固定化辣根过氧化物酶生物传感器测定火腿肠中亚硝酸盐

检测分析亚硝酸盐是肉类食品加工过程中常用的添加剂，可保持肉制品的色、香、味，但它又是一种潜在的致癌物质，过量食用会对人体造成危害。

国家对食品中亚硝酸盐含量有严格的限制，在肉制品卫生检疫中亚硝酸根残留量是常规和必测项目。

目前测定食品中亚硝酸盐的方法有色谱法、光度法、荧光法等，而电化学传感器因具有灵敏度高、专一性强以及良好的生物兼容性和结构简单等特点已用于亚硝酸盐的测定[1]。

本文利用循环伏安法在玻碳电极（GCE ）电聚合一层均匀的聚苯胺（PAN ）修饰膜，并将带负电的纳米TiO 2涂覆于PAN 修饰膜的表面，最后将HRP 用静电吸附的方法固定到修饰电极表面，制得新型固定化辣根过氧化物酶生物传感器；研究了该生物传感器的电化学性质，并将其应用于火腿肠中NaNO 2的测定，取得满意效果。

1材料与方法1.1仪器与试剂RST-3000电化学工作站：苏州瑞斯特仪器有限公司；KQ-100E 型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；AUY220型电子分析天平：岛津公司；PHS-25型数显酸度计：上海雷磁仪器厂。

苯胺、过氧化氢（30%）：洛阳市化学试剂厂；辣根过氧化物酶（HRP ，250U/mg ）：sigma ，洛阳市化学试剂厂）。

其他试剂均为分析纯；试验用水为去离子水。

电化学测量采用三电极：玻碳电极（直径3.0mm ）为工作电极；甘汞电极为参比电极；pt 片电极为对电极。

1.2纳米TiO 2的制备根据文献[2]制备纳米级二氧化钛粉末。

1.3固定化辣根过氧化物酶生物传感器的制备工作电极依次在3＃、4＃、5＃金相砂纸上打磨。

将打磨后的电极依次浸入1∶1的浓硝酸，无水乙醇，蒸馏水中分别超声处理3min 。

对电极进行活化处理：在固定化辣根过氧化物酶生物传感器测定火腿肠中亚硝酸盐展海军，马超越，白静（河南工业大学化学化工学院，河南郑州450001）摘要：制备以电子媒介体聚苯胺和纳米TiO 2固定辣根过氧化物酶（HRP ）的生物传感器，研究该传感器的电化学性质。

结果表明，该传感器对H 2O 2和NaNO 2都具有很好的电催化还原性。

在含有0.01mg/L ～100mol/L 的NaNO 2（pH=9）的磷酸盐缓冲溶液中，具有良好的线性相关性，其相关系数为0.9946，检出限为0.001mg/L 。

应用于火腿肠中亚硝酸盐的测定，回收率为94%~103%。

关键词：辣根过氧化物酶；亚硝酸盐；纳米二氧化钛Determination of Nitrite in Ham Saysauge by Immobilized Horseradish Peroxidase BiosensorZHAN Hai-jun ，MA Chao-yue ，BAI Jing（School o f Chemistry and Chemical Engineering ，Henan University of Technology ，Zhengzhou 450001，Henan ，China ）Abstract :The hydrogen peroxide biosensor has been prepared by immobilizing fixed horseradish peroxidase （HRP ），with polyaniline mediation and nano-TiO 2.The electrochemical performance of biosensor was studied.The results show that H 2O 2and NaNO 2have good catalytic reductive.The biosensor had a good linear relationship to NaNO 2（pH＝9）of phosphate buffer solution in the range 0.01mg/L-100mol/L ，the correlation coefficient was 0.9946,and the detection limit was 0.001mg/L.The biosensor was applied to determination of Nitrite in Ham Saysauge with satisfactory results,and the coefficient of recovery is 94%-103%.Key words :horseradish peroxidase;nitrite;nanometer titanium dioxide作者简介：展海军（1965—），男（汉），副教授，硕士，研究方向：分析化学，食品分析。

食品研究与开发F ood Research And Development2011年2月第32卷第2期123检测分析展海军，等：固定化辣根过氧化物酶生物传感器测定火腿肠中亚硝酸盐0.1mol/L 硫酸中采用同样的三电极体系进行扫描，活化电位为-0.9V ～1.1V ，速率为100mv/s ，扫描10圈。

将处理好的电极放入0.1mol/L 硫酸+0.1mol/L 苯胺溶液体系中，先在-1.0V~1.3V 电位区间引发5圈，再将电位控制在-0.8V~1.3V,以50mv/s 的速率聚合15圈。

将聚合好的电极用水冲洗净晾干后，取10μL 纳米TiO 2的悬浮溶液（0.1mg/L 乙醇溶液）涂覆到PAN 膜修饰电极上。

待晾干后将电极放入磷酸盐缓冲溶液（pH ＝6.8）中,在恒电位-0.6V 下还原30min ，用去离子水漂洗后，浸入含有HRP 酶的磷酸盐缓冲溶液（pH ＝6.8）中，浓度为0.1mg /mL ，恒电位0.6V ，氧化30min ，取出用去离子水冲洗，保存在4℃的PBS （pH=7.0）中备用。

