分子生物学研究法-基因功能研究技术
分子生物学研究法-基因功能研究技术
分子生物学研究法-基因功能研究技术第六章分子生物学研究法（下）基因功能研究技术随着越来越多的基因组序列相继被测定，人类对生物本质的认识已经发生了重大变化。
但是，海量序列信息也向我们提出了新的挑战。
如何开发利用这些序列信息，如何通过生物化学、分子生物学等方法研究基因的功能，从而进一步了解生物体内各种生理过程，了解生物体生长发育的调节机制，了解疾病的发生、发展规律，给出控制、减缓甚至完全消除人类遗传疾病，是新时期生物学家所面临的主要问题。
转录组测序技术、原位杂交技术、基因芯片技术为研究单个或多个基因在生物体某些特定发育阶段或在不同环境条件下的表达模式提供了强有力的手段。
用基因定点突变（site-directed mutagenesis）技术、基因敲除技术、RNAi技术可以全部或部分抑制基因的表达，通过观察靶基因缺失后生物体的表型变化研究基因功能。
酵母单杂交、双杂交技术，四分体技术等都是研究蛋白质相互作用、蛋白质-DNA相互作用等的重要手段。
随着分子生物学技术的发展，研究者可以在活细胞内和细胞外研究蛋白质之间的相互作用，为认识信号转导通路、蛋白质翻译后修饰加工等提供了丰富的技术支持。
本章将主要介绍研究基因功能的各种分子生物学技术和方法。
6. 1 基因表达研究技术6. 1. 1转录组测序6.1.1 转录组分析和RNA-Seq转录组（transcriptome），广义上指在某一特定生理条件或环境下，一个细胞、组织或者生物体中所有RNA的总和，包括信使RNA（mRNA）、核糖体RNA（rRNA）、转运RNA（tRNA）及非编码RNA（non-coding RNA或sRNA）；狭义上特指细胞中转录出来的所有mRNA的总和。
基因组－转录组－蛋白质组（genome－transcriptome －proteome）是中心法则在组学框架下的主要表现形式。
通过特定生理条件下细胞内的mRNA丰度来描述基因表达水平并外推到最终蛋白质产物的丰度是目前基因表达研究的基本思路。
分子生物学的方法和技术
分子生物学的方法和技术随着科技的不断进步，人们对于分子生物学的研究也越来越深入。
分子生物学是研究生物分子结构、功能及其相互作用的一门学科。
它在疾病诊断、基因工程、药物研究开发等领域都有着广泛的应用。
在分子生物学研究中，有很多的方法和技术可以用来解决问题，下面我们就一起来了解一下。
1. PCR技术PCR，即聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），是一种能够在试管中扩增DNA的技术。
它是创造性的方法，也是分子生物学领域中最重要的技术之一。
PCR技术在DNA的克隆、基因突变分析、DNA测序和基因表达分析等方面都有着广泛的应用。
PCR技术不仅能够扩增某一个基因的DNA序列，还可以同时扩增多个基因。
2. DNA芯片技术DNA芯片（DNA microarray）技术是一种高通量的基因表达分析技术。
它采用了DNA探针上的互补逆序列来检测样品中的RNA的含量。
DNA芯片技术可以同时检测大量基因的表达水平，从而了解集体基因表达模式的变化。
这种技术在肿瘤、遗传病、心脑血管疾病等方面的研究中都有着广泛的应用。
3. 蛋白质质谱技术蛋白质质谱技术是一种用来分析蛋白质结构和功能的技术。
这种技术通过分析样品中的蛋白质，可以了解蛋白质的分子量、结构、功能等信息。
它是基于分子重量差异和氨基酸序列的分析方法。
蛋白质质谱技术在药物研发、代谢组学、蛋白质组学等方面的应用日益广泛。
4. 基因敲除技术基因敲除技术是一种用来破坏特定基因并研究这些基因功能的技术。
该技术通过利用针对该基因的RNA，以及CRISPR/Cas9蛋白质等工具，来破坏特定的基因。
基因敲除技术在遗传学、肿瘤学、药物研发等领域都有着广泛的应用。
5. 单细胞测序技术单细胞测序技术是一种可以针对单个细胞的基因组或转录组DNA测序技术。
这种技术可以检测一个基因在一个单独的细胞中的表达，从而了解细胞的类型和功能。
它在免疫学、发育学、神经科学等领域的研究中都有着广泛的应用。
细胞分子生物学研究中常用的技术和方法
细胞分子生物学研究中常用的技术和方法细胞分子生物学是指研究细胞内发生的生物分子互作及其调控的学科。
随着生命科学技术的不断发展和完善，许多技术和方法得以应用于细胞分子生物学的研究中。
本文将从多个方面介绍细胞分子生物学研究中常用的技术和方法。
一、基因克隆技术基因克隆技术是一种常用的细胞分子生物学研究方法。
它可以通过将感兴趣的DNA序列插入载体DNA上，构建含有特定目的基因的重组DNA，最终将重组DNA引入宿主细胞中来研究某一基因的生物学功能。
基因克隆技术的核心是重组DNA技术，其中最常用的重组DNA方法包括限制性内切酶切割、DNA连接、转化及放大等步骤。
特别是在近年来的分子克隆技术中，基因编辑技术的应用使得基因克隆技术更加得到精细化和精确化。
二、蛋白质结构分析技术蛋白质是生物体中极其重要的分子之一，其结构对蛋白质的生物学功能有着至关重要的作用。
蛋白质的功能在很大程度上取决于其三维结构，因此蛋白质结构的研究是细胞分子生物学的重要研究领域。
蛋白质结构分析技术包括X射线晶体学、核磁共振、电子显微镜等。
其中，X射线晶体学是目前分析蛋白质最为常用的方法之一，其原理是利用X射线的衍射来确认蛋白质的三维结构。
三、荧光素酶标记技术酶标记技术是研究酶在细胞中的分布和功能的重要方法，其中荧光素酶标记技术则成为近年来应用最广泛的方法之一。
荧光素酶由日本学者O. Shimomura于1962年首次发现，可以发出明亮的荧光，被广泛应用于生物学研究中。
目前，荧光素酶标记技术被用来研究蛋白质的定位和运动等生物学过程，其原理是将荧光素酶标记的免疫球蛋白等物质与荧光素底物结合，从而通过荧光显微镜来研究生物分子的动态变化。
四、蛋白质互作筛选技术蛋白质在细胞中的互作是细胞分子生物学研究的重要问题之一。
蛋白质互作筛选技术则可以用来鉴定蛋白质之间的相互作用关系。
目前常见的蛋白质互作筛选技术包括酵母双杂交法、共免疫共沉淀、荧光共聚焦显微镜等。
分子生物学研究方法
优点
（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天 然状态； （2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避 免人为的影响； （3）可以分离得到天然状态的相互作ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ蛋白复合物。
缺点
（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白 质相互作用； （2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能 有第三者在中间起桥梁作用； （3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最 后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到 结果，方法本身具有冒险性。 （4）灵敏度没有亲和色谱高。
➢通过报告基因的功能筛选相互作用的蛋白。
Bait and Hunter Plasmids
Yeast two-hybrid transcription
Transfection
举例
3. GST融合蛋白沉降技术
▪ 研究体外蛋白质相
互作用技术
▪ 利 用 GST 对 谷 胱 甘
肽偶联的琼脂糖球 珠的亲和性，从混 合蛋白质样品中纯 化得到相互作用蛋 白。
操作步骤
