MALDI-TOF MS在临床微生物实验室的应用研究进展

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临床微生物检验技术进展

an identification of E. coli is appropriate. If negative for these tests, Shigella should be suspected and an agglutination with Shigella antisera performed.
带补充数据库时可以鉴别新生隐球菌（
C.neoformans）和格特隐球菌（C.gattii）。
（6）在丝状真菌应用
丝状真菌的表型易变，其蛋白质谱可随生长条件及分析菌丝区域的不同而变化，目前的商业数据库少有涉及这些菌。De Carolis等人使用布鲁克Biotyper
系统开发了曲霉菌（Aspergillus species）、镰刀菌（Fusarium species）和毛霉菌（Mucorales）的数据
一、临床微生物病原体的快速诊断
虽然对“快速”的时间长短没有正式的定义，但是大多数人期望快速的系统能在4h内提供可用的结果。通常微生物的繁殖时间（通常是30min或更长时间）不允许那些依赖微生物生长与否的检测方法，在短时间内产生可检测的生化反应。为了克服这一问题，必然使用全新的底物，检测待测菌产生的酶或蛋白质，从而在1～4h内检测出应答反应。
Hale Waihona Puke （1）DNA靶向测序对于纯培养的微生物可以进行DNA序列的靶向测序。靶基因的保守区往往是PCR引物和 DNA测序引物退火结合的区域。可变区具有独特的核苷酸序列，从而实现基于测序的特定菌株属和种的鉴定。鉴定细菌最常用的靶序列是16S rRNA基因（16S rDNA）。
（2）电喷雾离子化质谱（ESI-MS）技术应用于PCR产物的分析
（1）在需氧/兼性厌氧的革兰阳性杆菌应用

MALDI-TOF质谱分析在临床微生物实验室的应用

ｏｆＨＣＶＥＪ￣．ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ，２０１１，２７（４）：３１９ —
３２１．
收稿日期：２０１３ — ０４－０１
修回日期：２０１３ — ０７－０９
ＭＡＬＤＩ — ＴＯＦ质谱分析在临床微生物实验室的应用
赵苏瑛，李
摘
岷
（江苏省中医院检验科，南京
２１００２９）
要：基质辅助激光解析／电离一飞行时间质谱分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳ）是一种新兴的软电离质谱分析，被用来绘制细茵
ｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｏｔａｌｈｅｐａｔｉｔｉｓＣｖｉｒｕｓｃｏｒｅａｎｔｉｇｅｎ，
ｂｒａｎｃｈｅｄ — ＤＮＡ，ａｎｄａｍｐｌｉｃｏｒｍｏｎｉｔｏｒａｓｓａｙｓｉｎｄｅｔｅｒ — ｍｉｎｉｎｇｖｉｒｅｍｉａｆｏｒｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｃｈｒｏｎｉｃｈｅｐａｔｉｔｉｓＣｄｕｒｉｎｇｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｐｌｕｓｒｉｂａｖｉｒｉｎｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｔｈｅｒａｐｙ
ＯＵＳｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｈｅｐａｔｉｔｉｓＣｖｉｒｕｓ（ＨＣＶ）ｃｏｒｅａｎｔｉｇｅｎａｎｄａｎｔｉ — ＨＣＶａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｉｍｐｒｏｖｅｓｔｈｅｅａｒｌｙｄｅｔｅｃｔｉｏｎ

2014-MALDI_TOF_MS技术在细菌鉴定方面的应用研究_杨细飞

基金项目：国家自然科学基金资助项目（81273126，30972454，81102154）；深圳市重点实验室提升发展项目（CXB201005260068A）；广东省医学科研基金（（B2012322，A2013598））；深圳市科技计划项目［医疗卫生类（201202086）］作者简介：杨细飞（1978－），男，博士，副研究员，主要从事微生物学检验及神经科学研究。

通讯作者：刘建军，E－mail：junii8@126．com ·论著·MALDI－TOF－MS技术在细菌鉴定方面的应用研究杨细飞，刘威，夏菠，任晓虎，黄新凤，刘建军深圳市疾病预防控制中心现代毒理学重点实验室，广东深圳518055摘要：目的探讨基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（Matrix－Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI－TOF－MS）技术在细菌快速鉴定方面的实用性。

