正负离子表面活性剂与高聚物混合双水相体系的相行为及蛋白质的分配_肖进新

Vol.22高等学校化学学报　No.1　2001年1月 CHEM ICAL JOU RNAL OF C HINESE UNIVERSITIES 112～114　正负离子表面活性剂与高聚物混合双水相体系的相行为及蛋白质的分配肖进新　暴艳霞　方　磊(北京大学化学与分子工程学院,北京100871)摘要　报道了由正负离子表面活性剂与高聚物混合溶液形成的一种可用于蛋白质的分离及分析的新型双水相萃取体系.研究了正负离子表面活性剂(溴化十二烷基三乙铵/十二烷基硫酸钠)分别与葡聚糖和聚乙二醇混合双水相体系的形成规律、相行为及牛血清蛋白和溶菌酶在双水相体系中的分配.通过在高聚物分子中接上亲和配基,研究蛋白质在双水相体系中的亲和分配.结果表明,在该体系中,表面活性剂与高聚物分别富集于不同相中.升高温度及加入无机盐均可促进双水相体系的形成,不同蛋白质可分配于不同的相中.亲和配基的引入极大地增强了蛋白质分配的选择性.关键词　双水相;蛋白质分配;正负离子表面活性剂中图分类号　O647.1 文献标识码　A 文章编号　0251-0790(2001)01-0112-03双水相体系(Aqueous tw o-phase systems,简称AT PS)是指某些物质的水溶液在一定条件下自发分离形成的两个互不相溶的水相[1].由于其两相都是水溶液,可作为萃取体系用于生物活性物质的萃取分离及分析.我们[2,3]曾报道了正、负离子表面活性剂双水相体系用于蛋白质的分离.当正、负离子表面活性剂与某些水溶性高聚物混合时,也可形成双水相体系.该类双水相体系可望结合高聚物双水相与正负离子表面活性剂双水相体系的优点,作为新的萃取体系,可用于生物活性物质的分离及分析.本文报道了正、负离子表面活性剂(溴化十二烷基三乙铵/十二烷基硫酸钠)与高聚物(葡聚糖、聚乙二醇)混合双水相体系的形成、相行为及牛血清蛋白和溶菌酶在双水相体系中的分配以及血红蛋白在亲和双水相体系中的亲和分配.1　实验部分1.1　试 剂十二烷基硫酸钠(C12H25SO4Na,SDS,FLUKA公司)经乙醇/水混合溶剂重结晶.溴化十二烷基三乙铵[C12H25N(C2H5)3Br,C12NE]由溴代十二烷和三乙胺反应制得,其方法参见文献[3].SDS及C12NE 均未发现表面张力最低点,说明无其它高表面活性杂质.所用高聚物聚乙二醇(分子量40000)及葡聚糖(分子量5000000),均为PHAMARCIA公司产品.带有亲和配基的高聚物PEG-IDA-Cu(IDA为im inodiacetate)的合成参照文献[4].牛血清蛋白(不含脂肪酸,BSA)购于Sig ma公司,溶菌酶(lysozyme,Boehringer公司)从蛋清中提取.水由去离子水加高锰酸钾重蒸,其余试剂均为分析纯.1.2　实验方法1.2.1　双水相体系的制备及各组份浓度的确定　不同物质按表1—表3所示的比例混合,于恒温水浴中放置24h以上,用肉眼观察相分离.表面活性剂双水相形成的判断标准:(1)各相无浑浊或沉淀;(2)两相间存在清晰的界面.表面活性剂的总浓度用表面张力方法测定[3],葡聚糖的浓度用旋光法测定[1,5].聚乙二醇浓度由折光率法测定[1,5].收稿日期:2000-01-21.基金项目:国家自然科学基金(批准号:29973002,29733110)资助.联系人简介:肖进新(1963年出生),男,博士,副教授,从事表面活性剂物理化学研究.E-mail:xiaojx@ch 1.2.2　两相中蛋白质浓度、分配系数及表面张力的测定　在UV -Vis 光谱中测定K =280nm 处的吸收,确定BSA 和溶菌酶浓度;测定K =409nm 处的吸收,确定血红蛋白浓度.蛋白质分配用分配系数K (K =c t /c b ,c t 和c b 分别是上下两相被分离蛋白质的平衡浓度[1])表示.由滴体积法测定表面张力[5].2　结果与讨论2.1　双水相体系的形成及相行为2.1.1　双水相体系的组成　表1为双水相体系中两相的组成.表面活性剂浓度c total (C 12NE-SDS)=0.075mol /L (以C 12NE 与SDS 的总浓度表示).n (C 12NE )/n (SDS )=1.85/1,w (高聚物)=3%.