碳纳米管的生物相容性_齐宁宁

碳纳米管的生物相容性
齐宁宁,杜丽娜,金义光
(军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京　100850)
摘要:碳纳米管(CNT )是一种非常有序、高纵横比的碳同素异形体,包括单壁碳纳米管(S WCNT )
和多壁碳纳米管(MWCNT )。

它的特性使其在生物医学领域得到广泛应用,包括生物传感器、药物和疫苗传递,以及特殊生物材料的制备。

本文总结了现有碳生物材料性能,概述了纳米毒理学研究内容,探讨了CNT 细胞毒性和生物相容性。

关键词:碳纳米管;生物相互作用;细胞毒性中图分类号:R94　文献标识码:A 文章编号:100120971(2007)022*******　收稿日期:2006210220
　作者简介:齐宁宁,女,在读硕士研究生,研究方向:药物新剂型与新技术。

Tel:010*********,E 2mail:ningning_qi@1631com
1　引言
碳纳米管(carbon nanotubes,CNT )是一种独特的一维大分子。

单壁碳纳米管(S WCNT )由单层石墨(直径014～2n m )构成,而多壁碳纳米管(MWCNT )由直径2～100n m 的多个同心石墨圆柱体组成。

它们抗张强度高,质量极轻,热和化学稳定性很高,并有金属导体和半导体电学性质。

生物医学材料和设备是CNT 研究的一个主要领域,包括生物传感器、药物和疫苗运输载体,以及新型生物材料。

CNT 作为现有聚合物材料的纳米填充剂,可显著提高机械性能,并能形成高度各向异性纳米复合物。

CNT 用于现有和新型生物医学设备前,应全面
考察其毒性和生物相容性。

生物相容性是指材料在发挥作用时只引起宿主的适度反应。

热解碳用于生物医学移植和涂层材料已几十年,特别是在心瓣膜修复术方面。

早期研究表明热解碳心瓣膜血液相容性良好,可很好粘附于内皮细胞,对血小板的粘附和活化作用很小。

然而一项有420名患者参与的临床研究发现,热解碳涂层支架的效果并不比传统高级不锈钢支架好。

类钻石碳(DLC )早期体外生物相容性研究表明对巨噬细胞无炎性反应,也未观察到对成纤维细胞和成骨细胞的毒性。

几项有关DLC 涂层的体内实验表明,DLC 涂布的不锈钢金属植入棒对绵羊骨和肌肉组织无副作用。

微粒毒理学研究组织(肺、消化道或皮肤)暴露
于微粒环境中的不良反应。

纳米毒理学产生于对纳
米粒子和纤维毒理学评价的迫切需要,可定义为研究工程纳米机械和纳米结构与活生物体相互作用的科学。

普遍认为有3个因素决定粒子是否造成伤害,包括(1)粒子表面积/质量比:表面积大使粒子与细胞膜接触面大,吸收和转运毒性物质可能性大;(2)粒子滞留时间:与细胞膜接触时间越长,损伤概率越大;(3)粒子所含化学物质的反应性及固有毒性。

纤维材料与粒子的病理学表现不同,特别是呼吸道暴露远比其他摄入方式更易致病。

3个主要特点决定吸入性纤维致病,包括(1)纤维尺寸:决定可吸入性(穿透进入肺中心腺泡区的能力);(2)生物滞留性:是特长纤维毒理的关键因素,它们通常不易被巨噬细胞吞噬;(3)反应性或固有毒性:同粒子一样,纤维毒性也主要取决于其化学成分毒性。