方法将同一方法分离纯化后的20株试验菌株分别接种到营养肉汤中，37ħ过夜培养后按照同一标准预处理。

采用MALDI－TOF－MS检测和MALDI Biotyper软件分析数据，同时以16S rDNA PCＲ方法对细菌进行鉴定。

结果20株试验菌株中成功鉴定了17株，鉴定率85%，并且与16S rDNA PCＲ鉴定结果基本一致，说明鉴定结果准确性较高。

结论MALDI－TOF－MS方法鉴定细菌快速准确且操作简单，可发展为细菌鉴定的重要辅助工具。

关键词：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱;16S rDNA PCＲ法;细菌;鉴定中图分类号：O657．63文献标识码：A文章编号：1004－8685（2014）08－1078－04Application of MALDI－TOF－MS technology in bacteria identification YANG Xi－fei，LIU Wei，XIA Bo，ＲEN Xiao－hu，HUANG Xin－feng，LIU Jian－jun Key Laboratory of Modern Toxicology，Shenzhen Centre for Disease Control and Prevention，Shenzhen518055，China Abstract：Objective To discuss the utility of matrix－assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry （MALDI－TOF－MS）in rapid identification of bacteria．Methods Twenty test strains，which were separated and purified in the same way，were inoculated to nutrient broth，and cultivated at37ħovernight before pretreatment according to the same standard．The bacterial strains were then detected by MALDI－TOF－MS and analyzed by MALDI Biotyper software．At the same time，16S rDNA PCＲwas also applied as the control method．Ｒesults Seventeen strains were successfully identified from 20test strains with the identification rate of85%．The results of MALDI－TOF－MS were basically the same with those of16S rDNA PCＲassay，indicating the high veracity of MALDI－TOF－MS．Conclusion MALDI－TOF－MS was accurate，fast and easy－operated for bacteria identification，and it could be developed as an important assistant tool for bacteria identifica-tion．Key Words：Matrix－assisted laser desorption/ionization time－of－light mass spectrometry；16S rDNA PCＲassay；Bacteria；Identification细菌在日常生活中无处不在，既存在有利的一面，又影响人类的健康和安全。

MALDI-TOF-MS技术快速鉴定丝状真菌的临床评价

MALDI-TOF-MS技术快速鉴定丝状真菌的临床评价吴友伟;石红;刘万静;答嵘【摘要】目的探讨基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术在丝状真菌快速鉴定中的临床应用价值.方法对西安交通大学第一附属医院2015年3月至2017年1月分离自临床的丝状真菌进行聚合酶链式反应(PCR)测序鉴定与MALDI-TOF-MS鉴定,同时回顾形态学方法鉴定结果 ,对丝状真菌菌种分布、标本来源进行分析,采用Kappa值一致性评价方法对质谱鉴定与形态学方法鉴定结果进行统计分析.结果本研究共包含分离自临床的丝状真菌102株,非重复分离株83株.烟曲霉50株(60.24%),黄曲霉26株(31.33%).标本来源主要为呼吸道标本,其中痰液68株(81.93%),支气管灌洗液11株(13.25%).MALDI-TOF-MS技术与形态学方法鉴定结果比对,Kappa值为0.1410.结论 MALDI-TOF-MS技术在丝状真菌鉴定正确性与时效性优于形态学方法.%Objective By comparing the identification results of clinical strains of filamentous fungi using MALDI-TOF-MS and morphological identification ,explore the clinical application value of MALDI-TOF-MS in the rapid identification of filamentous fun-gi .Methods The st udy was conducted in the First Affiliated Hospital of Xi′an Jiaotong University between March 2015 and Janu-ary 2017 .Eighty-three clinical strains of filamentous fungi were identified using PCR and sequencing as well as the MALDI-TOF-MS .Morphological identification results was reviewed in LIS ;species distribution and specimen source of filamentous fungi were an-alyzed .The consistent of mass spectrometry and morphological identification were appraised with Kappavalue consistent evaluation method .Results This study enrolled 102 strains of filamentousfungi ,including 83 non-repeated strains .Aspergillus fumigates was the most common strains ,including 50 strains(60 .24% ) ,followed by Aspergillus flavus of 26 strains(31 .33% ) .Specimen source were mainly respiratory specimens ,including sputum of 68 strains(81 .93% ) and bronchial lavage of 11 strains(13 .25% ) .The re-sults of MALDI-TOF-MS and morphology method were appraised and the Kappavalue was0 .141 .Conclusion MALDI-TOF-MS was a rapid detection method and was better in accuracy of identification of filamentous fungi than morphological method .【期刊名称】《检验医学与临床》【年(卷),期】2017(014)021【总页数】3页(P3155-3156,3159)【关键词】基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱;丝状真菌;形态学方法;评价【作者】吴友伟;石红;刘万静;答嵘【作者单位】西安交通大学第一附属医院检验科 ,西安710061;西安交通大学第三附属医院消化内二科 ,西安710068;西安交通大学第一附属医院检验科 ,西安710061;西安交通大学第一附属医院检验科 ,西安710061;西安交通大学第一附属医院检验科 ,西安710061【正文语种】中文随着丝状真菌相关侵袭性疾病的增加，快速准确的菌种水平鉴定对于抗真菌治疗至关重要。