由表1可见,表面活性剂与高聚物分别富集于不同相中.Table 1　Two -phases compositions and partitioning coeff icient of ATPS at 20℃*AT PST op phase Bottom ph ase S urfactant Polymer Surfactant Polymer K BSA K lys C 12NE -SDS /Dextran0.170.750.002 4.8 4.80.63C 12NE -SDS /PEG 0.160.630.004 5.1 5.50.52 *Compositi on of AT PS used for partitioning of proteins :c tota l (C 12NE -SDS )=0.075mol /L ,n (C 12NE )/n (SDS )= 1.90/1;w (PE G)=5%,w (Dextran)=5%;0.01mol/L NaH 2PO 4-Na 2HPO 4(pH=7.1)2.1.2　高聚物浓度对双水相体系的影响　在正负离子表面活性剂双水相体系中加入高聚物后,由于其体系粘度增加,导致相分离时间增加,而相体积比则随高聚物的加入而下降(表2).Tabl e 2　Eff ect of PEG and Dextran concentration on phase separation time and phase volume ratio of ATPS (20℃)*w (PE G)(%)t /min V to p /V bo ttom 00.7(0.7)* 1.56(1.56)1 3.3(2.6) 1.13(0.92)w (PEG)(%)t /min V top /V bo tto m 3 5.6(4.2)0.81(0.75)58.2(7.5)0.43(0.21) *T he values in th e parentheses are the data of Dextran ;c total (C 12NE-SDS )=0.075mol/L,m (C 12NE)/m (SDS )=1.85/1.2.1.3　温度及无机盐对双水相体系相行为的影响　由20～50℃下双水相的相行为(表3)可见,升温有利于双水相的形成,即原来不分相的体系,在温度提高后有可能分相,同时相分离速度随温度的升高而加快,而相体积比则随温度的升高而降低.研究温度对C 12NE-SDS 与聚乙二醇双水相体系的影响(表3)表明,对C 12NE-SDS 与聚葡糖双水相体系,温度的改变亦有相似的变化规律.Table 3　Ef fect of temperature and c (NaCl )on phase separation timeand phase volume ratio of ATPS (C 12NE -SDS /PEG )*t /℃20304050c (NaCl)/(mol ・L -1)00.010.050.1t /minNo phase 7.8 5.2 1.3t /min No phase 6.2 4.5 1.1V to p /V bottom Separati on 0.520.430.32V top /V bo tto m Separation 1.20.830.38 *Composition of ATPS:c total (C 12NE -SDS )=0.075mol/L;n (C 12NE )/n (S DS)=1.95/1;w (PEG)=5%.加入无机盐对双水相体系的影响与升温相似(表3),亦有利于双水相的形成,即无机盐的加入不仅提高了相分离速度,也可使一些原来不分相的体系分相,并可降低相体积比.对C 12NE -SDS 与聚葡糖双水相体系,加入无机盐亦有相似的变化规律.2.2　蛋白质在双水相体系中的分配及亲和分配BSA 和溶菌酶在不同双水相体系中的分配系数见表1.在双水相体系中,以Na 2HPO 4-NaH 2PO 4为缓冲溶液,调节Na 2HPO 4和NaH 2PO 4的比例,维持溶液的pH 为7.1.由分配系数可知,不同蛋白质富集于不同的相中,牛血清白蛋白富集于上相,而溶菌酶则富集于下相.IDA-Cu 对蛋白质表面的酪氨酸(Histidine)有特殊的亲和作用.将其接在聚乙二醇上,加入正负离子表面活性剂与聚乙二醇共组双水相体系中,则带有亲和配基的聚乙二醇出现在双水相的下相(聚乙二醇富集相).由此可对具有较多表面酪氨酸的蛋白质如血红蛋白进行亲和分配.当亲和配基浓度分别为0,0.1,0.3,0.4,0.7,0.9mol /L 时,血红蛋白在正负离子表面活性剂与聚乙二醇共组双水相体系中的分配系数分别为9.3, 2.2, 1.1,0.7,0.7,0.7.表明亲和配基的引入可使血红蛋白由上相113N o .1肖进新等:正负离子表面活性剂与高聚物混合双水相体系的相行为及蛋白质的分配 (未加亲和配基)转移到下相.通常认为,由于不同种类高聚物具有不相容性,即不同高聚物形成的空间结构不能相互渗透而导致分相[1].前文[3]提到,在正负离子表面活性剂双水相中,一相为表面活性剂富集相,另一相表面活性剂浓度很低.富含表面活性剂相呈现絮凝胶团,絮凝胶团组成的三维网状立体结构中含有大量的水,当加入高聚物后,表面活性剂的絮凝胶团与高聚物的空间结构不能相互渗透而导致分相,使表面活性剂与高聚物分别富集于不同相中.由此可解释正负离子表面活性剂与高聚物混合双水相的形成.对于表面活性剂富集相,相的体积由絮凝胶团组成的网状结构所结合的水的体积决定.当升温时,胶团表面的水化层被削弱,加入无机盐则压缩了胶团表面的双电层,两种因素均导致絮凝胶团组成的网状结构结合水的能力下降.由此可解释升温和加入无机盐对双水相相体积比的影响.