（1）转染后24-48 h 可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液 （含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C， 最 大转速离心30 min后取上清； （2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加1μg 相应的抗体加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜； （3）取10μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每 次3,000 rpm离心3 min； （4）将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育 过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连； （5）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min， 将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解 缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液，沸水煮 5分钟； （6）SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析
分子生物学研究方法(下)
6.1.4基因定点突变(site-directed mutagenesis).
• 通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变 所编码的氨基酸序列，用于研究某个（些） 氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以 及结合配体能力的影响，也可用于改造 DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、 引入新的酶切位点等。
图6-6寡核苷酸 介导的DNA突 变技术
6 分子生物学研究方法（下） ——基因功能研究技术
6. 1 基因表达研究技术
• 6. 1. 1 基因表达系列分析技术（Serial Analysis of Gene Expression，SAGE）
• 是以DNA序列测定为基础分析全基因组表 达模式的技术。任何长度超过9-10个碱基 的核 苷酸片段都可能代表一种特异性的转 录产物，因此，根据某个序列占总标签数 的比例 可分析所对应基因的表达频率。
mRNA的互补链， 杂交信号集中于 纤维细胞中。
负对照，mRNA的 同义链,无杂交信号。
正对照，UBQ10 杂交信号遍布于 整个胚珠。
图6-5 用组织原位杂交技术检测棉花纤维特异基因的表达
• 荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH).首先对寡核苷酸探 针做特殊的修饰和标记，然后用原位杂交 法与靶染色体或DNA上特定的序列结合， 再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗体 来确定该DNA序列在染色体上的位置。
图6-4果蝇（Drosophila melanogaster）的 Dscam基因可以通过可变剪接产生38000多 种可能的mRNA异构体
6.1.3原位杂交技术
• 原位杂交(In Situ Hybridization，ISH)是 用标记的核酸探针，经放射自显影或非放
分子生物学5 分子生物学基本研究法
3、pBR322质粒载体
由三个不同来源的部分组成的：
第一部分来源于pSF2124质粒易位子Tn3的氨 苄青霉素抗性基因（AmpR）；
第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基 因（tetr）；
5. 2 DNA操作技术 5. 2. 1核酸的凝胶电泳
自 从 琼 脂 糖 （ agarose ） 和 聚 丙 烯 酰 胺 （polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按 分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成 为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互 作用的重要实验手段。
第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发 现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分 子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。
图5-1 几种主要DNA内切酶所识别的序列及 其酶切末端。
Werner Arber, Hamilton Smith and Daniel Nathans were awarded the 1978 Nobel Prize for their work on REs.
多核苷酸激酶
把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5'-OH末端 （进行末端标记实验或用来进行DNA的连接
末端转移酶
在双链核酸的3‘末端加上多聚或单核苷酸
DNA外切酶III
从DNA链的3'末端逐个切除单核苷酸
λ噬菌体DNA外切酶
从DNA链的5'末端逐个切除单核苷酸
碱性磷酸酯酶
切除位于DNA链末端的磷酸基团
嘌呤
硕士的研究课—现代分子生物学功能基因组学主要的研究技术胡忠精品文档
5、疾病的诊断与治疗
从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以 得出标准图谱。从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯 片杂交就可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱， 就可以得出病变的DNA信息。这种基因芯片诊断技术以 其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将 成为一项现代化诊断新技术。
Schena等采用拟南芥基因组内共45个基 因的cDNA微阵列（其中14个为完全序列， 31个为EST），检测该植物的根、叶组织 内这些基因的表达水平，用不同颜色的荧 光素标记逆转录产物后分别与该微阵列杂 交，经激光共聚焦显微扫描，发现该植物 根和叶组织中存在26个基因的表达差异， 而参与叶绿素合成的CAB1基因在叶组织较 根组织表达高500倍。
Chapter 5 功能基因组学主 要研究技术
功能基因组学（functional genomics） 是利用结构基因组学提供的信息，以高通量， 大规模实验方法及统计与计算机分析为特征， 全面系统地分析全部基因的功能。
功能基因组学的研究涉及众多的新技术，包 括生物信息学技术、生物芯片技术、转基因和 基因敲除技术、酵母双杂交技术、蛋白质组学 技术、反义核酸技术等技术。
靶片段：DNA、寡核苷酸、RNA等。 探 针：mRNA， 或是以mRNA为模板合成的
cDNA。 标记物：常采用荧光剂，如Cy3、Cy5，同位素、
地高辛等。
示例：原位喷印合成基因芯片
芯片原位喷印合成原理与喷墨打印类似， 不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装 的是四种碱基等液体而不是碳粉。喷印头 可在整个芯片上移动并根据芯片上不同位 点探针的序列需要将特定的碱基喷印在芯 片上特定位置。
linkage, and genetic variability.