1.4方法在优化试验条件下，将PAN/纳米TiO 2/HRP 修饰电极置于一定浓度范围的亚硝酸钠溶液中，以50mv/s 的速率，电位控制在-0.8V~0.2V ，用循环伏安法扫描。

找出还原峰电流与溶液浓度的线性相关性。

对市售的火腿肠样品按GB5009.33-2010《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》的方法进行前处理，测定得出其NaNO 2含量并与分光光度法进行比较。

2结果与讨论2.1固定化辣根过氧化物酶生物传感器的直接电化学性质将制备好的电极置于PBS 溶液（pH ＝6.8）中，在-0.8V~0.2V 的电位范围内，以50mv/s 的速度循环扫描（图1）。

发现苯胺聚合后在-0.8V~0.2V 出现了一对对称的氧化还原峰；曲线b 比曲线a 的响应电流增大，证明了纳米TiO 2增强了电极的导电性；曲线c 则证明PAN/纳米TiO 2膜具有良好的导电作用，还为HRP 的直接电子转移提供了良好的环境，显然增大的电流是HRP 血红素辅基中氧化还原中心Fe （Ⅲ）/Fe （Ⅱ）的氧化还原特征峰产生的。

在pH=6.8的PBS 溶液中，改变扫描速率，在40mv/s~140mv/s 范围内，阴、阳极峰电流均随扫速的增大而增大，且与扫速成线性关系（图2），线性方程与相关系数为：I pc =0.0975x +0.3349v,R =0.9974；I pa =-0.0349x -0.01512v,R=0.9952。

说明电化学反应为表面电化学过程而非扩散控制。

将酶修饰电极置于3.65×10-8mol/L ～3.65×10-4mol/L H 2O 2溶液（pH=6.8）中（图3），随H 2O 2浓度增加，还原电流逐渐增大，说明酶生物传感器对H 2O 2有良好的电催化还原作用。

在优化的试验条件下，测得H 2O 2的浓度在3.65×10-7mol/L ～3.65×10-4mol/L 范围内与其还原峰电流呈线性关系，线性回归方程y=-0.381x+9.2883,相关系数为r=0.9942。

检出限为3.65×10-8mol/L 。

2.2溶液pH 值的影响在pH=4.0～10.0的范围内,考察了酶修饰电极的还原峰电流对0.2mg/L NaNO 2的响应，见图4。

可知，在pH =4.0～9.0响应电流随着pH 值的增大而增大，是图1不同电极在磷酸盐缓冲溶液中（pH=6.8）Fig.1Cyclic volta mmograms of different sensor at PBS （pH=6.8）a.PAN 膜修饰电极；b.PAN/纳米TiO 2膜修饰电极；c.PAN/纳米TiO 2/HRP 修饰电极。

图2PAN/纳米TiO 2/HRP 酶生物传感器在不同扫速下的循环伏安图Fig.2Cyclic volta mmograms of sensor at different scan ratesv ：20,40,60,80,100,120,140mV/s （form a to f ）,0.025mol/L PBS(pH=6.8)。

图3在含不同浓度H 2O 2的磷酸盐缓冲溶液（pH=6.8）的循环伏安图Fig.3Cyclic voitammograms of different H 2O 2in PBS containing a.3.65×10-4mol/L ；b.3.65×10-5mol/L ；c.3.47×10-6mol/L ；d.3.47×10-7mol/L ；f.3.65×10-8mol/L。

电位：E/mV电流：1（1E -5A ）电位：E/mV电流：1（1E -5A ）电位：E/mV电流：1（1E -5A ）124检测分析因为亚硝酸钠在碱性条件下更稳定，且在辣根过氧化物酶的等电点范围内，对酶电极性能无影响。

所以选择pH=9的磷酸盐溶液为缓冲液。

2.3温度影响温度是影响酶催化反应和酶活性的一个重要因素,温度升高,酶催化反应速度增加,还原电流增大，但高温会使酶蛋白变性而失活，见图5。

由图5可知，溶液在10℃～60℃时酶活性逐渐增强，考虑到电极的使用寿命和实验测定的条件，所以本实验选择温度为25℃。

2.4对NaNO 2的电催化性能测定利用循环伏安法研究了PAN/纳米TiO 2/HRP 修饰电极对NaNO 2的催化还原性能进行了研究。

结果表明，还原电流与NaNO 2浓度（mg/L ）的自然对数值成线性关系。

线性范围为0.01mg/L~100mg/L ，线性方程为y=0.4252logx+7.6422,线性相关性为R=0.9946。

2.5干扰试验对样品中可能存在的部分干扰物质进行了试验，利用循环伏安法重考察了L-半胱氨酸、谷氨酸、抗坏血酸、柠檬酸、葡萄糖、氯化钠对PAN/纳米TiO 2/HRP 修饰电极检测NaNO 2的影响。