蓝莓果酒专用酵母的分离_筛选及鉴定_伍鹤

蓝莓汁： 蓝莓（ 圆蓝） 清洗、破碎、酶解、过滤，总糖 含量： 150. 4 g / L，总酸（ 以酒石酸计） 含量： 12. 6 g / L。
设备与仪器： 恒温培养箱，水浴锅、铁架台、滴定 管、冷冻离心机、无菌操作台、PCＲ 仪、电泳仪等。 1. 2 实验方法 1. 2. 1 酵母菌的初筛
将新鲜蓝莓果实打浆，置于 28℃ 恒温培养箱中 自然发酵； 当发酵醪液中产生大量气泡并有明显酒味 时，即可分离酵母菌； 约 3 ～ 5 d。取上述蓝莓醪液用 无菌水梯度稀释成 10 － 1 ～ 10 － 7 七个梯度，取最后 3 个 梯度进行平板涂布分离，每个梯度 3 个平行； 涂布量 0. 1 mL。
表 1 筛选菌种的杜氏小管产气实验 Table 1 Gas-producing capabilities of isolated yeast
strains observed in Durham fermentation tubes
发酵时间 /h 24
48
产气情况 ++
+++ ++++
++ +++ ++++
由表 2 可知，所选酵母在糖含量为 40% 时，仍可 以良好地生长，并且在 12h 时开始产气，24 h 内气体 充满整个杜氏小管，表现出了和 K 酵母一样优秀的 耐糖能力，完全达到果酒酵母的要求。
表 2 酵母菌糖耐受试验
Table 2 Gas-producing capabilities of isolated yeast
分离菌株的产气结果如表 1 所示。于 28℃ 下恒 温静置发酵 48 h 后，有 12 株酵母产气充满整个杜氏 小管，并闻到淡淡的酒香味，说明这 12 株酵母生长、 起酵能力较强，可能具有较高的发酵效率和发酵力。 其他菌株因在 48 h 产气无法充满杜氏小管，表明其 生长和发酵能力有限，无法满足果酒发酵对酵母菌的 要求。将上述筛选获得的菌株进行下一级筛选。
菌株数 13 7 10 15 14 12
注： “ + + ”： 产气量为杜氏管的 1 /2； “ + + + ”： 产气量为杜氏管 的 3 /4； “ + + + + ”： 气体充满整个杜氏管。
2014 年第 40 卷第 12 期（ 总第 324 期） 57
食品与发酵工业 FOOD AND FEＲMENTATION INDUSTＲIES
目前蓝莓酒的酿造过程中，大多采用葡萄酒通用 酵母，几乎没有适合蓝莓果酒发酵的专用酵母。由于 不同水果成分差异大，这就在一定程度上造成了蓝莓 果酒风味偏于平淡，无法突出蓝莓特有的口感和香气。
本实验从不同品种蓝莓叶、根部土壤以及果实自 发酵醪液中分离，通过产酒精、耐受能力等试验，筛选 出适合蓝莓果酒发酵的优良酵母； 通过 18S rDNA 序 列分析及构建系统发育树，对筛选菌株进行鉴定，旨 在推动蓝莓酒产业的工业化生产，也为构建特色型优 良蓝莓酒酵母提供亲本和基因资源。
2. 2. 2 酵母菌产乙醇能力比较 共有 3 株酵母产乙醇体积分数大于 8% ，编号分
别 为 BBL-21，BBF-09，BBF-17，乙 醇 体 积 分 数 为 8. 1% 、8. 1% 、8. 4% ； 表现出了与 K 酵母相当的发酵 能力（ 8. 3% ） 。达到了果酒酵母对于乙醇发酵能力 的要求，选用这 3 株酵母进行下一步筛选。 2. 2. 3 酵母耐受性试验 2. 2. 3. 1 酵母菌糖耐受性试验
食品与发酵工业 FOOD AND FEＲMENTATION INDUSTＲIES DOI： 10． 13995 / j． cnki． 11 － 1802 / ts． 201412012
蓝 莓 果 酒 专 用 酵 母 的 分 离 、筛 选 及 鉴 定
伍鹤，李珂，赵琳，刘安然，王远亮
（ 湖南农业大学食科院 食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙，410128）
将活化的酵母以 5% 的量接入糖含量为 210 g / L 的蓝莓汁中，于 28℃ 发酵 30 d，发酵结束后测定酒精 度、残糖、干浸出物、总酸等理化指标，并邀请 6 位专 家进行感官评定。蓝莓汁、蓝莓酒理化指标的测定以 及感官评价均按 GB / T 15038—2006《葡萄酒、果酒通 用分析方法》要求执行。 1. 2. 5 分子生物学鉴定 1. 2. 5. 1 DNA 模板的制备
采用石英砂破壁法提取酵母总 DNA［7］。 1. 2. 5. 2 DNA 的 PCＲ 扩增及序列测定
