HRP(辣根过氧化物酶)标记抗体的方法
辣根过氧化物酶标记抗体原理
辣根过氧化物酶标记抗体原理一、辣根过氧化物酶标记抗体的原理辣根过氧化物酶（HRP）是一种常用的酶标记物，具有很高的灵敏度和稳定性。
辣根过氧化物酶标记抗体原理主要是利用辣根过氧化物酶与抗体的特异性结合，通过其催化能力来检测目标分子的存在并定量分析。
辣根过氧化物酶标记抗体的制备过程主要分为两个步骤：辣根过氧化物酶的活化和抗体的标记。
1. 辣根过氧化物酶的活化辣根过氧化物酶通常以干燥粉末的形式存在，需要在一定条件下进行活化。
活化的过程中，辣根过氧化物酶会与过氧化氢发生反应，形成活性中间体。
这个活性中间体具有较强的催化能力，可以催化底物的氧化反应。
2. 抗体的标记在活化的辣根过氧化物酶中，将目标抗体与其特异性结合。
这个过程中，通常使用交联剂来进行共价结合，使得辣根过氧化物酶与抗体牢固地结合在一起。
这样就得到了辣根过氧化物酶标记抗体。
二、辣根过氧化物酶标记抗体的应用辣根过氧化物酶标记抗体在生命科学研究中具有广泛的应用价值，主要体现在以下几个方面：1. 免疫组化辣根过氧化物酶标记抗体可以用于免疫组化实验，通过与目标抗原的特异性结合，可以在组织切片中精确地定位抗原的存在位置。
辣根过氧化物酶的催化反应会产生可见的颜色，从而可以直观地观察到抗原的分布情况。
2. 免疫印迹辣根过氧化物酶标记抗体也可以用于免疫印迹实验，通过与目标蛋白的结合，可以检测目标蛋白的存在和表达水平。
辣根过氧化物酶的催化反应会产生发光信号或者颜色变化，从而可以定量地测量目标蛋白的数量。
3. 免疫荧光辣根过氧化物酶标记抗体还可以用于免疫荧光实验，通过与目标抗原的结合，可以在细胞或组织中观察到荧光信号。
这种方法可以用来研究细胞的定位、蛋白的相互作用等重要生物学过程。
4. 免疫流式细胞术辣根过氧化物酶标记抗体也可以应用于免疫流式细胞术，通过与目标抗原的结合，可以实现对细胞表面抗原的定量和检测。
通过流式细胞仪的高通量检测，可以同时分析大量细胞的抗原表达情况，为研究细胞免疫学提供了重要手段。
HRP标记
●产品简介※ Galaxybio 公司研发的活化HRP，对优质辣根过氧化物酶次序偶联，再活化，使辣根酶富含活性基团。
一经活化的HRP，极易和含氨基NH2的小分子或蛋白氨基NH2的共价结合。
因此使用本方法标记物，具有标记率高、活性好、本底低及非常敏感等特点。
敏感性一般是传统过碘酸法标记3~5倍。
微量包装的活化HRP，特别适合科研用的昂贵抗体的标记。
也适合抗体抗原活性的检测。
※一步标记，简便快速。
与待记抗原或抗体混合后（约12个小时过夜标记或37℃2小时。
）※可以微量标记，节省昂贵的抗原抗体※无需透析，即时使用；※标记率极高，可大于95%；敏感性一般是传统过碘酸法标记3~5倍。
※本试剂盒针对氨基进行标记，故只对含有氨基的分子。
可以进行抗原或其他蛋白的标记。
小分子的标记，如瘦肉精、DNA、多肽等等，标记时，如要提高HRP的利用率，可以加入过量的小分子，然后透析除去游离的小分子；如果要即时使用，参考蛋白抗原的标记，减少小分子的用量，从而减少游离的小分子。
※本底远远低于其它方法。
●注意事项：1. 抗原抗体如果是存在于硫酸铵、甘氨酸或Tris缓冲液中，需以PBS缓冲液充分透析，也可以超滤离心管进行超滤；微量的含NH2 的小分子，会严重影响标记率。
2. 反应体系一般100μl～300ul /1mgHRP；太小，可能发生自身交联；也不要太大，太大会影响标记率。
3. REAGENT Ⅲ 终止液，封闭残余活化基团。
4. 注意反应 pH值约维持在9.5左右。
pH值太低，多加反应启动剂。
5.特别提醒，是后续试验中，酶标板条种类不同，本底差异特别大。
当本底高时，以较高浓度蛋白溶液封闭的酶标板，同时把酶标稀释液的蛋白浓度加大。
如果问题依旧存在，请联系我们技术咨询。
6 本试剂仅用于科学研究；●操作步骤：以1mg活化HRP，标记抗体为例（反应体系根据HRP的mg数相应增加）1. 准备待标记物：以蒸馏水或超纯水把待标记物溶解成约1mg/ml。
hrp酶标记抗体原理
hrp酶标记抗体原理HRP酶标记抗体原理引言：酶标记抗体技术是一种常用的实验方法，用于检测和定量分析特定蛋白质或分子在生物样品中的存在量。
其中，HRP酶标记抗体是一种常用的酶标记抗体，其原理是将辣根过氧化物酶（HRP）与抗体结合，通过HRP催化底物反应，形成可见色素或发光信号，从而实现对目标分子的检测和定量。
一、HRP酶标记抗体的制备为了制备HRP酶标记抗体，首先需要纯化目标抗体。
通常采用免疫动物（如小鼠、兔子等）免疫目标抗原，然后从免疫动物的血清中提取目标抗体。
接下来，将提取的抗体与HRP酶进行化学共价结合，形成HRP酶标记抗体。
这种结合通常利用活化的巯基化合物（如二硫苯酚）与抗体上的游离巯基反应，将HRP酶与抗体的巯基共价连接。
二、HRP酶标记抗体的工作原理HRP酶标记抗体的工作原理是基于HRP酶的催化作用。
HRP是一种含铁的酶，具有较高的催化活性。
当HRP酶标记抗体与目标分子结合后，可以通过HRP酶的催化作用，将底物转化为可见色素或发光信号。
具体实验过程如下：1. 抗原与HRP酶标记抗体结合：将待检测的抗原与HRP酶标记抗体一起孵育，使它们发生特异性结合，形成抗原-HRP酶标记抗体复合物。
2. 清洗步骤：通过洗涤步骤去除未结合的抗原和HRP酶标记抗体，以减少背景信号。
3. 底物添加：向样品中加入相应的底物。
底物的选择取决于所使用的HRP酶标记抗体和检测目标。
4. HRP催化反应：HRP酶通过催化底物反应，产生可见色素或发光信号。
底物的催化反应产生的信号与待检测的目标分子的存在量成正比。
5. 信号检测：使用适当的检测设备，如酶标仪或荧光仪，对产生的可见色素或发光信号进行定量测量。
三、HRP酶标记抗体的应用HRP酶标记抗体广泛应用于免疫组织化学、酶联免疫吸附实验（ELISA）、免疫印迹（Western blot）等实验中。
通过HRP酶标记抗体的催化作用，可以实现对特定蛋白质的定量分析和定位分析。
HRP标记抗体原理及方法(戊二醛二步法和过碘酸钠法)
HRP标记抗体原理及方法（戊二醛二步法和过碘酸钠法）酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA 等。
酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。
