基本技术操作规程

1. 目的

保证检验前的质量控制，并对合格的标本进行规范的接种，不同类别的标本按照不同的接种方法，选择不同的培养基，有针对性地分离出有临床意义的致病菌。

2. 范围

微生物实验室所有标本。

3. 职责

微生物实验室检验人员应遵守本程序。

4. 程序

4.1 标本接种的优先处理原则

所有标本到达微生物实验室后都需及时处理，依据标本的性质，制定标本优先处理的四个水平方针，第一水平的标本需立即接种处理，第四水平的标本可延迟处理，以下为临床标本优先处理的四个水平方针。

4.1.1 水平一标本

分类属于“危险的或易被污染的”，是由于疾病入侵性质的严重性或所检测的微生物对环境温度等较敏感，容易死亡。此类标本必须立即处理，包括脑脊液、心包液、血液、支气管肺泡灌洗液、心脏瓣膜。

4.1.2 水平二标本

未保护并且能很快退化或污染的菌群能很快大量繁殖，从而改变这些标本的性质，必须很快提供合适生长的环境，使这些标本中营养要求高的微生物得以生长繁殖。此类标本包括痰液、未被列入水平一的体液、组织、伤口分泌物、粪便、脓液等标本。

4.1.3 水平三标本

为需要定量的尿液或定量组织活检标本，延迟处理则会影响到标本检出菌量的精密度。

4.1.4 水平四标本

为床边接种入培养基中的标本（如放入碱性蛋白胨水、血培养瓶、运送培养基的标本），是具有保护的标本，为了处理好较高水平的标本，水平四标本可以延迟处理。

4.2 标本的编号

标本的编号规则根据检验目的的不同，按照标本的接收、标识程序中的编号规则进行编号。

4.3 标本的处理

4.3.1 血液标本

接受标本后，立即对标本进行编号、登记。门诊病人要登记联系方式。将血培养瓶置于全自动血培养仪中培养。抽取血液前，先将血培养瓶颠倒混匀，血培养瓶口用75%酒精消毒。

待酒精干燥后，用一次性1ml注射器抽出待检标本，滴少量待检标本在每块平板上的一区。接种在平皿上的标本采用三分区划线法划线。

4.3.2 痰、肺泡灌洗液、支气管毛刷、纤支镜吸痰标本

4.3.2.1 痰标本先用无菌接种环挑取标本涂片。

4.3.2.2 用无菌接种环挑取标本分别涂布于血琼脂平板、巧克力平板、中国蓝平板的第一区，

然后再划第二、第三区。

4.3.3 咽拭子、咽喉分泌物标本

用拭子分别涂布于血琼脂平板、巧克力平板、中国蓝平板的第一区，然后再用无菌接种环划第二、第三区。

4.3.4 脑脊液标本

用无菌接种环挑取标本分别涂布于血琼脂平板、巧克力平板、中国蓝平板的第一区，然后再划第二、第三区。并离心涂片检查。

4.3.5 伤口分泌物、脓液、抽取物、胸腹水等穿刺液

床边抽取体液标本5～10ml注入血培养瓶，若量少时（1～2ml）可直接置于无菌管中，立即送检。接受标本后，立即对标本进行编号、登记，置孵育箱培养。

4.3.6 粪便或肛拭子标本

取粪便脓血或粘液部分标本接种于SS平板和中国蓝平板和血平板。霍乱弧菌培养（不能用肛拭子标本）需接种碱性蛋白胨水、庆大平板和SS平板。

4.3.7 尿标本

将尿标本混匀，用10μl定量接种环立即接种血琼脂平板、中国蓝平板，分离细菌和菌落计数。

4.3.8 生殖道分泌物标本

用拭子分别涂布于血琼脂平板、巧克力平板、中国蓝平板的第一区，然后再用无菌接种环划第二、第三区。淋球菌培养直接接种于巧克力平板上。

4.3.9 以上标本真菌（念珠菌属）培养

加种一个沙保罗培养基。

4.4 标本的接种方法

4.4.1 平板划线接种法：平板划线接种法是最常用的分离培养细菌的方法，通过平板划线后，

可使细菌分散生长，形成单个菌落，有利于从含有多种细菌的标本中分离出目的菌。分离培养用的平板培养基应表面干燥，可在临用前置37℃孵育箱内30分钟，这样既有利于分离培养，又有利于培养某些对低温敏感的细菌（如脑膜炎奈瑟菌等）。划线接种时，接种环与培养基表面约成45°为宜。划线时应尽可能做到置、密、匀，有效地利用培

养基表面达到充分分离细菌的目的。如果标本含菌较多，接种在强选择培养基上时或标本含菌较少时，采用分区划线接种，接种环可一直划完各区，不必灭菌。常用平板划线接种法有以下2种

4.1.1 分区划线法

4.4.1.1.1 此法用于痰液、粪便等含较多微生物标本的分离。

4.4.1.1.2 首先将接种环灭菌后冷却，沾取适量标本均匀划线5～6个往返于平板培养基第一

区，将接种环火焰灭菌，待冷却，第二区接触第一区中央3～4次后连续划线5～6个来回，依次可分3～4区，最后烧灼接种环灭菌，每一区细菌数可逐渐减少，直至分离出单个菌落为止。

4.4.1.2 连续划线法

4.4.1.2.1 此法用于含菌量较少的标本（如中段尿）。

4.4.1.2.2 方法是首先用10μL定量接种环将标本以均匀直线涂布于平板培养基的中央一条

线，然后用接种环在其自左向右连续划线并逐渐向下移动使标本均匀涂布于培养基平板上，不用烧环和分区。

4.4.2 斜面接种法：此法主要用于鉴定或保存菌种，或观察细菌的某些生化特性和动力。其

方法为从平板分离培养物上用接种环挑取单个菌落或者是取纯菌种，移种至斜面培养基上，先从斜面底部自下而上画一条直线，再从底部开始向上画曲线接种，尽可能密而匀，或直接自下而上画曲线接种。如移种试管培养物时，可与斜面培养基管同持于左手，右手拿接种环的同时，小指与环指及环指与中指之间各拔取并夹持一个胶塞，取培养物直接接种于斜面培养基上，然后塞上胶塞，火焰灭菌管口和接种环。

4.4.3 穿刺接种法：此法用于保存菌种、观察动力或接种某些生化反应管。其方法是将纯菌

插入半固体培养基的中央，穿刺至培养基的底部，然后沿穿刺线退出接种针，其他操作与斜面接种法类似。

4.4.4 液体接种法：本法多用于普通肉汤、真菌肉汤及蛋白胨水等液体培养基的接种。其方

法是左手持培养基与菌种管，右手持接种环并夹持胶塞，经火焰灭菌试管口后，以灭菌并冷却后的接菌环沾取菌种，倾斜液体培养基管，先在液面与管壁交界处研磨接种物（试管直立后液体应淹没接种物为准），然后再在液体中摆动2～3次接种环将标本洗下，塞好胶塞后轻轻混匀。

4.5 接种步骤

4.5.1 选择所需的培养基，标明标本编号。

4.5.2 接种环使用前需用电热高温接种灭菌器进行灭菌，方法是将接种环伸入加热孔的高热区，停留5～7秒或以肉眼可见接种环变红为止。