第十一讲 人类基因组学(1)

KCNQ1 Gain-of-Function Mutation in Familial Atrial Fibrillation
Yi-Han Chen, Shi-Jie Xu, Said Bendahhou, XiaoLiang Wang.etc Science, 299: 251, 2003
代表性工作：
第三代遗传标记：单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP) 1996年由Lander提出，与RFLP、STR 不同，不 再以长度差异作检测标志，直接以序列变异为标 记，可用非电泳技术直接检测。估计人类基因组 中大约1Kb就有一个SNP，总计约3百万个，其中 20万个位于编码区称cSNP(coding SNP)。
有一个SNP，已成为研究基因组多样性和识别、定
位疾病相关基因的主要手段。
第一代遗传标记：限制性片段长度多态性（RFLP），1980 年由Botstein提出，原理是DNA序列的改变，甚至于单个核苷酸 的改变可能引起某个限制性内切酶切点的丢失或产生，导致酶 切片段长度的变化，可用常规的琼脂糖凝胶电泳检出。
（二）功能克隆
（Functional cloning) 通过基因产物蛋白质和mRNA入手克 隆基因的策略。现多采用比较两种研究 对象mRNA表达差异来筛选治病基因。 常用手段有基因芯片，差异显示 PCR，基于PCR的消减杂交等。
例：差异显示RT-PCR
(Differential display RT-PCR)
说明人类较之其它哺乳动物对嗅觉的依赖
程度降低了。
3、重复而致混乱
尽管重复能够增加基因数目，但它同样 也带来了麻烦。在精子和卵子的产生过程中 ，一对同源染色体的交换（重组的过程）产 生后代性状的重组，可能表现为疾病，如由 于这样重复重组造成了 22 号染色体存在缺失 ，导致 DiGeorge 综合症，表现为除免疫功能 缺陷外还有主动脉瓣缺失、心脏发育不全等 混乱状态。

们的相对距离，单位为cM（centimorgan,厘摩）：即每 次减数分裂的重组率为1%来表示。
绘制遗传连锁图所需标志有：
① 限制性酶切片段长度多态性（RFLP） ② 短串联重复序列（ short tandem repeat ， STR ）又称微卫星（ microsatellite ， MS ）主要是二 核苷酸重复序列，如(CA)n ③ 单 核 苷 酸 多 态 性 （ single nucleotide polymorphism ， SNP ）为第三代多态性标志。染色 体分布与信息含量优于前两者，每 1000 碱基即可
酵 母 人 工 染 色 体 （ yeast artificial chromosome ， YAC ） YAC-STS 覆 盖 全 基 因 组 不 可 少 于 1500 个 克 隆 3×109/2×106（YAC插入片段长度） 细菌人工染色体（ Bacterial artificial chromosome ，BAC） BAC-STS覆盖全基因组不可少于15000个克隆
EST(expressed sequence tag）表达序列标签： 代表基因一部分，由cDNA通过通用引物测序获得的几百个 核苷酸（300-500bp）的序列。
EST→ STS EST→ 全长cDNA
3、序列图: 将待测 BAC 随机切成小片段（约 1.5-2kb ），再装 入测序载体，测序后进行组装。 完成图是指全基因组的DNA序列全部测定、连接完 毕，准确率99.99%以上。
Dentinogenesis imperfecta 1 with or without progressive hearing loss is associated with distinct mutations in DSPP
Shangxi Xiao, Chuan Yu.etc Nature Genetics, 27: 201, 2001
4、通过糖化等化学修饰使 一个基因产生多个蛋白质
由此可见，人类基因并不全是在脊椎 动物中发现的新类型，事实上，在已确定 的蛋白质或功能域中只有 7% 真正是脊椎动 物所特有的。因此提示：低等模式生物在 人类基因功能和疾病研究中的可用性。
三、基因分布不均衡
1、重复序列
在基因组进化过程中约有 5% 的序列
是通过大片段(>10,000个碱基)在染色体内 和染色体间重复复制得到的。重复使一个 基因拷贝定位于一个新位置，在新的位置 上其功能可以与原来完全不同。
2、重复区
可能对人类基因家族的扩充具有重要意
义。如基因组中散布着大约 1,000 个嗅觉基
因，负责大多数哺乳动物的嗅觉，在人类
，其中大约有 60%是没有功能的假基因。也
例:基于EST数据库的新基因克隆策略