酶标记物中最常用的是酶标记抗体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。
酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。
目前，高质量的酶(如辣根过氧化物酶，简称HRP)国内已有商品供应。
高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。
在制备方法上，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。
(一) 酶制剂及其底物凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用。
但作为标记抗体用的酶应满足下列要求：(1)来源方便，易于纯化；(2)比活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能用简单方法测定。
目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶(AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。
由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。
HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。
HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。
酶溶于水和58％以下饱和度硫酸铵溶液。
HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm／OD275nm的比值RZ(德文ReinheitZahl)表示酶的纯度。
高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。
RZ值越小，非酶蛋白就越多。
值得注意的是，纯度并不表示酶活性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。
HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。
供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。
hrp标记二抗的显色原理
hrp标记二抗的显色原理
HRP（Horseradish Peroxidase，辣根过氧化物酶）标记二抗是一种被广泛用于免疫
染色的技术。
该技术是一种非常敏感的技术，能够快速准确的检测和定位细胞的特定抗原。
它的基本原理是利用多氧化物酶HRP的特定特性配合荧光物质和碘醛来染色检测抗原，具
体的检测过程如下：
首先，把HRP标记的抗体和抗原结合在一起，结合相应的抗原，无论是单链抗体还是
双链抗体，它们都能够与抗原结合形成特异性抗原抗体复合物，HRP标记抗体在此过程中
就充当特异性抗原抗体的角色。
接着，在抗原抗体复合物的反应中添加一种叫做TMB的化学物质，此时HRP标记的抗
体就会利用原子氧做过氧化反应，产生了装着三价碘原子的化合物，即碘醛。
碘醛与TMB
发生反应，溶解发生发蓝色，最终形成显色物质，就可以对抗原进行检测出来。
HRP标记二抗的显色原理是基于HRP标记抗体发挥结合特异性反应，以及HRP多氧化
活性，HRP标记抗体结合到目标抗原所产生的特异性抗原抗体复合物中，利用HRP的多氧
化特性加氧反应，将氧化现象应用到与其体外透明的TMB的溶液系统中，TMB与碘醛发生
反应，并生成特征的蓝色，形成蓝色沉淀，而这种蓝色沉积的大小就代表了物体存在的抗
原抗体的数量，因此我们就可以用这种来方法判断抗原的存在数量。
ELISA试验基本步骤及材料和试剂
ELISA试验基本步骤及材料和试剂下面将介绍ELISA试验的基本步骤以及所需的材料和试剂。
一、所需材料和试剂：1.微孔板：常用的有96孔板和384孔板。
2.吸液罐：用于储存洗涤缓冲液，洗涤吸液时使用。
3.移液管和移液器：用于分配试剂和液体。
5.吸管：用于混合试剂。
6.洗涤缓冲液：用于洗涤微孔板。
7.阻断缓冲液：用于阻断非特异性结合位点。
8.抗原或抗体：需要检测的物质。
9.辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体：将HRP与特异性抗体结合，用于检测特定抗原或抗体。
10.底物：通常使用的底物为TMB（3，3'，5，5'四甲基苯胺）。
11.停止液：用于停止底物的反应，通常是盐酸。
二、基本步骤：1.预处理微孔板：将所需用的孔板放入洗涤缓冲液中，轻轻浸泡几分钟，然后在洗涤缓冲液中彻底洗涤。
2.标记孔板：使用墨汁笔在孔板上标记样品的不同位置和信息，以便识别。
3.加入抗原或抗体：将待检测的抗原或抗体加入到相应的孔中，注意控制孔中液体的体积。
4.孵育反应：将孔板覆盖并在恒温箱或孵育箱中孵育一段时间，以使抗原或抗体与微孔板结合。
5.洗涤孔板：轻轻地将孔板上的液体倾倒掉，然后将洗涤缓冲液加入到孔中，摇晃孔板以充分洗涤。
6.加入HRP标记抗体：将HRP标记抗体加入到孔中，使其与已检测的抗原或抗体结合。
7.孵育反应：将孔板覆盖并继续在恒温箱或孵育箱中孵育一段时间，以使HRP标记抗体与已结合的抗原或抗体结合。
8.洗涤孔板：重复步骤5以去除未结合的HRP标记抗体。
9.加入底物：将底物加入到孔中，用于检测HRP的酶活性。
10.反应时间：将孔板暴露在黑暗条件下，让底物与HRP反应一段时间，产生颜色反应。
11.加入停止液：用停止液停止底物反应，并阻止进一步的颜色生成。
12.测量：使用酶标仪或光度计测量孔板中各孔的颜色强度，颜色的强度与抗原或抗体的浓度成正比。
以上是ELISA试验的基本步骤及所需的材料和试剂。
ELISA试验具有灵敏度高、准确性好、高通量等优点，因此被广泛应用于医学、生物学、农业等领域的疾病诊断、免疫学研究和生物药物分析等。
hrp偶联化合物
辣根过氧化物酶偶联化合物（HRP conjugates）是一种用于生物检测中信号放大和可视化的重要工具。
以下是关于HRP偶联化合物的一些详细信息：
1. 结构与功能：HRP是一种含有血红素的酶，可以从多年生草本植物辣根中提取。