6分子生物学研究法(下)——基因功能研究技术
目前，主要采用两种PCR方法，重叠延伸技术（左图）和 大引物诱变法（右图），在基因序列中进行定点突变。
6.2 基因敲除技术
1、基本原理
经典遗传学（Forward genetics）是从一个突变体的表型出 发，研究其基因型，进而找出该基因的编码序列。 现代遗传学（Reverse genetics，反向遗传学）首先从基因 序列出发，推测其表现型，进而推导出该基因的功能。 基因敲除（gene knock-out）又称基因打靶，通过外源DNA 与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因 改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗 传等特点。 基因敲除分为完全基因敲除和条件型基因敲除（又称不完全 基因敲除）两种。 完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动植物 个体中的靶基因活性，条件型基因敲除是指通过定位重组系 统实现特定时间和空间的基因敲除。 噬菌体的Cre/Loxp系统、Gin/Gix系统、酵母细胞的 FLP/FRT系统和R/RS系统是现阶段常用的四种定位重组系 统，尤以Cre/Loxp系统应用最为广泛。
ChIP不仅可以检测体内转录因子与 DNA的动态作用，还可以用来研究 组蛋白的各种共价修饰与基因表达 的关系。 定性或定量检测体内转录因子与 DNA的动态作用。 ChIP-chip and ChIP-seq：在基因 组水平研究DNA结合蛋白、组蛋白 修饰以及核小体分布。 ChIP-seq相对于ChIP-chip来说，具 有更高的分辨率、更小的噪音以及 更广的基因组覆盖范围。 Nucleosome Occupancy study: 一 些转录因子本身并不含有DNA结合 结构域，它是通过参与形成蛋白复 合物从而改变染色质结构来发挥作 用的；因此我们可以通过研究基因 组上核小体的分布变化来揭示转录 因子作用的过程。
现代分子生物学-第九章 分子生物学基本研究法(下)-基因功能研究技术
转录组测序分析和RNA-Seq
转录组(transcriptome)，广义上指在某一特定生理 条件或环境下，一个细胞、组织或者生物体中所 有RNA的总和，包括信使RNA (mRNA)、核糖体 RNA (rRNA)、转运RNA (tRNA)及非编码 RNA(non-coding RNA或sRNA); 狭义上特指细胞中转录出来的所有mRNA的总和。
转录因子与顺式作用元件结合，激活最基本启动子Pmin， 使报告基因表达。若接入3个以上顺式作用元件，可增强 转录因子的识别和结合效率。
结构域
二者融合 导入酵母 细胞
上游
启动子 下游
酵母单杂交体系主要用于：
确定某个DNA分子与某个蛋白质之间是否存在相互作用；
分离编码结合于特定顺式调控元件或其他DNA位点的功
胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定 了哺乳动物基因敲除的技术基础。
6. 2. 3 植物基因敲除技术
T-DNA插入失活技术是目前在植物中使用最为广 泛的基因敲除手段。
利用根癌农杆菌T-DNA介导转化，将带有报告基 因的DNA序列整合到基因组DNA上，如果这段 DNA插入到目的基因内部或附近，就会影响该基 因的表达，从而使该基因“失活”。
关于基因敲除技术，噬菌体的Cre/Loxp系统、 Gin/Gix系统、酵母细胞的FLP/FRT系统和 R/RS系统是现阶段常用的四种定位重组系统， 尤以Cre/Loxp系统应用最为广泛。
1、完全基因敲除：
Neo基因有双重作用：①形成靶位点的插入突变；②作为
正向筛选标记。
取代型
插入型
由于基因转移的同源重组自然发生率极低， 动物的 重组概率约为10-2～10-5，植物的概率为10-4～10-5， 即使采用双向选择法也很难保证一次就从众多细胞 中筛选出真正发生 了同源重组的胚胎干细胞。
第6章 分子生物学研究法(下)
9
平衡剪切 5′选择性剪切 选择性剪切
5′ss 5′ss
3′ss 3′ss 3′ss 3′ss
5′ss
类型
5′ss
3′ss
3 ′选择性剪切
5′ss
外显子遗漏 相互排斥剪切 5′ss
3′ss
10
提取不同组织的总RNA 提取不同组织的总 分离mRNA 分离
检 测 方 法
RT-PCR cDNA 以两端特异序列设计引物 PCR 观察PCR产物大小是否存在差异 产物大小是否存在差异 观察 存在差异 有选择性剪切 不存在差异 无选择性剪切 11
-
pUC origin of replication: 4317–4960 T7 RNA polymerase promoter: 5071–5089
27
胚胎干细胞（ cell，ES） 胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）
• ES细胞是取自小鼠胚胎早期的内细胞团。ES ES细胞是取自小鼠胚胎早期的内细胞团。 细胞是取自小鼠胚胎早期的内细胞团 细胞的特点：能在体外培养， 细胞的特点：能在体外培养，并保留发育的全 能性。 能性。 • 因此，在体外进行遗传操作后，将它重新植回 因此，在体外进行遗传操作后， 胚泡，它就可以发育成胚胎的各种组织，将胚 胚泡，它就可以发育成胚胎的各种组织， 胎移植入母鼠子宫内， ES细胞有机会发育成 胎移植入母鼠子宫内，使ES细胞有机会发育成 小鼠或某种组织。 小鼠或某种组织。
反 向 互 补
反向 引物 R2
正向 诱变 引物 FM 物 1 重叠
P C R
