场。

这种ATP分子，Mg2+离子和五个水分子存在于核苷酸的内部。

通常采用参数和A TP分子的指控。

作为输入结构，我们使用那些通过对接分析和提炼，如上所述50 ns-long NPT MD模拟。

一维度为12°的水分子的截断八面体框在每个方向和抗衡离子上添加，从而获取最后的将近24000个原子组成的溶剂化系统。

最初，这系统被最小化位10000步。

此外，模拟退火过程应用于确定肌凝蛋白吉布斯表位和loop-M UNC-45B。

蛋白质的其余的部分是被一个常数为5 kcal/mol/A。

的力的限制。

在NVT系统中我们运行20多个独立的MD模拟，它将已选择的蛋白质区域用20 ns和50 ns加热到600 K 和800 K。