2　碳纳米管的毒性
围绕CNT 材料应用的热点问题之一是对参与其生产和处理的工人的未知影响。

本节将详细介绍肺毒性、皮肤刺激和细胞毒性方面的研究。

211　肺毒性
尽管CNT 没有肺毒性前兆,但最近组织学研究发现有肺部炎症和肉芽肿形成。

2001年Huczko 等最早考察了未纯化CNT 对豚鼠肺功能的影响。

将25mg CNT 的015mL 盐溶液给豚鼠气管滴注,对照组接受25mg 不含CNT 的炭黑。

滴注4周后用非侵入法考察肺功能。

非侵入法和支气管肺泡灌洗测试均显示受试组与对照组无差别。

结论是在含有CNT 的炭黑环境中工作,可能不存在任何健康
威胁。

La m等考察了3批S WCNT的肺毒性(包括铁催化H iPco合成的未纯化和纯化样品,以及电弧放电合成的含镍未纯化S WCNT),并与炭黑和石英粒子对照。

用分散于50μL小鼠血清中的0,011,015 mg样品对小鼠气管滴注,在第7或90天处死,组织学检查,其中金属性杂质影响可忽略。

3批S WCNT 产品均导致以间歇性肉芽肿为特征的剂量依赖型肺损伤。

尽管含镍S WCNT致死率较高,但CNT的存在导致了肉芽肿形成。

该研究还表明S WCNT毒性大于炭黑,含镍CNT比石英毒性大。

W arheit等通过气管滴注考察了大鼠的S WCNT 肺毒性。

将8周龄雄性大鼠给予1或5mg・kg-1未纯化S WCNT,石英(作为阳性对照),羰基铁粒子(作为阴性对照),石墨粒子(与S WCNT的镍/钴比例相同)和磷酸盐缓冲液。

滴注后24h、1周、1个月和3个月,受试大鼠用BAL流动标记、细胞增殖实验和组织病理学评价。

5mg・kg-1组致死率大约15%,但后又证明是上呼吸道机械阻塞引起的窒息所致,而不是S WCNT固有毒性原因。

细胞增殖和细胞毒性指数表明,暴露于S WCNT仅产生暂时性炎症,组织学检查证明一系列非剂量依赖性多点肉芽肿形成。

Huczko等将5种MWCNT由气管滴入豚鼠,90 d后用BAL标记、肺拮抗测定和组织学检查考察,得到肺毒性有力证据。

暴露时间是诱导肺病变的关键因素。

Muller考察了气管滴注MWCNT对大鼠肺功能的影响。

动物暴露于015,2,5mg的纯和细的MWCNT,60d检查发现剂量依赖性炎症和肉芽肿形成,且炎症不是暂时的,而是持续了60d。

MWCNT 和细MWCNT比炭黑更易引起炎症,但弱于石棉纤维。

Shvedova等考察了小鼠咽部吸入S WCNT的影响,发现S WCNT暴露(10,20,40μg/只动物)1～3d 后炎症标记物呈剂量依赖性增加,且在60d后肉芽肿形成,渐进性间隙纤维化,肺泡壁增厚。

咽部吸入(将50μL S WCNT液滴放在舌后至雾化)会形成两种形态粒子。

一种是压缩的S WCNT聚集体(直径>500n m)在沉积部位形成急性炎症和肉芽肿;另一种分散的S WCNT结构(直径<50nm)在远离沉积部位处产生弥散性间歇纤维化和肺泡壁增厚,但没有持续局部炎症。

分散的气溶胶状S WCNT造成纤维化的结果表明,S WCNT暴露会对工人健康带来显著危险。

212　皮肤刺激
目前关于CNT皮肤刺激性的研究十分有限。

有40名过敏体质的志愿者暴露于试验贴剂(浸满未纯化CNT水混悬液的滤纸)96h;4只大耳白家兔用未纯化CNT水混悬液进行改良D raize家兔眼实验,暴露72h。

与烟灰对照组相比,两项实验都没有刺激性。

结论是处理这些碳纳米材料无需特殊防护。

213　碳纳米管细胞毒性
Shvedova等考察了未纯化CNT对永生化人表皮角质细胞(HaCaT)的影响,后者在含未纯化CNT (60～240mg・L-1)的介质中培养18h。