反向 诱变 引物 RM 2
正向 引物 F2 物
PCR3 变DNA 变 引物F2 引物 R2 PCR4
分子生物学与基因工程技术之间的联系
分子生物学与基因工程技术之间的联系分子生物学和基因工程技术是现代生物科学领域中两个密切相关的概念。
它们之间存在许多联系和相互影响，共同推动了生命科学的发展和进步。
本文将探讨分子生物学和基因工程技术之间的联系，并介绍它们在科学研究和应用领域中的重要作用。
首先，分子生物学是研究生命体内分子结构、组成和功能的学科。
它关注DNA、RNA和蛋白质等生物大分子的结构与功能关系，探究生物信息的传递和表达机制。
分子生物学的发展为基因工程技术的发展提供了重要的理论基础。
基因工程技术是利用分子生物学原理和技术改变或操控生物体的基因组成和表达。
它包括基因克隆、基因片段合成、基因编辑等一系列高效的分子生物学技术和方法。
基因工程技术的发展使得科学家能够直接操作、修改或传输基因，用于诊断、治疗疾病，改良农作物品种以及生产特定的药物或化学物质。
分子生物学和基因工程技术之间的联系体现在以下几个方面：1. 技术基础：基因工程技术是建立在分子生物学的基础上的。
只有深入了解和掌握分子生物学的基本原理和方法，科学家才能开展有效的基因工程实验。
分子生物学提供了对生物大分子结构和功能进行研究的工具和技术，为基因工程技术的发展提供了坚实的科学基础。
2. 基因克隆：基因工程技术中常用的方法之一是基因克隆，即将特定的基因从一个生物体中提取出来，经过处理后重新转移到另一个生物体中。
分子生物学技术如PCR、限制性内切酶消化、DNA连接等技术，为基因克隆提供了强有力的工具和方法。
3. 基因编辑：最近几年，CRISPR-Cas9技术的出现引起了科学界的广泛关注。
CRISPR-Cas9是一种基因编辑技术，利用分子生物学原理和技术，可以精确地编辑生物体的基因序列。
这项技术的突破为基因工程技术的开展提供了重要的平台，它能够精准地修饰生物体的基因组，为遗传病的治疗和农业的进步开辟了新的途径。
4. 重组蛋白的表达：基因工程技术能够将人工合成或从其他生物体提取的重组DNA片段插入到宿主生物体中，并利用宿主生物体的表达系统，产生目标蛋白。
6分子生物学研究法(下)
主要内容
基因表达研究技术 基因敲除技术 蛋白质及RNA相互作用技术
1
基因芯片及数据分析 利用酵母鉴定靶基因功能 其他分子生物学技术
6. 1 基因表达研究技术
基因表达系列分析技术 RNA的选择性剪接技术
1
原位杂交技术 基因定点突变
6.1.1 基因表达系列分析技术（Serial Analysis of Gene Expression，SAGE）
1
仅能编码80000种转录物，所以理论上每一个9碱基标签 能够代表一种转录物的特征序列。 第二，将具有基因特异性的9碱基标签集中(连接)于一 个克隆载体中进行测序，就可以得到代表基因表达的标 签，标签的种类代表不同的转录物，而标签重复出现的 次数代表该转录物的拷贝数，即基因表达的丰度。
z (1) 生物素蛋白-dT为引物反转录 cDNA，限制性酶(锚定酶，AE)酶切。 每一个mRNA只收集其polyA尾与最 近的酶切位点之间的片段。
负对照，mRNA的 同义链, 无杂交 信号。
其次，SAGE可用于定量比较不同状态下的组
织细胞的特异基因表达。利用SAGE 技术分 析正常乳腺上皮细胞、原位癌、浸润癌和转 移癌基因表达的差异。1 通过比较,寻找正常 乳腺上皮细胞高表达,而在肿瘤细胞中却表 达消失的基因。
基因表达系列分析技术
RNA的选择性剪接技术
原位杂交技术
1
基因定点突变
6. 1. 2 RNA的选择性剪接技术
RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方 式从一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接 异构体的过程。包括：1
平衡剪接、5’选择性剪接、3’选择性剪接、 外显子遗漏型剪接及相互排斥性剪接。
(a)平衡剪接 (b)5’选择性剪接 (c)3’选择性剪接 (d)外显子遗漏型剪接 (e)相互排斥性剪接
分子生物学中的研究技术
分子生物学中的研究技术分子生物学是一门研究生物体内分子结构、组成和功能的学科。
在过去的几十年，分子生物学的发展极为迅速，研究手段和技术也不断地得到发展和完善。
在分子生物学的研究中，涉及到了很多技术和手段，下面介绍一些常见的研究技术。
1. PCR技术PCR技术是一种以体外扩增DNA片段为基础的生物技术。
PCR技术采用了酶切与连接技术，通过引物提高DNA复制的精度和速度，从而实现以一份DNA为基础，大量扩增其特定片段的技术手段。
这种技术具有快速、灵敏、高效、可靠、简单等众多优点，因此被广泛应用在基因工程、生物学和医学等领域。
2. 杂交技术杂交技术是利用生物学方法在试管中进行的基因组分析技术，是一种检测DNA序列间是否有互补性的方法。
对于DNA序列相近的两个物种，杂交技术可以用来检测他们之间的亲缘关系。
常见的杂交技术有Southern blot 和 northern blot，这些技术可以检测DNA和RNA中的特定序列，从而帮助我们了解生物体中基因功能、表达和调控的机制。
3. DNA测序技术DNA测序技术是目前最常用的一种分子生物学技术，利用DNA测序仪来测定某一区域或者整个基因组的DNA序列。
DNA 测序技术的应用范围非常广泛，从个体特异性研究到种系演化研究都在使用此项技术。
同时，由于测序技术不断地得到发展和完善，新的测序技术如单分子测序和百万测序技术也得到了广泛的应用。
4. 蛋白质纯化技术蛋白质纯化是分子生物学研究中的重要技术，用于获得特定蛋白质的纯形式。