maldi-tof ms在细菌耐药性检测中的应用进展

西林敏感金黄色葡萄球菌（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
，）的质谱ａｕｒｅｕｓＭＳＳＡ峰差异较大，两者有各自的特异峰且
不同ＭＲＳＡ分离株之间也存在差异［１］，预示ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ
具备ＭＲＳＡ识别和分型的潜力。Ｊｏｓｔｅｎ等［２］使用反义ＲＮＡ
ｍ／ｚ）能够快速区分ＭＲＳＡ和。ＭＳＳＡ［４］
然而，一对具有相同遗传背景的ＭＲＳＡ与其ＳＳＣｍｅｃ缺
失的突变株ＭＳＳＡ之间并没有特异性蛋白质峰。［５］Ｂｅｒｎａｒｄｏ
等［６］使用质谱仪的反射器模式分析细菌裂解液时未发现
ＭＲＳＡ和ＭＳＳＡ蛋白质谱图之间存在区别，原因可能与仪器
摘要：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ）已经发展成为微生物实验室鉴定菌种的常规工具。ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ在微生物学耐药性检测中的应用尚处于研究阶段。该文就ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ在细菌耐药性检测中的方法及其适用病原体的研究现状做一综述。关键词：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱；细菌；耐药性中图分类号：Ｒ４４６．５文献标志码：Ａ
技术确定金黄色葡萄球菌质谱中２４１５ｍ／ｚ的峰与酚溶调控
蛋白（ＰＳＭ）ｍｅｃ的表达相关，该肽由Ⅱ、Ⅲ、Ⅷ型葡萄球菌
ｍｅｃ盒式染色体（ＳＣＣHale Waihona Puke ｅｃ）编码。此峰在金黄色葡萄球菌和
表皮葡萄球菌中出现可特异性预测甲氧西林耐药［３］。在一
项前瞻性研究中，使用支持向量机（ＳＶＭ）分类开发的预测模
型（，，，，，１８８８．１１９３５．９２７６０．３２８６７．９３０４４．２４６４１．３