在pH=7.1时,BSA 带负电(其表面静电荷为-18),溶菌酶带正电(其表面静电荷为+7)[1].由于双水相体系中阳离子表面活性剂(C 12NE)过量,因此表面活性剂胶团带正电.由此可解释BSA 和溶菌酶在不同相中的富集现象.与单一高聚物双水相和正负离子表面活性剂双水相体系相比,表面活性剂与高聚物混合双水相体系可结合二者的优点.高聚物双水相体系的缺点是不适于非水溶性蛋白质的分离.正负离子表面活性剂双水相体系的缺点是不易在表面活性剂浓度很低的一相中固定亲和配基.对表面活性剂与高聚物混合双水相体系,可望通过表面活性剂溶液的加溶作用使其用于非水溶性蛋白质的分离,由于表面活性剂与高聚物分别富集于不同的相中,可望在表面活性剂与高聚物上分别接亲和配基而进行亲和分配.参　考　文　献　1　Albertsson P .A ..Partition of Cell Particl es and M acromolecules [M ],3rd Ed .,New York :W iley -Interscience ,1986　2　Xiao J .X .,Zhao G .X .,Chinese J .Chem .[J ],1994,12(6):555—556　3　Zhao G.X.,Xiao J.X.,J.Colloid Interf.Sci.[J ],1996,177:513—518　4　Otto A.,Birkenmeier G..J.Chromatogr.[J],1993,644:25—31　5　Sivars U.,Bergfeldet K.,Piculel l L.et al ..J.Chromatogr.B[J],1996,680:43—49　6　ZhAO Guo -Xi (赵国玺),Physical Chemistry of Surfactants ,2rd Ed .(表面活性剂物理化学,下册)[M ],Beijing :Peking UniversityPress ,1991Phase Behavior and Protein Partitioning in Aqueous Two -phase SystemsFormed by Mixtures of Polymer and C ationic -anionic SurfactantsXIAO Jin-Xin *,BAO Yan-Xia,FANG Lei(College of Chemistr y and M olecular Engineer ing ,Peking Univer sity ,Beij ing 100871,China )Abstract A novel aqueous tw o-phase system can be formed by the mixtures of a polymer and cationic-anionic surfactants.Such a system can be used as a partitioning system of proteins.In this w ork,w e investig ated the formation ,phase behavior and protein partitioning in aqueous tw o -phase sy stems formed by dodecyltriethylammonium brom ide /sodium dodecylsulfate /PEG and dodecyltriethylamm onium bromide/sodium dodecylsulfate/dextran.The ligands w ith affinity w ere attached to the polymers and the affinity partitioning of proteins w as investigated.It w as show n that the surfactants and polym ers are enriched in different phases of aqueous tw o -phase systems .Phase separation are promoted by increasing temperature and adding inorg anic salts.Different proteins are partitioned in different phases.The selectivity of protein partitioning is increased by adding ligands w ith affinity.Keywords Aqueous tw o -phases ;Protein partitioning ;Cationic -anionic surfactants(Ed .:Y ,V ,X )114 高等学校化学学报V ol .22。