蛋白质纯化的主要目的是研究该蛋白质的性质、结构和功能。
常见的蛋白质纯化方法包括柱层析法、电泳法和亲和层析法等，这些方法可以根据不同蛋白质的化学性质和生理功能来选择。
5. 细胞培养技术细胞培养技术是指利用体外条件，为细胞提供足够的养分和生长因子，使其在瓶中生长和繁殖的技术。
细胞培养技术具有很多优点，可以在体外控制细胞的生长和分化，为细胞培育提供便利。
分子生物学研究方法
分子生物学研究方法
分子生物学研究方法是研究生物分子结构、功能和相互作用的一系列实验方法和技术。
这些方法帮助科学家了解细胞的基本结构和功能，研究生物分子在疾病发展、遗传变异和进化中的作用。
以下是一些常用的分子生物学研究方法：
1. DNA提取：从细胞或组织中提取DNA，以用于后续实验。
2. 聚合酶链式反应（PCR）：用于扩增DNA片段，以便进行分析和检测。
3. 凝胶电泳：用电场将DNA、RNA或蛋白质分离成不同大小的片段，以便研究其结构和功能。
4. 蛋白质纯化：通过一系列步骤将目标蛋白质从混合物中纯化出来，以获得足够的纯度用于研究。
5. 克隆：将DNA序列插入到载体中，以产生大量目标DNA 分子，用于进一步的分析和实验。
6. 基因测序：确定DNA序列的顺序，以研究基因功能、分析遗传变异或进行进化研究。
7. 基因表达：将目标基因转录成mRNA，并翻译成蛋白质，以研究基因功能和调控机制。
8. 蛋白质相互作用：使用技术如亲和层析、酵母双杂交等研究蛋白质之间的相互作用关系，以探索细胞信号传导和代谢途径。
9. 基因编辑：利用技术如CRISPR/Cas9，对细胞或生物体的基因进行精确的编辑，以研究基因功能或治疗遗传疾病。
分子生物学研究方法的不断发展和创新使得科学家可以更深入地了解生物分子的结构、功能和相互作用，为疾病治疗和生物技术的发展提供了基础。
分子生物学研究中的基因工程技术应用
分子生物学研究中的基因工程技术应用基因工程技术是分子生物学研究中的重要应用之一，它利用DNA重组和转化技术，对生物体内的基因进行定向操作和调控，进而实现更高效的基因研究和应用。
本文旨在探讨分子生物学研究中基因工程技术的应用现状和未来趋势。
一、基因工程技术在基因研究中的应用基因工程技术可以在分子水平上操作和控制基因序列，对于基因的结构与功能、基因调控、转录和翻译等方面的研究提供了有力的工具。
其中，蛋白质表达系统是基因工程技术的一个重要应用，包括原核和真核表达系统。
原核表达系统通过重组DNA序列，构建表达载体，使目的基因在大肠杆菌等原核细胞中表达出具有特定功能的蛋白质；真核表达系统则将表达载体转化为真核细胞的染色体DNA中，使外源DNA片段被转录和翻译为所需的蛋白质。
通过蛋白质表达系统，可以研究蛋白质的结构、功能、调控和互作等，进而探究该蛋白质与疾病发生、生物途径等方面的关系。
另外，基因敲除技术和基因编辑技术也是基因工程技术在基因研究中的应用之一。
基因敲除技术可以利用DNA重组和转化技术，将目的基因的启动子或编码区域替换为拷贝序列、霉素抗性基因等，从而实现目的基因的关键区段或完全删除。
这种技术可以为基因功能分析、疾病发生机理等方面提供有力的证据。
而基因编辑技术目前较为流行的是CRISPR/Cas9系统，其可以通过设计指向目的DNA序列的特异性RNA，与Cas9核酸酶结合，在基因组中实现定点修饰和编辑。
这种技术可以用于探究基因功能、疾病基因修饰、基因治疗等方面的应用。
二、基因工程技术在农业、医学、环保等领域的应用除了应用于基础科学研究之外，基因工程技术也在农业、医学、环保等领域得到了广泛的应用。
在农业领域，基因工程技术可以用于植物和动物品种改良，从而增加产量、提高质量、改善抗性等，进一步推动农业生产的可持续发展。
其中，转基因植物是基因工程技术应用的重点之一。
转基因作物可以将抗病、抗虫、耐旱等特质转入植物中，从而提高产量、减少农药使用、改善环境质量等。
分子生物学技术在基因组学研究中的应用
分子生物学技术在基因组学研究中的应用基因组学作为一个新兴的交叉学科，致力于研究和理解整个基因组的结构、功能和调控。
分子生物学技术是基因组学研究中不可或缺的工具，它为我们提供了深入探索基因组的手段和途径。
本文将探讨几种常见的分子生物学技术在基因组学研究中的应用。
一、PCR技术PCR（聚合酶链式反应）是一种快速、有效地扩增DNA片段的技术，被广泛应用于基因组学研究中的许多方面。
通过PCR技术，我们可以扩增基因组中感兴趣的特定片段，进而进行进一步研究。
例如，PCR技术可以用于检测基因突变、分析基因的表达水平，以及确定基因的单倍型。
二、DNA测序技术DNA测序技术是基因组学研究中最重要的技术之一，它使得我们能够准确地获取DNA序列信息。
目前，Sanger测序和下一代测序（NGS）是最常用的DNA测序技术。
Sanger测序是一种经典的测序方法，通过合成DNA链延伸来确定目标DNA序列。
而NGS技术则具有高通量、快速、低成本等优势，它已经广泛应用于基因组学研究、人类基因组计划、外显子组测序、转录组测序等领域。
三、重组DNA技术重组DNA技术是将不同来源的DNA片段进行重组，得到具有新功能的DNA分子的技术。
它在基因组学研究中扮演了至关重要的角色。
例如，重组DNA技术可以用于构建融合蛋白、制备基因工程草稿等。
此外，通过重组DNA技术，我们还可以构建表达载体、产生转基因动物模型、进行基因敲除等，从而更好地理解基因组的结构和功能。
四、基因芯片技术基因芯片技术（microarray）是一种高通量的基因组分析技术，通过同时检测数千个基因的表达水平，帮助我们了解基因组在不同条件下的变化。
