实验1 大肠杆菌的分离和培养

（1） 培养细菌用的培养基与培养皿 （2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管 （3） 实验操作者的双手
（1）（2）需要灭菌；（3）需要消毒。
五、大肠杆菌的培养和分离实验操作
（一）培养基的配置与灭菌
取2个250ml的三角瓶中分别装入50mlLB
液体培养基和50mlLB固体培养基（刚配好，
尚未凝固），加上封口膜，牛皮纸包装后高压
每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线 结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线 时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末 端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时 菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。
划线结束灼烧接种环，能及时杀死接种环上 残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
2.在进行第二次以及其后的划线操作时，为什 么总是从上一次划线的末端开始划线？
注意事项:
1.接种环只蘸一次菌液，但要在培养基不同位 置连续划线多次。
2.划线首尾不能相接。 3.划线后，培养皿倒置培养12~24h。
1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前 都要灼ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ接种环？在划线操作结束时，仍然需 要灼烧接种环吗？为什么？
操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环 上可能存在的微生物污染培养物；
不能使用脱 脂棉，否则 容易吸水， 造成污染。
5、将试 管口通过 火焰，并 塞上棉塞。
6、左手将皿盖打开一条缝隙，右手 将沾有菌种的接种环迅速伸入平板 内，划三至五条平等线，盖上皿盖。 注意不要划破培养基。
一旦划破，会造成划线不均匀，难以达 到分离单菌落的目的； 二是存留在划破处的单个细胞无法形成 规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长， 会形成一个条状的菌落。
• 自养菌:
光能自养型:光合细菌
化能自养型:硝化细菌,铁细菌,硫细菌
• 异养菌:
腐生菌
寄生菌
大部分病原菌
大肠杆菌属于异养兼性厌氧菌
细菌的革兰氏染色
革兰氏染色法是一种用于细菌的染 色法。此法将细菌分为两类，即革兰 氏阳性菌和革兰氏阴性菌。所谓革兰 氏阳性菌就是用革兰氏染液染色后， 再用脱色液处理，细菌仍保留染色液 的颜色；革兰氏阴性菌则相反。这两 种菌的差别在于细胞壁的成分不同。
大肠杆菌属于革兰氏阴性菌
二、细菌的培养基
培养基（培养液）是由人工方法配制 而成的，专供微生物生长繁殖使用的混 合营养液。
1.培养基的类型 液体培养基：扩增细菌、工业生产 固体培养基：纯化（分离），鉴定、保藏菌种。
成分区别：琼脂
2.培养基内所含的基本物质 (1)水 (2)碳源 (3)氮源 (4)无机盐
4、等待平板冷却凝固后，将 平板倒过来放置，使皿盖在 下，皿底在上。
1.培养基灭菌后，需要冷却到60℃左右时，才能 用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？
可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的 温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。
2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
锅灭菌15min。
封口膜：既通气 又不使菌进入
LB液体培养基——细菌的扩大培养
LB固体培养基——细菌的划线分离
（二）倒平板 1、将灭过菌的培养皿放在火焰 旁的桌面上，右手拿装有培养基 的锥形瓶，左手拔出棉塞。
2、右手拿锥形瓶，使瓶口迅速 通过火焰。
3、用左手的拇指和食指将培 养皿打开一条的缝隙，右手 将锥形瓶中的培养基（约1020mL）倒入培养皿，左手立 即盖上培养皿的皿盖。
琼脂 1g 水:50ml
三、菌落
• 单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖 时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定 形态结构的子细胞群体，叫做菌落。
• 菌落是鉴定菌种的重要依据。
四、消毒与灭菌
1、消毒：
利用化学或物理方法，杀死大部分致病微生物 的过程。
消毒的常用方法：
（1）煮沸消毒法：100℃煮沸5-6min； （2）化学药剂消毒法：用75%酒精等进行
注意事项: 1.火焰旁从斜面上用接种环取菌； 2.取菌前接种环要用酒精灯灼烧灭菌，
冷却后方能取菌； 3.取菌后封口膜和棉塞复原。
（四）大肠杆菌的划线分离
1、划线分离法
平板划线的操作
1、将接种环放在 火焰上灼烧，直 到接种环烧红。
2、在火焰旁冷却接种环， 并打开棉塞。
3、将试管口通 过火焰。
4、将已冷却 的接种环伸入 菌液中，沾取 菌液。
皮肤消毒；氯气消毒水源； （3）紫外线消毒； ……
2、灭菌：
以化学或物理方法消灭所有微生物，达到完全无 菌的过程。
灭菌的常用方法： （1）灼烧灭菌
（2）干热灭菌：160-170℃下加热1-2h。
（3）高压蒸气灭菌： 100kPa、121℃下维持 15-30min.
以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如 果需要，请选择合适的方法。
3.培养基内所需的其他条件
(1)pH值 如:培养霉菌需酸性、培养细菌需中性或微碱性 (2)温度 如：霉菌、细菌培养的最适温度不同 (3)氧气的含量 如:培养厌氧微生物时需要提供无氧的条件
4.不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方
细菌喜荤，霉菌喜素
大肠杆菌配方： 酵母提取物 0.5g 蛋白胨 0.5g Nacl 0.5g
3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？ 平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养 基表面的湿度也比较大，将平板倒置，既可以使 培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖 上的水珠落入培养基，造成污染。
（三）大肠杆菌的扩大培养
将斜面上培养的大肠杆菌菌种接 种到灭菌后的液体培养基中，使 其在37℃摇床培养12小时。
7、灼烧接种环，待 其冷却后，从第一 区域划线的末端开 始往第二区域划线。 重复以上操作，在 三、四、五区域内 划线。注意不要将 最后一区的划线与 第一区相连。
8、将平板倒 置，放入培养 箱中培养。
分离后，一个菌 体便会形成一个 菌落，这是消除 污染杂菌的通用 方法，也是用于 筛选菌株的最简 便方法之一。
一、微生物种类
结构简单，个体微小，通常要用光学显微镜或 电子显微镜才能看到。 包括病毒、细菌、放线菌、真菌、原生动物等。
细菌的常识
1、结构 2、分裂 3、生殖 4、变异类型 5、在基因工程中的应用
大肠杆菌
细菌的外形与大小
大肠杆菌属于杆状菌
细菌的营养类型
• 根据细菌所利用的能源和碳源的不同 将细菌分为两大营养类型。