它使用过氧化氢作为底物，能够催化各种有机和无机化合物进行氧化反应。
在生物检测中，HRP通常与抗体或其他分子结合，形成偶联物，以便通过酶的活性来检测特定的生物分子。
2. 应用范围：HRP偶联物可用于多种分析技术，包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫组织化学（IHC）、免疫细胞化学（ICC）、蛋白质印迹（Western blotting）以及DNA/RNA原位杂交等。
3. 信号放大：Poly-HRP偶联物每个分子包含大量HRP分子，可以在每次结合事件中提供更高的酶活性，从而实现在常规检测应用中的信号放大。
4. 可视化方法：HRP和Poly-HRP偶联物可以通过使用底物进行可视化。
当底物被HRP氧化时，会产生可量化的信号。
这些底物可以分为显色底物、荧光底物或化学发光底物，不同的底物适用于不同的检测需求和设备。
5. 标记技术：抗体可以通过不同的化学试剂交联到HRP上，形成HRP标记的抗体。
这种标记技术使得抗体能够在检测过程中被追踪和识别。
NaIO4氧化法是一种经典的抗体标记HRP 的方法。
综上所述，HRP偶联化合物在生物医学研究和临床诊断中扮演着重要角色，它们通过提供可量化的信号来帮助研究人员检测和定量分析各种生物分子。
hrp酶 标记 生物素 方法
HRP酶标记生物素方法：生物技术的关键应用
在生物技术领域，酶标记技术是一种广泛应用的检测方法。
其中，HRP（辣根过氧化物酶）酶标记生物素方法因其高灵敏度、高特异性和非放射性等优点，成为了生物医学研究中的重要工具。
本文将介绍HRP酶标记生物素方法的原理、应用及优化方法。
一、HRP酶标记生物素方法的原理
HRP酶标记生物素方法的基本原理是利用酶与底物的反应产生可检测的光学信号。
具体来说，将目标分子（如抗体、抗原、核酸等）与生物素结合，形成生物素标记的目标分子。
随后，将生物素标记的目标分子与HRP酶结合，形成酶标
记的复合物。
当底物加入酶标记复合物时，酶催化底物反应产生可检测的光学信号，通过信号的强弱判断目标分子的含量。
二、HRP酶标记生物素方法的应用
HRP酶标记生物素方法在生物医学领域有着广泛的应用，如免疫分析、核酸检测、蛋白质组学等。
其中，在免疫分析中，HRP酶标记生物素方法可用于检测抗原或抗体的含量，具有高灵敏度、高特异性和低背景干扰等优点。
此外，在核酸检测中，HRP酶标记生物素方法可用于检测DNA或RNA的存在及表达水平。
在蛋白质组学中，HRP酶标记生物素方法可用于蛋白质的相互作用研究和蛋白质组学分析。
三、HRP酶标记生物素方法的优化
为了提高HRP酶标记生物素方法的灵敏度和特异性，研究者们不断尝试优化该方法。
其中，以下几点是优化HRP酶标记生物素方法的关键：
1.选择合适的酶浓度和底物浓度：在保证酶催化反应速率的同时，降低背景
干扰和信号的非特异性。
2.优化反应条件：如pH值、温度、离子强度等，以获得最佳的酶催化反应
效果。
免疫标记技术
常用的酶及其底物 酶 辣根过 氧化物 酶 (HRP) 底物
邻苯二胺 (OPD) 四甲替联苯胺 (TMB) 5氨基水杨酸 (5AS) 邻联苯甲胺 (OT) 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻 唑啉磺酸-6)铵盐 (ABTS )
显色反应 测定波长
橙红色 蓝绿色 棕色 蓝绿色
蓝绿色
492 450 449 425 642
酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可导致大 量的催化过程，所以极为敏感。它的催化过程 有两种基本形式： (1)E十S →(ES)→E十P (2)E十S →＝(ES) (ES)十D1 →E十P十D2 E为酶，S为酶作用的底物，P为底物分解 后的产物，D，为供氢体，D：为D1的氧化型。 如P或D：为有色化合物，即可用呈色反应显示 酶的存在。
HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2) 和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型 染料，通过反应可生成有色的氧化型染料 (D)。酶促反应的过程如下: HRP DH2＋H2O2────→D＋2H2O
供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。如 DAB(3.3－二氨基联苯胺)的反应产物为不溶性沉 淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或 电镜观察。5AS(5-氨基水杨酸)早期曾用于ELISA， 但其溶解度不够大，且空白孔不易控制到无色， 现已很少应用。OT(邻联甲苯胺)的特点是能产生 鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高，但反应中受温 度影响较大，而且由于产物不稳定，需要在短时 间内进行测定。
荧光是指一个分子或原子吸收了给 予的能量后，即刻引起发光；停 止能量供给，发光亦瞬即停止。 荧光素是一种能吸收激发光的光能 产生荧光，并能作为染料使用的 有机化合物。目前用于标记抗体 的荧光素主要有异硫氰酸荧光黄 (FITC)、四乙基罗丹明及四甲基 异硫氰酸罗丹明。
辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG
辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（Goat Anti-rabbit IgG/HRP）规格：0.1ml/1ml抗体来源：Goat克隆类型：Polyclonal交叉反应：Rb产品应用：WB=1:1000-10000ELISA=1:1000-10000IHC-P=1:100-1000IHC-F=1:100-1000not yet tested in other applications.optimal dilutions/concentrations should be determined by the end user.分子量：150kDa性状：Lyophilized or Liquid浓度：2mg/1ml免疫原：Full length plasma protein亚型：IgG纯化方法：affinity purified by Protein A储存液：0.01M PBS,pH7.4with10mg/mL BSA and0.1%Gentamicin保存条件：Storage:Store at–20oC for one year.Avoid repeated freeze/thaw cycles.The lyophilized antibody is stable at room temperature for at least one month and for greater than a year when kept at-20oC.When reconstituted in sterile distilled water or diluent supplied, theantibody is stable for at least two weeks at2-4°C.产品介绍：Immunoglobulin G(IgG),is one of the most abundant proteins in serum with normal levels between 8-17mg/mL in adult blood.IgG is important for our defence against microorganisms and themolecules are produced by B lymphocytes as a part of our adaptive immune response.The IgG molecule has two separate functions;to bind to the pathogen that elicited the response and to recruit other cells and molecules to destroy the antigen.The variability of the IgG pool is generated by somatic recombination and the number of specificities in an individual at a given time point is estimated to be1011variants.Important Note:This product as supplied is intended for research use only,not for use in human,therapeutic or diagnostic applications.。
酶标记抗体
酶标记抗体
产品概述：
酶标记抗体,是一类广泛用于生物学和医学科学的许多领域，具有高特异性、高敏感性和安全的免疫化学试剂。
目前较为常用的辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体就是其中的一种，它是经过化学方法将辣根过氧化物酶（HRP）标记在抗体IgG分子上而制成的HRP－抗体结合物。
我公司向用户提供的各类辣根过氧化物酶标记产品均为本公司自主研发的产品，HRP 购于美国SIGMA公司的产品，根据本公司建立的目前较先进的过碘酸钠氧化法标记技术而成。
每种成品已加入一定浓度的BSA作为稳定剂。
产品的工作浓度根据方法不同而别，用前最好-20℃冻存，避免反复冻融。
应用范围：
应用于抗原决定族的抗原性分析鉴定，各种抗原、抗体的定量、定性及定位分析测定等。
工作中应注意的问题：
1、包被抗体或抗原不适，易产生阳性值较小，或产生变异，即跳管现象。
2、用抗血清不纯化，或纯化程度太低的抗体包被，则阳性值较小，或没有阳性梯度。
3、封闭不好或标记物过浓可产生对照较高。
主要性能：
每只0.1ml液体，内含IgG约1mg/ml，1% BSA，0.01%庆大霉素。
-20℃保存，稳定期一年。
4℃保存约3～6个月，4℃可30天左右。
稀释液为：0.01mol/L pH7.4PBST。
工作效价：
ELISA法：1：5000～10000
免疫印迹法：1：500～5000。
辣根过氧化物酶标记
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
酶制剂及其底物
◆ 凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均 可作为标记用。但作为标记抗体用的
◆ 酶应满足下列要求：(1)来源方便，易于纯化；(2) 比活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能
◆ 用简单方法测定。目前在免疫酶技术中常用的酶 为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶
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资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
（2）辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体的原理
a. 辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP ）
HRP广泛分布于植物界，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结 合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为 40,000,等电点为pH3～9，酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差 异，但多在pH5左右。酶溶于水和58％以下的硫酸铵溶液。HRP的辅 基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以 OD403nm ／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯 度。
法。 辣根过氧化物酶的标记常用过碘酸盐氧化法，这种方法法只适用于含
糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基，醛基与抗 体分子上的氨基形成Schiff碱而结合。后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺) 还原生成稳定的酶标记抗体。
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资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
在酶标过程中一般都混有未结合的酶和抗体。游离酶理论上不影响最 终的显色。但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争固相抗原，从而 减少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此需要对制备的酶结合物进行 纯化，去除游离的酶和抗体。纯化的方法很多，硫酸铵盐析法最为简便， 但效果并不理想。用离子交换层析、分子筛法可得到最佳的分离效果， 但费用较贵。
辣根过氧化物酶(HRP)标记蛋白的方法
HRP 的NaIO4标记法一．原理：HRP为一种糖蛋白（glycoprotein），其所带的糖基上的糖环能被氧化开环，在2，3—位的—C—C—断开。
在适当的氧化条件下，2，3—位羟基能被氧化为醛基。
醛基在碱性条件下可与被标记物的自由氨基（—NH2）形成Shiff碱（—N=CH—），Shiff碱不稳定，可由逆反应解离。
Shiff碱可由还原剂还原成—CH2—NH—，在HRP与被标记物间形成稳定的共价交联。
HRP的NaIO4标记法所用氧化剂为NaIO4，还原剂采用NaBH4。
Note:1.产物A不稳定，故用NaBH4还原为产物B。
2.HRP的氧化要适度，氧化不够不能产生足够量的醛基，如氧化过度，醛基可被进一步氧化为羧基，同样也得不到够量的醛基。
可通过控制NaIO4的量或控制氧化的时间来调节HRP糖基的氧化度。
当糖基的氧化度为20～25%时，有较高的结合效率。
3.为了防止HRP的过度氧化，在整个标酶的过程中应尽量避光。
光照可加快过碘酸钠对HRP糖基的氧化，如在标记过程中不避光，则不可控因素太多。
4.反应的最后一步用NaBH4来还原的反应比较剧烈，对酶活性的影响比较大。
有时可考虑在酶与糖基之间添加一个手臂，如联苯胺反应。
二．酶量的确定：被标记物在本实验室主要为抗原与抗体。
抗原与HRP的比值通常为摩尔比1：1。
而抗体与HRP的比值通常为质量比1.6：1。
当然，这只是一个基点，可根据需要上下调整比率。
统计本次标记所需酶的总量，设为x mg。
三．酶的氧化（全过程避光，操作中力防污染。
酶的终浓度为10mg/mL，总体积为x/10mL）1.称取HRP x mg。
当HRP从-20℃取出后，一定要平衡到室温，否则HRP冻干品易潮解。
称量时不要用称量纸，不要用工具取HRP，应将HRP直接小心地倒入要用来溶解HRP的器具中。
在倒HRP时，不要在风口（如电风扇风，自然风，呼吸）操作，因为HRP冻干品质轻易飞扬；尽量不要说话，以防污染。
hrp标记方法
hrp标记方法HRP标记方法呀，可有趣啦。
HRP呢，就是辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase）的简称哦。
HRP标记方法有好几种呢。
其中一种直接标记法，就像是给HRP这个小机灵鬼直接穿上一件带有特殊标记的小衣服。
不过这种方法有时候不是那么好操作，就像给一个调皮的小孩直接套上一件复杂的衣服，得小心翼翼的。
还有间接标记法。
这就像是找了个小助手来帮忙给HRP做标记。
先把一种物质和HRP连接起来，然后再通过这个中间的小助手把标记传递给目标分子。
这个方法就比较灵活啦，就像搭积木一样，可以通过不同的小助手来达到标记的目的。
在进行HRP标记的时候呢，有好多需要注意的小细节。
比如说反应的条件，就像做菜一样，温度、酸碱度这些条件都得合适。
如果温度太高或者太低，HRP可能就不乐意好好工作啦，就像我们人在不舒服的环境里也会没干劲一样。
酸碱度不合适的话，那整个标记过程可能就会变得乱七八糟的。
标记的试剂也很关键哦。
要选择质量好的试剂，不然就像是用了不好的颜料画画，画出来的效果肯定不好。
而且在操作过程中，要特别小心，避免有杂质混进去。
杂质就像是捣蛋鬼，会破坏整个标记的过程。
HRP标记方法在很多领域都有大用处呢。
在生物检测方面，它就像是一个小小的侦探。
可以通过标记特定的生物分子，然后检测这些分子的存在和数量。
比如说在检测某种疾病的标志物的时候，HRP标记就可以大显身手啦。
它能让我们清楚地看到那些隐藏在身体里的小秘密。
HRP标记方法虽然看起来有点复杂，但是只要我们掌握了其中的小窍门，就像掌握了一个好玩的游戏技巧一样，就能很好地利用它啦。
希望大家对HRP标记方法有了一个更亲切的认识哦。
单抗标记
1. 酶标记
（1） 辣根过氧化物酶（HRP）标记
辣根过氧化物酶（HRP）标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。这里介绍两种程序。
抗体很容易与经过化学修饰的活化生物素结合。生物素又可以与结合有酶、荧光染料或放射性碘的亲和素或链霉亲和素连接，后者已有商品试剂供应。这样只需将纯化抗体与生物素结合，就可用各种不同的标记物来检测。链霉亲和素及亲和素与生物素的亲和力非常高(Ka1015L／mo1)，并且二者间的相互作用实质上是不可逆的。由于链霉亲和素的等电点（pI）更适宜故其更常用，背量也因此较低。
根据需要还可将PAP和APAAP试剂先与相应桥抗体结合后，再与特定单抗组成完整的诊断试剂，这样，单抗即可一步法用于诊断或检测试验等。
2. 荧光素标记
（1） 异硫氰酸荧光素（FITC）标记
FITC标记抗体的原理是在碱性条件下，FITC 的异硫氰基能与IgG的自由氨基结合，形成IgG与荧光素的结合物。FITC是最常用的荧光素，其次选用TRITC（四甲基异硫氰酸罗丹明）。FITC和TRITC是常用的双标记组合。其标记步骤如下：
C. 加入25ul新配制的2mg/ml氯胺T。室温放置60秒。再加入50ul氯胺T终止液（含2.4mg/ml偏重亚硫酸钠，10mg/ml酪氨酸，10%甘油和0.1%环乙烷酰二甲苯的PBS）。
mihc实验原理及流程
mihc实验原理及流程
mIHC（多重荧光免疫组化）实验的原理和流程如下：