基因芯片技术基于杂交原理，将不同基因的探针固定在一块基质上，然后用待测标本与其进行杂交反应。
通过分析杂交信号的强弱，我们可以获得该基因在样本中的表达水平。
这项技术在基因组学研究中被广泛应用于转录组学、表观遗传学以及疾病的诊断和治疗等方面。
分子生物学技术在功能基因组学中的应用
分子生物学技术在功能基因组学中的应用分子生物学技术是一门应用广泛的科学，它提供了一种透彻理解生命现象的方式。
这些技术已经被广泛应用在基因组学研究中，包括功能基因组学。
本文将重点介绍分子生物学技术在功能基因组学中的应用。
什么是功能基因组学？功能基因组学是一个基因组水平的研究领域，旨在研究基因组中的所有基因以及它们之间的相互作用。
这包括识别基因，分析基因调控机制，以及预测基因功能。
功能基因组学的目标是理解基因组在细胞和生物体内的功能，以及如何通过基因表达和调控实现这些功能。
在功能基因组学研究中，分子生物学技术起着至关重要的作用。
分子生物学技术是一种广泛应用的技术，它包括DNA测序、PCR、蛋白质表达和纯化，以及基因编辑和转录因子分析等技术。
分子生物学技术在功能基因组学中的应用1. DNA测序技术DNA测序技术是现代生命科学中最重要的技术之一。
它使得我们能够了解基因组中的每一个碱基。
在功能基因组学中，DNA测序技术用于鉴定基因、分析基因变异和预测基因调控区域。
使用全基因组测序和RNA测序可以深入探索基因组和转录组的功能。
2. 转录因子分析转录因子是调节基因表达的重要蛋白质。
分子生物学技术可以用于研究转录因子的结构和功能，以及它们在基因调控中的作用。
这包括测量特定转录因子的结合强度和位置，并探索转录因子通过哪些机制调节基因表达。
3. 基因编辑技术基因编辑技术是一种利用CRISPR/Cas9系统对基因组进行特定编辑的技术。
这种技术使得研究人员能够特定编辑和修改基因组中的基因，以研究基因表达和调控机制。
这种技术在功能基因组学研究中得到了广泛的应用，包括对基因变异的检测和编码区域的功能注释等。
4. 蛋白质表达和纯化蛋白质是生物体中最重要的分子之一，需要通过表达和纯化获得。
在功能基因组学中，蛋白质表达和纯化技术用于研究转录因子、核酸结合蛋白和其他蛋白质的功能。
这包括通过酶标法和质谱法测量蛋白质与DNA或RNA的相互作用，以及了解蛋白质在细胞生命周期中的不同功能。
分子生物学技术在基因分析中的应用
分子生物学技术在基因分析中的应用分子生物学技术是指利用分子生物学研究中的一系列技术手段，对生物体的分子结构和功能进行分析和探索的科学技术。
它在基因分析中起着至关重要的作用，为我们深入了解基因的结构、功能和调控机制，解析基因与疾病之间的关系提供了有力的工具。
本文将重点介绍分子生物学技术在基因分析中的应用。
第一，PCR技术。
聚合酶链式反应(PCR)是一种通过体外扩增DNA片段的技术，它能够以指数级别复制目标DNA序列，从而使我们可以在样本中找到只有一两个拷贝的DNA。
PCR技术在基因分析中的应用广泛，如检测基因突变、基因型分析、DNA指纹鉴定等。
此外，PCR技术还可以与其他分子生物学技术结合，如RT-PCR技术用于检测基因表达、实时荧光定量PCR技术用于定量基因表达等。
第二，基因测序技术。
基因测序技术是通过测定DNA序列来揭示基因信息的一种重要手段。
DNA测序技术的发展使得我们能够高效地测定基因的序列，从而研究基因功能、寻找疾病基因等。
近年来，高通量测序技术的快速发展，如二代测序(NGS)技术，进一步降低了基因测序的成本和时间，大大促进了基因分析的发展。
第三，基因克隆技术。
基因克隆技术是指将感兴趣的DNA序列插入到载体中，形成重组DNA分子的技术。
利用基因克隆技术，科学家可以克隆一些基因并进行进一步的研究，如基因表达、蛋白质结构与功能、基因调控机制等。
此外，基因克隆技术还有助于构建基因库、表达蛋白质等育种和生物制药方面的应用。
第四，基因组学研究。
基因组学是研究生物体完整基因组的组成、结构、功能和演化的科学。
分子生物学技术在基因组学研究中起着关键作用。
通过对基因组DNA的测序、比较基因组学和功能基因组学等技术手段，科学家可以对基因组进行全面的研究，解析基因在生物体内的分布和功能，揭示基因的演化规律以及基因与疾病之间的关系。
生命科学中的基因功能研究
生命科学中的基因功能研究基因功能研究是生命科学中的一个重要领域，旨在了解和解析基因的功能和作用机制。
通过对基因功能的探索，可以更深入地了解细胞内的生物学过程，以及基因与疾病之间的关联，为生物学和医学的发展提供理论和实践基础。
基因是生物体内传递遗传信息的基本单位，是决定个体性状的重要因素。
通过研究基因功能，可以揭示基因在个体发育、生长、代谢以及对环境变化的适应等方面的作用机制。
基因功能的研究方法主要包括遗传学方法、分子生物学方法、生物化学方法和细胞生物学方法等。
遗传学方法是探索基因功能的重要手段之一、遗传学研究中，通过比较野生型与突变型生物体的差异，可以进一步了解基因在个体发育和其他生物学过程中的功能。
例如，透过分析两个种群的遗传相关性，可以发现相关的突变基因，并进一步研究这些基因的功能。
分子生物学方法是研究基因功能的常用手段之一、分子生物学方法可以研究基因在细胞内的表达调控、蛋白质合成过程以及基因在细胞内的相互作用等。
通过克隆和表达基因，可以进一步验证和研究基因的功能。
例如，通过基因敲除技术，可以研究基因在细胞发育和生物学过程中的功能。
生物化学方法也是研究基因功能的重要手段之一、生物化学方法主要通过分析和研究基因编码的蛋白质及其功能，来了解基因在细胞内的作用机制。
例如，通过研究酶的功能和调控机制，可以揭示基因在代谢过程中的作用机制。