已知基因的cDNA序列 ↓blast NCBI的EST数据库 ↓ 感兴趣的EST ↓EST拼接 Contig ↓重复拼接 不能再延伸的Contig ↓设计引物 PCR ↓ 测序 ↓ 新基因
三种克隆策略的评价
定位候选克隆可直接确定致病基因或易 感主基因。 DD-PCR方法繁琐，假阳性较多。 电子克隆方法简单，但致病基因与疾病 关系不明确。
指令DNA结构。
第一节 致病基因的克隆
1、定位候选克隆
2、功能克隆
3、电子克隆
（一）定位候选克隆
（Positional candidate cloning)
将致病基因以连锁分析方法基本定位 后，通过数据库查出该定位区段内的所 有基因，并从中选择有关基因进行基因 突变检测，从而确定致病基因。
代表性工作：
第二章 疾病的基因组学
遗传变异与疾病
基因组序列中产生的变化创造了物种的多样 性，也为物种提升了适应环境的能力。但是，遗 传变异是一把双刃剑，给人类带来的不利表现为
疾病。多数变异来自于个别核苷酸的置换，被称
为单核苷酸多态性（SNP）。而SNP是否有害，取
决于 SNP 所占据的位置是否影响了编码蛋白质的
第十一讲 人类基因组学（1）
第一章 人类基因组
基因组是一个生命体遗传信息的总和
人类24条染色体，32亿bp，31,000基因
第一节 人类基因组的复杂性
一、复杂性不在于基因数目 二、复杂性依赖于
1、可移接程序（剪接），同一 个基因能产生不止一个蛋白分子
2、基因部分区段的重排， 构成新的组合
3、控制基因所激的时间、 部位、方式——调控区基因
、Mb）为单位的标志间的物理距离所展示的染色
体图。
核苷酸顺序图（精细）
染色体组型图（粗略） 序列标签部位（sequence tagged site，STS）图
⑴ STS ： 染色体定位明确，可用 PCR 扩增的单拷
贝序列。在染色体上每隔一定距离就有一个 STS 的
结构标识图，是最适用的物理图。为了便于测序 或序列分析，在 STS 的基础上，再构建能够覆盖每 条染色体的大片段DNA克隆，包括
衡量在一个群体中某个遗传标记为杂合的个体频率称为标记所能 提供的多态信息量。PIC（polymorphism information content）
PIC=1 - Pi - 2Pi
2 i 1
i 1 j i 1
n
n 1
n
2
Pj 2
2、物理图（physical map）
以特异的DNA序列为标志，以碱基对（bp、Kb
步骤：
疾病家系的选择→选择微卫星标记，基因 扫描→连锁分析计算Lods值→确定候选区 域→候选基因突变检测
连锁分析的基本程序：
收集家系材料
明确临床诊断
采集DNA样品 分析遗传模式和遗 传标记的基因型
进行染色体区域 内的物理定位和 基因突变检测
在连锁图上 定位相关基因
人类基因组物理图谱在人类基因， 特别是疾病基因克隆研究中的应用
→ cDNA →PCR →凝胶电泳→差异 片段再一次PCR →Ngenebank对比是否为新基因
mRNA
（三）电子克隆
（Electronic cloning) 基于Internet生物信息数据库和生 物学软件克隆新基因的策略。
4、Y染色体
由于 Y 染色体短了一截，失去了与 X 染色 体在重组过程中的片段交换能力，结果其上 的很多并非必不可少的基因由于积累了很多 的突变，导致要么被关闭，要么丢失了。只 剩下维持雄性竞争优势的一些基因。为了确 保这些雄性特有基因不丢失，其中一个重要 方式就是重复（数目的安全性）并集中在大 段的重复区内。如与睾丸发育和精子产生有 关的基因就分布于此区域。
第二节 人类基因组可识标记及作图
3.2×109bp/24 条染色体，这么大个基因组无法直 接测序，只能通过将分解为一个个小的结构区域，再进 行测序分析，这一分解过程简称为作图（ mapping ）。
根据使用的标志和手段不同，作图可分为：
1、遗传连锁图（genetic linkage map）
通过计算连锁的遗传标志之间的重组频率，确定它
缺点：可提供的多态信息量低，引物形成的内切酶切点仅能出 现“能切”与“不能切”两种情况。
第二代遗传标记VNTR及STR 优点：1、多态信息量高，同一位点重复单位变化数目大， 可能有多达几十个等位基因。 2、可采用重复序列两侧单拷贝DNA设计引物，作 PCR，检测可实现自动化。 现已建立6000多个STR为主体的连锁图，平均分辨率达0.7cM。 详细内容见贺林主编《解码生命》
Lods值计算：
P（家系,θ 值从0～0.5） PR= ——————— P（家系, θ为0.5） lgP( θ ) Z(Lods)= —————— lgP(0.5)
Z>1 支持连锁，Z>3 确定连锁，Z<-2 否定连锁。
结果分析
Lods分析将致病基因定位在D11S1364 和D11S1346之间的19.6cM区间内。其中 的候选基因为KCNQ1，患者DNA序列分析 在第418位核苷酸处发现一个A→G的突 变。