1. 原理：mIHC主要的技术原理来自TSA技术，即酪酰胺信号放大。
这是一种利用辣根过氧化酶（HRP）对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。
具体来说，利用二抗上带有的HRP催化后续添加入体系的非活性荧光素，该荧光素在HRP和过氧化氢的作用下被活化，跟临近蛋白的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合。
2. 流程：
第一步，进行多重荧光染色。
这是利用二抗上带有的HRP催化后续添加入体系的非活性荧光素，该荧光素在HRP和过氧化氢的作用下被活化，跟临近蛋白的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合。
第二步，进行微波处理。
前一轮非共价结合的抗体被洗掉，共价结合的荧光素还留存在样品上。
第三步，进行下一轮的孵育。
换另一种一抗和荧光素底物来进行孵育，如此往复就可实现多重标记。
请注意，因为涉及到多次微波，只有石蜡切片能经得起这番造作，而手中只有冰冻样本的老师，以往只能望洋兴叹，因为冰冻切片经不起甚至一轮的热
处理。
但随着技术的发展，这个难题也在逐渐被攻克，为了使得更多老师能够用上mIHC这项技术，Absin推出了抗体洗脱液（abs994）。
以上信息仅供参考，建议查阅专业书籍或咨询专业人士获取更准确的信息。
抗体的标记——辣根过氧化物酶(HRP)32
抗体的标记修饰抗体可以通过不同的化学试剂交联到酶（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶）、荧光染料（FITC、PE、APC等）、生物素（Biotin）、胶体金等。
一、抗体/蛋白的辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体标记HRP最为经典的方法为NaIO4氧化法，先将HRP糖基氧化成醛基，醛基与抗体的-NH2反应生成希夫氏碱反应，抗体分子与HRP分子形成稳定结构。
标记的时候一般按照抗体分子与HRP分子摩尔比1:4的比例进行标记，此时,两者的质量约为1:1。
1. 抗体/蛋白的HRP标记（NaIO4氧化法）标记以2mg抗体为例。
1.1 抗体/蛋白的处理待标记抗体/蛋白在50mM碳酸盐缓冲液(0.015M Na2CO3，0.035M NaHCO3，pH9.6) 中透析，其间换液2次，抗体/蛋白浓度调整为2mg/ml；或者将高浓度的抗体用0.5M碳酸盐缓冲液(0.15M Na2CO3,0.35M NaHCO3 ,pH9.6)稀释到2mg/ml，如果原抗体/蛋白溶液中含有Tris、NH4+等游离氨基的试剂，必须透析除去。
1.2 HRP酶的氧化1.2.1 称取2mg HRP干粉(Frdbio)溶于100 μL ddH2O 中。
1.2.2 称取NaIO4 21mg，溶于1 mL的ddH2O中，吸取100μL NaIO4溶液与100μL的HRP溶液缓慢混合，4℃下静置30min，此时溶液为绿色。
（注意：此后的操作均在避光条件下进行。
）1.2.3 吸取２µL乙二醇缓慢加入氧化后的HRP溶液，室温避光静置30min，此时溶液为褐色。
1.3 抗体的标记1.3.1 将氧化好的HRP溶液直接加入到已处理好的抗体/蛋白溶液中，室温反应２h。
1.3.2 称取0.4mg的NaBH4，溶解于20µL的ddH2O中，全部加入上步反应液中，4℃静置2h，每30min摇动一次。
1.3.3 PBS(pH7.2)透析过夜，标记液中加入体积比30%～50%的甘油，混匀后置于-20℃保存。
mihc技术原理
mihc技术原理
mIHC技术，即多重荧光免疫组化技术，主要基于TSA技术，即酪酰胺信号放大技术。
这是一种利用辣根过氧化酶（HRP）对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。
TSA技术主要利用酪胺的过氧化物酶反应，即酪胺盐在HRP催化H2O2下形成共价键结合位点，产生大量的酶促产物。
这些产物能与周围的蛋白残基（包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基）结合，在抗原-抗体结合部位沉积大量的生物素。
随后加入的Streptavidin-HRP/荧光基团与之结合，经几次这样的循环放大，可以结合大量的酶分子或荧光基团，使检测信号得到几何级放大。
mIHC技术利用这种方法，可以对单个细胞或组织样本上的多个目标靶点进行同时检测，全面研究细胞组成、细胞功能和细胞间相互作用。
如需了解更多信息，建议咨询生物学或医学专家或查阅相关文献资料。
hrp标记抗体方法
hrp标记抗体方法大家好呀！今天咱就来唠唠这hrp标记抗体的方法哈。
这可是在生物实验等好多领域都挺重要的一个技术呢，咱得好好整明白。
一、准备材料。
咱得先把要用的东西都准备齐全了。
这里面需要抗体，这可是主角之一哦，得选质量好、纯度高的，这样后面的标记效果才能好。
还有辣根过氧化物酶（hrp），这就是咱用来标记的关键家伙啦。
另外，像一些缓冲液呀，比如说磷酸盐缓冲液（PBS），这能给反应提供一个合适的环境，就像给它们打造一个舒服的小窝一样。
还有一些交联剂，像戊二醛啥的，它能把抗体和hrp连接到一起，就像搭桥一样。
还有一些用来检测标记效果的试剂，像底物显色液之类的。
最后呢，还得有一些实验器具，像离心管、移液器这些基本的工具可不能少。
二、标记过程。
这里面又有几个小步骤哈。
1. 抗体和酶的活化。
咱先把抗体和hrp都处理一下，让它们处于一个比较活跃的状态。
一般来说，咱可以把抗体和hrp分别放在合适的缓冲液里面稀释一下，就像给它们洗个舒服的澡，让它们舒展开来。
然后呢，加入适量的交联剂，这交联剂就开始发挥作用啦，它会和抗体以及hrp上的一些基团反应，让它们变得更容易结合。
这一步就像给它们俩都装上了小磁铁，让它们互相吸引。
2. 标记反应。
把活化好的抗体和hrp混合到一起，让它们充分地反应。
这个时候，它们就会在交联剂的帮助下结合在一起啦。
咱可以把它们放在一个合适的温度下，比如说室温或者稍微低一点的温度，反应个一段时间，像一个小时左右吧，让它们充分地结合。
在反应的过程中呢，咱可以时不时地轻轻摇晃一下，就像给它们搅拌搅拌，让它们有更多的机会碰到一起。
3. 终止反应。
等反应差不多了，咱得把这个反应停下来，不然它们可能会一直反应下去，那就不好啦。