根据酵母 18S rDNA 保守区域设计引物。上游 引物，D2 Ｒ： 5'-GGTCCGTGTTTCAAGACG-3'； ITS-5： 5'GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'。采用 50 μL 反 应体系： 10 × PCＲ 缓冲液（ 含 25 mmol / L Mg2 + ） 5. 0
将测序获得的 18S rDNA 序列于美国国立生物 技术信息中心（ NCBI） 利用 Blast 软件进行核酸比对 分析。利用 Clustal 进行序列比对，MEGA 4. 1 构建系 统发育树并进行亲缘关系分析。
2 结果与分析
2. 1 酵母菌初筛 从不同蓝莓的生长环境及果实中，经分离和纯化
共得到酵母菌 122 株，其中蓝莓果实占 52. 5% ，蓝莓 叶占 33. 6% ，土壤来源仅为 13. 9% 。主要原因可能 是样品采集时处在蓝莓成熟期，6 月下旬当地温度较 高，阳光比较充裕，蓝莓果实中的糖分含量比较高，利 于酵母菌 的 生 长 和 繁 殖，易 于 筛 选 到 耐 受 性 高 的 菌 种； 土壤相对比较干燥，缺乏必要的营养成分，故酵母 菌的数量相对较少。 2. 2 酵母菌复筛 2. 2. 1 酵母菌产气性能比较
摘 要 为筛选得到适合蓝莓果酒发酵的酵母菌株，对来自不用品种的蓝莓成熟果实、蓝莓叶及蓝莓果园的土 壤进行筛选，共分离得到 122 株酵母菌； 采用镜检和杜氏管发酵法初筛，产酒精能力、耐性能力复筛，并选用葡萄 酒酿酒酵母（ K 酵母） 对比，最终确定 BBF-17 为最优菌株。采用 18S rDNA 序列鉴定以及系统发育树分析，对选 定酵母菌进行分子生物学鉴定，结果显示 BBF-17 与酿酒酵母（ EU649672. 1） 最为接近，相似度达 99% ，该菌株鉴 定为酿酒酵母。 关键词 蓝莓果酒，酵母菌，筛选，鉴定，18S rDNA
蓝莓，又名笃斯； 杜鹃花科越桔属多年生灌木。 果实中含有丰富的蛋白质、果糖、膳食纤维、维生素以 及多酚、黄酮、花青素、SOD、叶酸、单宁类物质，酸甜 可口、具有独 特 的 风 味，对 癌 症、冠 心 病、中 风［1］、神 经和 记 忆 衰 退、老 年 痴 呆［2］、泌 尿 系 统 疾 病、近 视 等［3］慢性疾 病 有 较 强 的 预 防 和 改 善 作 用，是 良 好 的 食源性抗氧化剂。
美国 Genview 公司； DNA Marker，北京鼎国昌盛生物 技术有限公司； 其他试剂为国产分析纯。
PDA 培养基： 200 g 土豆切碎，加水约 1 L，煮沸 20 min，4 层纱布过滤，于滤液中加 20 g 葡萄糖，氯霉 素 0. 1 g，加蒸馏水定容至 1 L； 固体培养基中加入 1. 5% 的琼脂，121℃ 下灭菌 20 min。
表 3 酵母菌在不同体积分数乙醇中的产气情况
1 材料与方法
1. 1 材料与试剂 样品的采集： 从位于张家界的蓝莓基地中摘取成
熟的蓝莓（ 南方高丛、兔眼杰兔、兔眼灿烂、圆蓝） 、蓝 莓叶及相应蓝莓根部土壤样品。
对照菌株（ K 酵母） ： 安琪葡萄酒活性酵母，湖北 安琪酵母股份有限公司； DNA 提取及 PCＲ 相关试剂，
第一作者： 硕士研究生（ 王远亮教授为通讯作者，E-mail： yuanliangw@ gmail． com） 。 收稿日期： 2014 － 07 － 02，改回日期： 2014 － 09 － 15
strains at different sugar concentration levels
编号
BBL-21 BBF-09 BBF-17
K
200 ++++ ++++ ++++ ++++
糖含量 /（ g·L －1 ）
250
300
350
++++ ++++ ++++
++++ ++++ ++++
++++ ++++ ++++
++++ ++++ ++++
400 ++++ ++++ ++++ ++++
注： “ + + + + ”： 气体充满整个杜氏管。
2. 2. 3. 2 酵母菌在不同体积分数乙醇的蓝莓汁中产 气情况
由表 3 可以看出，3 株目标菌对乙醇均有较好的 耐受耐性； 在乙醇体积分数低于 10% 时，均能在 24 h 内产气，起酵无明显延迟； BBF-09 和 BBF-17 能耐受 14% 的乙醇，高于 K 酵母。一般发酵果酒的乙醇体 积分数在 6% ～ 14% ，所选菌株符合要求［10］。
将活化的酵母以 5% 的量转入新鲜蓝莓果汁中， 28℃ 下发酵 10 d。打开瓶盖，轻轻晃动，选择特征香 味明显的菌株［6］。以 K 酵母对比，实验重复 3 次。 1. 2. 3 蓝莓果酒生产工艺流程