细胞生物学方法是研究基因功能的重要手段之一、细胞生物学方法主要通过观察和研究基因在细胞内的表达和调控，来了解基因的功能和作用机制。
例如，通过显微镜观察基因在细胞内的定位和相互作用，可以揭示基因在细胞发育和生物学过程中的作用机制。
基因功能研究的重要意义在于解析基因与生物学过程和疾病之间的关联。
基因在细胞生物学过程中的功能异常可能导致疾病的发生和发展。
通过研究基因功能的异常和调控机制，可以发现和诊断遗传疾病，并为疾病防治提供新思路和新方法。
此外，基因功能研究还可以为开发新药物和治疗方法提供理论和实践基础，对药物研发和治疗效果进行评估和改进。
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分子生物学研究法-基因功能研究技术————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：第六章分子生物学研究法（下）基因功能研究技术随着越来越多的基因组序列相继被测定，人类对生物本质的认识已经发生了重大变化。
但是，海量序列信息也向我们提出了新的挑战。
如何开发利用这些序列信息，如何通过生物化学、分子生物学等方法研究基因的功能，从而进一步了解生物体内各种生理过程，了解生物体生长发育的调节机制，了解疾病的发生、发展规律，给出控制、减缓甚至完全消除人类遗传疾病，是新时期生物学家所面临的主要问题。
转录组测序技术、原位杂交技术、基因芯片技术为研究单个或多个基因在生物体某些特定发育阶段或在不同环境条件下的表达模式提供了强有力的手段。
用基因定点突变（site-directed mutagenesis）技术、基因敲除技术、RNAi技术可以全部或部分抑制基因的表达，通过观察靶基因缺失后生物体的表型变化研究基因功能。
酵母单杂交、双杂交技术，四分体技术等都是研究蛋白质相互作用、蛋白质-DNA相互作用等的重要手段。
随着分子生物学技术的发展，研究者可以在活细胞内和细胞外研究蛋白质之间的相互作用，为认识信号转导通路、蛋白质翻译后修饰加工等提供了丰富的技术支持。
本章将主要介绍研究基因功能的各种分子生物学技术和方法。
6. 1 基因表达研究技术6. 1. 1转录组测序6.1.1 转录组分析和RNA-Seq转录组（transcriptome），广义上指在某一特定生理条件或环境下，一个细胞、组织或者生物体中所有RNA的总和，包括信使RNA（mRNA）、核糖体RNA（rRNA）、转运RNA（tRNA）及非编码RNA（non-coding RNA或sRNA）；狭义上特指细胞中转录出来的所有mRNA的总和。
基因组－转录组－蛋白质组（genome－transcriptome －proteome）是中心法则在组学框架下的主要表现形式。
通过特定生理条件下细胞内的mRNA丰度来描述基因表达水平并外推到最终蛋白质产物的丰度是目前基因表达研究的基本思路。
转录组研究的基本方法包括基因芯片技术（gene chip）和转录组测序技术。
我们将在6.4节详细叙述基因芯片技术，这里主要讨论转录组测序技术的原理和应用。
基于传统的Sanger测序法对转录组进行研究的方法主要包括：表达序列标签（expressed sequence tag，EST）测序技术，基因表达系列分析技术（serial analysis of expression，SAGE）。
EST测序数据是目前数量最多，涉及物种最广的转录组数据，但测序读长较短（每个转录本测定400 bp－500 bp），测序通量小，测序成本较高，而且无法通过测序同时得到基因表达丰度的信息。
有人使用SAGE 测序法，将不同转录本3’端第一个CATG位点下游14 bp长的短标签序列来标识相应的转录本。
由于标签序列较短，可以将多个标签串联测序，使SAGE法相对于EST测序在通量上大大提高。
但过短的序列标签使得序列唯一性降低，即使改进过的LongSAGE用21 bp标签测序，仍然有约一半的标签无法被准确注释到基因组上。
高通量测序技术（high-throughput sequencing），又名二代测序（second-generation sequencing）或深度测序（deep sequencing），可以一次性测序几十万甚至几百万条序列，是传统测序技术的一次革命。
主要有Roche公司研发的454测序平台和Illumina公司的Solexa测序平台（表6-1）。
表 6-1 454和Illumina高通量测序平台比较454 Illumina读取长度（bp）约700 50－150单次测序数据量700 Mb 600 Gb测序周期23小时7－14天测序成本较高低虽然都是基于“边合成边测序（sequencing by synthesis，SBS）”，但是454和Illumina的实现方法有很大的不同。
454系统采用焦磷酸测序（pyrosequencing）原理，如图6-1a所示，在DNA 聚合酶的作用下，按照T、A、C、G顺序加入的单个dNTP与模板的下一个碱基配对，同时释放一个分子的焦磷酸(PPi)，在ATP硫酸化酶的作用下，PPi和腺苷酰硫酸（adenosine-5’-phosphosulfate,APS）结合形成ATP，在萤光素酶的催化下，ATP和萤光素结合形成氧化萤光素，产生可见光，被CCD捕捉。
而Illumina系统（图6-1b）采用带有萤光标记的dNTP，其3’羟基末端带有可被化学切割的部分，每个循环反应只允许掺入一个碱基，由激光扫描反应板表面，读出这一轮反应新加的萤光信号，从而判定碱基种类。
之后，经过化学切割恢复3’端粘性，进行下一轮聚合反应。
从上述描述中不难看出，随着反应的进行，已有萤光信号会使新的荧光难以准确分辨，因此该方法的测序读长较短，测序错误主要是碱基替换。