咱可以加入一些终止剂，比如说甘氨酸溶液，它能把交联剂的活性给去掉，这样反应就停止啦。
就像给它们俩之间的小磁铁去掉磁性一样，让它们不再继续结合。
三、纯化标记抗体。
标记完了之后呢，里面可能会有一些没反应的抗体、hrp或者其他杂质，咱得把这些东西去掉，把纯净的标记抗体给分离出来。
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(12) 透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等。
简易过碘酸钠法
本法是以NaIO４先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合，所
获酶标记抗体的产率高，将近70％的HRP和Ig结合，99％的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重
大损失，是目前最常用的方法。
40,000 160,000 IgG量
(3) 本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有2～4％的
酶与蛋白质结合。
4. 试剂及器材：
(1) 0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，
(邻苯二胺)和TMB(四甲基联苯胺)。前者形成的产物为深桔黄色或棕色，后者产物为蓝绿
色，二者的可溶性均好，在避光处颜色稳定，空白可近于无色，灵敏度上据报道后者比前
者可高4倍以上。另外，还有一种供氢体称ABTS[2, 2'-边氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺
酸)]，其反应产物呈蓝绿色，且灵敏度和稳定性均好。尤其是在致癌的潜在可能性方面，
2. 标记步骤:
(1) 称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。
(2) 于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO４溶液，室温下避光搅拌20分钟。
(3) 将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。
(4) 加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0～9.5，然后立
(2) 反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml／1分
钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅
拌。
(3) 将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。
(4) 用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3?小时。
加蒸馏水至50ml
再用蒸馏水作20倍稀释，即成0.01M PH9.5的碳酸盐缓冲液。
(4) NaBH４溶液(4mg／ml):
临用时称取NaBH４4mg溶于1ml蒸馏水中。
(5) 其它的试剂及器材可参见戊二醛标记法。
(三) 工作浓度的选择
在免疫酶技术中，首先要确定的变异因素就是酶标记物的工作浓度。因为酶标记物浓
萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保
存。
3. 结果判定：
(1) 定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作
双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。
最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定( 见本节 (三)工作浓度的选
不溶性沉淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。5AS(5-氨基水杨酸)早
期曾用于ELISA，但其溶解度不够大，且空白孔不易控制到无色，现已很少应用。OT(邻联
甲苯胺)的特点是能产生鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高，但反应中受温度影响较大，而且
由于产物不稳定，需要在短时间内进行测定。目前用得较广泛和较满意的供氢体是：OPD
质)。否则，影响标记效果。
3. 室温搅拌时须避光，室内温度一般在25℃为宜。标记物每次透析前，须认真检
反应程度来确定酶标记抗体的效价，或称工作浓度。
其步骤为：先将抗原(或抗体)用0.05M PH9.6包被缓冲液稀释为10μg／ml左右，于聚苯
乙烯板孔内加0.1ml，4℃过夜，次日以洗涤缓冲液洗涤3次。酶标记抗体用1％BSA-PBS液依
次稀释成1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600??(根据据抗体的滴度而定)，分别加
(5) 0.15M PH7.4 PBS及生理盐水。
(6) PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。
(7) 萘氏试剂及聚乙二醇(PEG，MW2000)。
(8) 纯化的特异性抗体或抗Ig抗体。
(9) HRP(RZ>3.0)。
(10) Sephadex G-25层析柱(2cm×50cm)。
NaCl1.8克，加蒸馏水至200ml。
(2) 1.25％戊二醛液：取25％戊二醛50ml与PH6.8的PBS1ml混合。
(3) 1M PH9.5碳酸盐缓冲液：取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。
(4) 0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸缓冲液1ml中。
1. 原理：经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP上残留的α-和ε氨基基以
避免酶分子之间的交联。后来Wilson等改用在低PH下使NaIO４氧化HRP，从而省去了二硝