接触S WCNT导致氧化应激加速、细胞活力丧失和细胞结构形态改变。

这些结果由未纯化S WCNT中高水平铁催化剂引起。

另一项研究发现,MWCNT诱导人表皮角化细胞(HEK)产生刺激反应。

纯化MWCNT (100～400mg・L-1)和HEK共培养48h后发现,前者分布在细胞内,引起前炎症细胞因子(I L28)释放,细胞活力也随时间和剂量减小。

Muller等用S D 大鼠腹腔巨噬细胞与含纯化和纯化细MWCNT的介质(20,50,100mg・L-1)共培养24h,发现细MWCNT诱导剂量依赖细胞毒和T NF2α上调的能力与石棉和炭黑相近,而未磨细MWCNT此效应明显低。

J ia等考察了不同碳纳米材料对肺泡巨噬细胞的毒性。

将肺泡巨噬细胞给予S WCNT,MWCNT和C60fullerenes6h,S WCNT引起最大的细胞毒性反应,虽然S WCNT和MWCNT都能减弱细胞活力和吞噬功能。

令人困惑的是S WCNT及MWCNT与阳性对照组石英比较,对细胞活力的负面影响更大。

Cui 等发现S WCNT通过诱导凋亡和降低细胞粘附力对人胚胎肾细胞(HEK293)产生抑制。

Ta mura等简单考察了纯化CNT对人中性粒细胞的毒性,发现纯化CNT与细胞接触1h后明显提高了超氧阴离子和T NF2α水平,同时细胞活力明显降低。

3　碳纳米管的生物相容性
本节详细论述了CNT类材料与神经细胞、成骨细胞、成纤维细胞、抗体与免疫系统、离子通道及细胞膜之间的相互作用。

311　与神经细胞的作用
CNT独特的电学性质促进了CNT在神经应用
(尤其神经突增长)方面的生物相容性研究。

McK2 enzie等研究了改变碳纳米纤维(CNF)直径和表面能对星形胶质细胞增殖和功能的影响,发现星形胶质细胞易于在大直径和高表面能CNF上粘附和增殖。

直径<100n m的CNF由于能减少神经瘢痕组织形成,有神经应用潜力。

W ebster等考察了一系列聚氨酯(P U)/CNF纳米复合物与星形胶质细胞的相互作用。

神经细胞接种实验表明,提高纳米复合物中CNF载量,能降低星形胶质细胞粘附性,延缓大鼠嗜铬细胞瘤细胞的神经突增长。

312　与成骨细胞的作用
Elias等将成骨细胞接种到4种紧密型CNF上,考察增殖和功能,发现纳米级CNF促进细胞增殖。

与大于100n m的CNF比较,小粒径CNF增加了碱性磷酸酶活性、细胞内蛋白合成和细胞外钙沉积。

Price等发现与大粒径CNF相比,纳米级CNF可促进成骨细胞粘附,而成纤维细胞、软骨细胞和平滑肌细胞在高能CNF上粘附性降低,且不受粒径影响。

增加CNF在P U/CNF纳米复合材料中的浓度可增强成骨细胞粘附,减少成纤维细胞粘附。

CNF没有显示任何细胞毒性,可作为整形外科材料。

Sup r o2 nowicz等制备了导电聚乳酸(P LA)/MWCNT(分别含10%,15%和20%w/w MWCNT)纳米复合物。

成骨细胞接种到其表面上然后电流交互刺激,对照样品(P LA/MWCNT纳米膜)没有电流刺激。

结果表明与对照组相比,成骨细胞增殖和细胞外钙在纳米复合物上沉积均增加。

313　碳纳米管的纳米结构表面
Correa2Duarte等研究了受控MWCNT表面结构对L929小鼠成纤维细胞粘附性和增殖的影响,发现细胞表面形态依赖于阵列MWCNT的长度而呈蜂巢状多边形或金字塔状。