而454则由于缺少终止反应的元件，相同碱基的连续掺入常会带来“插入－缺失”类型的测序错误。
利用高通量测序技术对转录组进行测序分析，对测序得到的大量原始读长（reads）进行过滤、组装及生物信息学分析的过程被称为RNA-Seq。
对于有参考基因组序列的物种，需要根据参考序列进行组装（reference assembly），对于没有参考序列的，需要进行从头组装（de novo assembly），利用大量读长之间重叠覆盖和成对读长（pair-end reads）的相对位置关系，组装得到尽可能完整的转录本，并以单位长度转录本上覆盖的读长数目（reads per kilo-base gene per million bases，RPKM）作为衡量基因表达水平的标准（图6-2）。
在实际组装过程中，图中红色标示区域覆盖度过低，且读长缺乏相对位置信息的区域，其可信度较低，应当剔除，保留两侧序列。
现以棉花转录组学数据为例，简单分析不同组织或纤维不同发育时期基因表达情况（表6-2）。
Illumina平台测序得到26.86Gb数据，经过从头组装总共获得了42,773条非重复序列，平均长度1,054碱基。
每个不同组织中分别有23,265至26,427个独立转录本。
转录组数据不但能用来分析不同组织中独立转录本数量，还被用于分析特定转录本在某个组织中的表达强度（表6-3）。
RNA-Seq还可以用于转录本结构、转录本SNP检测、非编码区功能鉴定以及挖掘低丰度转录本等研究。
表6-2 陆地棉6个组织的RNA-Seq 数据分析表6-3棉花组织特异性转录因子表达强度分析序列标识 基因 RPKM序列标识 基因 RPKM 根 茎 根 茎 Unigene58528 MYB-L 81.86 0.16 Unigene85367 FAR1 0.40 65.51 Unigene58563 B3 56.02 0.00 Unigene29146 HD-ZIP 0.00 44.49 Unigene58582 B3 53.66 0.29 Unigene51008 HB 0.24 43.60 Unigene58458 Dof 45.54 0.00 Unigene18073 MIKC 0.13 36.74 Unigene55872 Dof 41.56 0.00 Unigene64521 MYB 0.15 31.71 Unigene51911 bHLH 36.64 0.19 Unigene58698 B3 0.09 24.01 Unigene58446 NAC 28.40 0.37 Unigene62109 MYB 0.04 18.45 Unigene57837 bHLH 20.27 0.00 Unigene52681 bZIP 0.20 17.62 Unigene58640 S1Fa-L 20.25 0.68 Unigene64531 G2-L 0.34 16.92 Unigene55579B315.710.13Unigene64486bHLH0.0014.49转录组组装过程中，同一个非重复序列上复盖有来自根、茎等不同组织的读长，不同读长数目通过归一化转变为RPKM 值，进而筛选得到组织特异表达的转录因子。
6. 1. 2 RNA 的选择性剪接技术RNA 的选择性剪接是指用不同的剪接方式（选择不同的剪接位点组合）从一个mRNA 前体产生不同的mRNA 剪接异构体的过程。
一般将选择性剪切分为如下几类：平衡剪切、5’选择性剪切、3’选择性剪切、外显子遗漏型剪切及相互排斥性剪切（图6-3）。
一般用RT-PCR 的方法研究一个基因是否存在选择性剪切。
首先以cDNA 两端特异引物或来自不同外显子的引物序列在不同组织来源的RNA 样品中进行扩增，观察PCR 产物大小是否存在差异。
一旦发现差异，即可通过序列分析来判断这种差异是否来自于选择性剪切。
图6-4为拟南芥中发现的有选择性剪切的5个转录调控因子基因的物理图谱。
选择性剪接使一个基因翻译为多种蛋白质序列，组织样品 读长数 碱基数 Q201(%) N50 独立基因 总数 独立基因 长度(nt) 开花后0天胚珠 47907298 3593047350 98.22 827 26427 778 开花后5天胚珠 53022210 3976665750 97.86 842 23520 786 花 48049786 3603733950 97.99 823 23265 775 叶 54191238 4064342850 97.51 820 25280 776 根 79438254 7149442860 91.68 786 23905 753 茎 49713024 4474172160 91.46 782 24088 746 总计3323218102686140492013064277310541Q20，测序准确率达到99％。
是基因表达多样性的重要表现形式。
分析人类基因组数据发现，有60%的基因在表达过程中可通过选择性剪切产生各种形式的mRNA。
最新的研究表明，果蝇的Dscam 基因最多可能够产生38，016种不同形式的剪切体（图6-5）。
由于选择性剪切与细胞生理、发育调节以及肿瘤的发生、转移等有密切关系，阐明基因的选择性剪切机制是了解动植物个体发育和基因功能的重要环节。
因此，发现新的可变剪切异构体，确定每个异构体的独特功能和生物学意义并阐明其调节机制，是功能基因组时代的一个重要特征。
6. 1. 3 原位杂交技术原位杂交( In Situ Hybridization，ISH) 是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段，通常分为RNA原位杂交和染色体原位杂交两大类。