辣根过氧化物酶(HRP)标记蛋白的方法

HRP 的NaIO4标记法
一．原理：HRP为一种糖蛋白（glycoprotein），其所带的糖基上的糖环能被氧化开环，在2，3—位的—C—C—断开。

在适当的氧化条件下，2，3—位羟基能被氧化为醛基。

醛基在碱性条件下可与被标记物的自由氨基（—NH2）形成Shiff碱（—N=CH—），Shiff碱不稳定，可由逆反应解离。

Shiff碱可由还原剂还原成—CH2—NH—，在HRP与被标记物间形成稳定的共价交联。

HRP的NaIO4标记法所用氧化剂为NaIO4，还原剂采用NaBH4。

Note:
1.产物A不稳定，故用NaBH4还原为产物B。

2.HRP的氧化要适度，氧化不够不能产生足够量的醛基，如氧化过度，醛基可
被进一步氧化为羧基，同样也得不到够量的醛基。

可通过控制NaIO4的量或控
制氧化的时间来调节HRP糖基的氧化度。

当糖基的氧化度为20～25%时，有
较高的结合效率。

3.为了防止HRP的过度氧化，在整个标酶的过程中应尽量避光。

光照可加快过
碘酸钠对HRP糖基的氧化，如在标记过程中不避光，则不可控因素太多。

4.反应的最后一步用NaBH4来还原的反应比较剧烈，对酶活性的影响比较大。

有时可考虑在酶与糖基之间添加一个手臂，如联苯胺反应。

二．酶量的确定：被标记物在本实验室主要为抗原与抗体。

抗原与HRP的比值通常为摩尔比1：1。

而抗体与HRP的比值通常为质量比1.6：1。

当然，这只是一个基点，可根据需要上下调整比率。

统计本次标记所需酶的总量，设为x mg。

三．酶的氧化（全过程避光，操作中力防污染。

酶的终浓度为10mg/mL，总体积为x/10mL）
1.称取HRP x mg。

当HRP从-20℃取出后，一定要平衡到室温，否则HRP冻干品易潮
解。

称量时不要用称量纸，不要用工具取HRP，应将HRP直接小心地倒入要用来溶
解HRP的器具中。

在倒HRP时，不要在风口（如电风扇风，自然风，呼吸）操作，因为HRP冻干品质轻易飞扬；尽量不要说话，以防污染。

HRP尽量不要回倒，以防
污染。

当HRP量小于10 mg时，溶解器具可用干净Eppendoff tube，HRP量大于
10 mg时，则要求用体积稍大的小玻璃瓶。

2.加ddH2O（x/20-z）mL溶解（颜色为褐色）。

量小可用枪轻轻吹打溶解，量大可用
搅拌子适速搅拌溶解。

注意不要太剧烈，不要起泡沫，否则HRP易失活。

3.称取x mg NaIO4，加ddH2O x/20 mL溶解（一个原则为NaIO4的量应大于x mg，可
先配制成20 mg/mL，取适当体积来使用）。

4.往HRP溶液中逐滴加入NaIO4溶液，边加边搅拌。

5.将混合好的溶液置于4℃，静置20 min（颜色为绿色）。

6.取x μL乙二醇溶于z mL DDW中，逐滴加入上述混合溶液中，边加边搅拌，z值
尽量小，大约为总体积的1/20。

7.室温静置20min（颜色应回复为最初的褐色）。

8.酶氧化过程完成，HRP终浓度为10mg/mL。

Note:
在酶的活化的过程中，注意NaIO4的浓度，不可太高，氧化时间不能太长，z值尽量的小，活化后的酶要马上使用。

活化酶所用的溶解水应为Ulterpure water。

四．待标记蛋白的准备及标记（避光。

防污染）
1.样品的处理：蛋白浓度选择最佳浓度（抗体一般要求5mg/mL 左右，抗原一般要
求1mg/mL左右，蛋白浓度过低可用PEG20000浓缩）。

2.用pH9.6左右的50mM CB（1×CB）透析去甘油或杂质（如Tris），换液视情况而定。

如样品中含有SDS，应在室温下透析去SDS。

（HRP活化的时间应掌握好，以便能与此步接上。

一个原则是不能让氧化好的HRP
等样品的处理，应HRP一氧化好就可进行此步。

）
3.将蛋白（抗原或抗体）与HRP按所需比例混合，于50mM pH9.5 CB中透析6小时
以上，头两个小时换液一次。

4.用新鲜配置的NaBH4溶液终止，NaBH4量为0.2x mg。

摇匀，4℃静置2小时，每半
小时摇一次，NaBH4溶液加入的量要合适。

（NaBH4溶液浓度自定，一个原则是加
到透析袋的体积是一个合适的体积。

袋子满，所能容纳的体积小，NaBH4可配浓一
点，反之亦然。

）
5.用pH8.0的20mM TBS或pH7.2的10mM PBS透析过夜。

应换液多次，尽量除去NaBH4
（NaBH4可影响酶联试剂的热稳定性）。

如受条件限制，一次也可。

Note:
拿捏透析袋应戴手套。

五．成品酶的保存：
加等量的甘油，混匀后-20℃保存。

六．附录：
附录1：（标酶过程所用Buffer）
TBS为Tris-HCl等渗缓冲液，PBS为磷酸盐等渗缓冲液，CB为碳酸盐缓冲液。

10×（pH8.0 20mM）TBS的配制：
20×（pH9.6 50mM）CB的配制：
20×（pH7.0 10mM）PBS的配制：
Na2HPO4·12H2O 43.7g NaH2PO4·2H2O 12.16g
NaCl 170g 加水至 1000mL。

1.酶的氧化（避光）：
称取HRP 2.4mg，加ddH2O 100μL；
称取NaIO4 5.4mg，加ddH2O 270μL；
取NaIO4溶液120μL缓慢加入到HRP溶液中；
4℃避光放置30min；
取2.4μL乙二醇，加入20μL ddH2O，混匀，加到HRP溶液中；
室温静置30min；
酶的氧化过程完成，总体积为240μL，浓度为10mg/mL。

2.抗原的标记：
抗原蛋白已于前一天用50mM CB透析完成；
在抗原溶液中分别加入10mg/mL的HRP 100μL（HIV-Env9），25μL（梅毒4717），50μL（梅毒4715）；
50mM CB透析6小时以上，头两个小时换液一次；
称取NaBH44.6mg，加入ddH2O 460μL，浓度为10mg/mL，分别加入到标酶溶液中20μL（HIV-Env9），5μL（梅毒4717），10μL（梅毒4715），摇匀，4℃静置2小时，每半小时摇一次；
用pH8.0的20mM TBS透析过夜，其中换液三次即可。

从透析袋中取出样品，加等体积甘油混匀，-20℃保存。

附录3：（用夹子夹透析袋的方法）
在夹夹子时应排尽袋子里的气泡，如有气泡则袋子易浮于Buffer上，透析效果不好，并有生物活性原料易失活等弊端。