小鼠成纤维细胞被接种到不同表面上培养7d。

1d后SE M显示仍呈独立细胞态,7d后细胞层连续,均未发现细胞毒性。

受控CNT表面结构被用于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的非遗传基因修饰,CHO细胞在直立排列碳纳米纤维(VACNF)上通过离心和挤压被刺穿,未发现细胞毒反应,结论是试图通过与CNT接触获得质粒DNA 的细胞可能已经在此过程中被足够破坏而死亡。

314　抗体相互作用
一项2001年的研究考察了C
60
特异性单克隆抗体与S WCNT的结合,表明抗体可结合到水性S WCNT束上。

Naguib等证实单克隆抗体与CNT结合受纤维亲水性和不规则表面的影响。

吸附在CNT上的聚赖氨酸也能增强抗体和蛋白结合。

这些研究表明,生产包裹抗体S WCNT细胞探针及药物传递工具是可行的。

315　离子通道相互作用
Park等发现S WCNT阻断了EXP22,K VS21,人KCNQ1,Kv412和HERG钾通道,且呈剂量依赖性。

fullerenes阻断通道效应弱于CNT,作者推测该机制仅与纳米粒子的大小和形状有关。

316　碳纳米管作为药物和疫苗的传递工具
CNT的功能化研究用于解决CNT在水溶液中的不溶问题。

很多时候可将生物活性肽和药物结合到CNT侧面。

有两项研究采用功能性S WCNT建立了疫苗传递装置。

通过1,32位环加成,将口蹄疫病毒(F MDV)的一小段肽序列连接到纯化S WCNT侧壁。

两项研究均证实肽序列构型保持并被单克隆和多克隆抗体识别,且S WCNT2F MDV肽复合物诱发了体内特异性抗体反应。

体内对S WCNT无交叉反应性(即免疫响应)。

因此CNT可用于疫苗传递。

Pantar ott o等研究了功能化S WCNT跨过人3T6细胞膜及鼠3T3细胞膜的易位,证明可以跨过细胞膜易位,因此S WCNT可用于药物传递。

Ka m等发现S WCNT和S WCNT2链亲和素偶合物通过内吞途径进入人早幼粒细胞白血病细胞和人T细胞,单纯S WCNT没有细胞毒性,而S WCNT2链亲和素偶合物可造成独立细胞死亡,原因是链亲和素被传递进细胞。

Cherukuri等通过近红外荧光显微镜考察了单纯S WCNT被小鼠J77411A巨噬细胞摄取情况,发现巨噬细胞可吞噬S WC NT,速度是1个S WC NT・s-1,且没有明显细胞毒性。