基氟苯封闭HRP步骤。HRP经NaIO４氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成
斯夫氏硷，后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。
58％以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一
般以OD403nm ／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应
在3.0左右(最高可达3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，纯度并不表示酶活
ABTS与TMB皆是值得被优选的供氢体。
由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制剂，因此酶促反应中使用的H2O2不能过量。应
控制在经较短时间反应后呈色即达高峰（说明H２O２已消耗殆尽）。这样即使再延长时间
也不会增加反应产物的颜色。
(二) HRP标记抗体的方法
酶与抗体交联的方法有许多种,根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP结
(2) 1mM PH4.4醋酸钠缓冲液:
0.2M NaAc (1.361克／50ml) 3.7ml
0.2M HAc (0.601ml／50ml) 6.3ml
加蒸馏水至2,000ml。
(3) 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液:
Na２CO３ 0.32克
NaHCO３ 0.586克
度的很小变化，便可导致试验结果产生很大的波动。另外，由于浓度过高，可使非特异性
反应增加，而浓度过低又可影响测定的敏感性。因此，正式试验前必须准确滴定其工作浓
度。
酶标记抗体的滴定方法是：将抗原(或抗体)物理吸附于固相载体上，然后将经过一系
列稀释的酶标抗体(或抗Ig抗体)与吸附在载体上的抗原(或抗体)起反应，以酶与底物的显色
性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。
HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型
染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反应的过程如下:
HRP
DH2＋H2O2────→D＋2H2O
供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。如DAB(3.3－二氨基联苯胺)的反应产物为
择)。
(2) 定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程1cm)。
酶量(mg／ml)＝OD403nm×0.4
IgG量(mg／ml)＝OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62
酶量(mg／ml) IgG量(mg／ml) 酶量
克分子比值＝──────── ÷ ─────── ＝ ─── × 4
酶标记抗体－HRP标记抗体原理及方法，戊二醛二步法和过碘酸钠法【医学基础免疫学实验指导】
来源：
医学基础免疫学实验指导,主编 金伯泉 李恩善,第1版.北京:世界图书出版社,1990
酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。酶标记物质量的好坏直接关
系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。酶标记物中最常用的是酶标记抗
(5) 加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。
(6) 在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。
(7) 3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于
少量0.15M PH7.4的PBS中。
(8) 将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用
入反应孔中，每个稀释度二孔，每孔0.1ml，37℃孵育1小时后洗涤。然后加底物液，每孔
0.1ml，37℃10～30分钟。以2M H２SO４ 0.05ml终止反应。
结果判定主要以ELISA比色仪读取各孔OD值。并以OD为纵座标，结合物浓度为横座
标，绘制滴定曲线。由曲线上查得OD值为1.0左右，且曲线斜率最大时的酶标抗体稀释
合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。尤以简易过碘酸钠法更为常用。
戊二醛二步法
1. 原理：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共
价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。
2. 标记步骤：
(1) 称取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室温静置过夜。
即加入10mg IgG(抗体，或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小
时。
(5) 加0.1ml新配的4mg／ml NaBH４液，混匀，再置4℃2小时。
(6) 将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 PBS透析，4℃过夜。
其余步骤(纯化)同戊二醛标记步骤的(6)、(7)、(8)。
(一) 酶制剂及其底物
凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用。但作为标记抗体用的
酶应满足下列要求：(1)来源方便，易于纯化；(2)比活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能