S WCNT保持荧光状态,说明巨噬细胞在此期间没有破坏S WCNT。

4　分散:普遍性问题
考察CNT毒性和生物相容性反复遇到的一个主要问题是CNT易聚集成大的束或绳状。

分子量大且管间作用力(范德华力和静电力)强促使CNT 束和绳形成,所以大量独立CNT分子的操控和性质考察很困难。

实际上许多毒性与生物相容性数据不符就是由CNT分散状态的差异造成。

许多应用要求CNT在各种溶剂中分散,所以有许多提高CNT 溶解性的研究。

比较成功且常用的方法有超声、表面活性剂稳定和共价修饰。

超声是使CNT聚集物分散在溶液中的常用方
法,因为它可快速分散CNT,并且不需化学修饰。

它主要包括水浴超声和探头超声。

超声频率决定泡最大粒径,频率升高则泡径减小。

一般水浴超声的频率较大(40～50kHz),且无明显气穴区;而探头超声的频率约为25kHz,且有锥形气泡核心区。

只有高极性有机溶剂如N,N2二甲基甲酰胺与水浴超声或探头超声结合,才能形成未纯化CNT的稳定分散系。

有机合成表面活性剂常被用于提高CNT的水溶液溶解度。

十二烷基硫酸钠(S DS)和Trit on X2 100是两种最常见的表面活性剂。

许多研究也将聚醚(p lur onic)类表面活性剂用在某些生物分子如DNA、糖和多肽中。

CNT化学功能化修饰是增加溶解度的又一常用方法。

典型的是将适宜分子如多肽、酸、氨基酸、聚合物和聚赖氨酸与CNT侧壁共价连接。

最常用方法是纯化后CNT羧基进行酰胺化或酯化,或1,32环加成。

在生物医学应用方面,因为药物或疫苗传递研究中未发现CNT特异性细胞毒性,所以CNT 化学功能化修饰或生物分子吸附是最有前景的分散方法。

吸入研究中也存在分散问题。

CNT肺毒性评价最好采用粒径分布范围。

但将细CNT粒子释放到空气中需要巨大能量和搅动,限制了研究。

5　今后研究方向
为建立CNT毒性和生物相容性标准,需重视: (1)肺毒性研究,包括对雾化CNT粒径分布和CNT 粒子可吸入性研究;(2)皮肤刺激,CNT对皮肤细胞毒性和CNT吸收进入皮肤的难易度至关重要;(3)巨噬细胞响应,巨噬细胞对CNT材料的抵抗作用以及巨噬细胞吞噬和消化CNT将为阐明致炎原因提供线索;(4)CNT性质对细胞毒性的影响,生产和纯化方法不同使CNT材料组成变化很大,对其毒性的影响尚未确定;(5)体内吸收分布消除,尽管CNT作为药物传递载体具有明显潜力,但尚没有CNT在体内迁移或聚集的研究;(6)化学功能对生物相容性CNT的影响,与未修饰或未纯化纳米管相比,现有数据说明功能化CNT用于药物或疫苗传递具有较小毒性。

6　结语———碳纳米管安全吗?
CNT具有特殊的化学和电学性质。

已有数据证明未纯化CNT在体内和体外均有一定毒性,可能由于金属催化剂的短暂存在。

高浓度、未纯化CNT 在体内和体外显示出最小细胞毒性,而用于提高药物传递的化学功能化CNT未显示毒性。

最为重要的是,CNT技术的成功应用依赖于对CNT及CNT 相关材料毒理学的持续研究。

(上接第142页)
病人可常规给予NS A I D加PP I或COX22抑制剂。

但是,最近数据显示,两种治疗方案对这种高危险病人都不能足够预防溃疡并发症。

在一项前瞻性双盲试验中,近期使用NS A I D引起溃疡出血的287名病人随机设计为塞来昔布(200 mg,bid)+奥美拉唑安慰剂;或双氯芬酸(75mg, bid)+奥美拉唑(20mg,sid),给药6个月,每组中大约5%的病人复发溃疡出血。

在6个月时,所有可评价病人的连续内窥镜检查发现,大约20%的病人复发溃疡。

结果表明,昔布类或NS A I D加PP I并不能充分保护高度危险病人的溃疡复发。

但是,近期的研究表明,PP I能减少选择性COX22抑制剂或者非选择性NS A I D的一般风险病人的镜检溃疡的发生。

COX22抑制剂和PP I合用可能对胃提供最好的保护,虽然这种方法需要在以后的实验中进一步证实。

5　结语
目前对需要抗炎治疗的病人的处理方法建议如下:对无心血管风险因子的病人,可按照胃肠道风险分级制定分级处理方案;在无任何胃肠道风险因子的病人使用传统的NS A I D。

有胃肠道风险因子的病人选择NS A I D加PP I或COX22抑制剂;对有多种消化道风险因子或上消化道出血病史的高度危险病人,最好的方法是COX22抑制剂加PP I。

相反,有明显心血管风险因子需要低剂量阿司匹林预防的病人可以用NS A I D加PP I,不管有还是无消化道风险因子,NS A I D加阿司匹林会严重增加上消化道出血。

总而言之,不论是NS A I D还是COX22抑制剂,在有高度消化道风险和心血管风险的病人中应避免使用。