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱微生物鉴定系统性能验证方案的建立

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱微生物鉴定系统性能验证方案的建立徐蓉;慎慧;黄媛媛;何丽华;倪丽君;郭建;吴文娟【摘要】目的建立基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱系统(MALDI-TOF MS)在常规临床微生物鉴定中的性能验证方法,指导临床实验室规范微生物鉴定程序.方法选取标准菌株、质控菌株和临床菌株共115株,包含革兰阳/阴性球菌30株、革兰阳/阴性杆菌31株、真菌30株,厌氧菌、苛养菌各12株,所有菌株均经Vitek Compact鉴定和/或细菌16S rDNA、真菌ITS DNA测序分析验证.任意选择3种MALDI-TOF MS微生物鉴定系统厦门质谱、布鲁克质谱、安图质谱,采用检测系统推荐方法进行菌株鉴定,进行准确度验证试验.精密度验证:选取标准菌株和临床菌株10株,1位操作者使用3个检测系统对10株菌株分别进行质谱鉴定3次,连续鉴定3 d;3位操作者使用3个检测系统对10株菌株每d分别进行质谱鉴定3次,连续鉴定3 d,从而验证鉴定结果的重复性.结果厦门质谱、布鲁克质谱、安图质谱对标准/质控菌株(除外厌氧菌)的鉴定符合率为100％;对临床菌株的属水平鉴定符合率为100％;对革兰阴/阳性杆菌的种水平鉴定符合率分别为100％、100％、96.77％;对革兰阳性球菌的种水平鉴定符合率分别为96.67％、96.67％、100％;对真菌的种水平鉴定符合率均为90％一致;对苛养菌的种水平鉴定符合率均为100％;对厌氧菌鉴定符合率为91.67％种水平一致.精密度验证试验结果重复性100％.结论 3种MALDI-TOF MS系统在革兰阳/阴性球菌、革兰阳/阴性杆菌、真菌、苛养菌鉴定的准确度和精密度符合要求,验证通过.本文建立的微生物鉴定质谱仪性能验证方案可满足综合性医院临床微生物实验室常规鉴定基本要求.【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2018(036)010【总页数】5页(P783-787)【关键词】基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱;性能验证;微生物鉴定【作者】徐蓉;慎慧;黄媛媛;何丽华;倪丽君;郭建;吴文娟【作者单位】上海市临床检验中心临床微生物室,上海200126;同济大学附属东方医院南院检验科,上海 200123;同济大学附属东方医院南院检验科,上海 200123;同济大学附属东方医院南院检验科,上海 200123;同济大学附属东方医院南院检验科,上海 200123;同济大学附属东方医院南院检验科,上海 200123;同济大学附属东方医院南院检验科,上海 200123【正文语种】中文【中图分类】R446.520世纪90年代末，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)成功应用于微生物菌种鉴定并得到迅猛发展。

MALDI-TOF_MS技术在真菌鉴定和药敏试验中的影响因素研究

ә通信作者,E -m a i l :g u o y o n g32@126.c o m ㊂㊃综述㊃D O I :10.3969/j.i s s n .1672-9455.2023.14.027MA L D I -T O F M S 技术在真菌鉴定和药敏试验中的影响因素研究李家政,缪杨阳综述,郭勇ә审校南京中医药大学附属苏州市中医医院检验科,江苏苏州215000摘要:基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MA L D I -T O F M S )是一种具有经济㊁快速㊁准确㊁高通量等特点的新技术,广泛应用于临床微生物的常规鉴定㊂近年来,随着MA L D I -T O F M S 技术的不断发展,其在临床感染性真菌的快速鉴定㊁药敏试验㊁分型等实验室诊断中在一定程度上弥补了传统形态学鉴定的不足,展现出巨大的应用潜力㊂由于真菌种类繁多㊁结构复杂㊁耐药谱多样及表型可变,在MA L D I -T O F M S 技术分析真菌的过程中,影响因素相对来说比较复杂,该文就不同培养条件㊁蛋白质提取方法和蛋白图谱数据库等条件对MA L D I -T O F M S 技术鉴定真菌的影响作一综述㊂关键词:基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术; 真菌鉴定; 真菌药敏试验; 真菌分型中图法分类号:R 978.5文献标志码:A文章编号:1672-9455(2023)14-2104-04I n f l u e n c i n g f a c t o r s o f M A L D I -T O F M S t e c h n o l o g y i n f u n ga l i d e n t i f i c a t i o n a n d d r u g s u s c e p t ib i l i t yt e s t r e s e a r c h L I J i a z h e n g ,M I A O Y a n g y a n g ,G U O Y o n gәD e p a r t m e n t o f C l i n i c a l L a b o r a t o r y ,S u z h o u T r a d i t i o n a l C h i n e s e M e d i c i n e H o s p i t a l A f fi l i a t e d t o N a n j i n g U n i v e r s i t y o f C h i n e s e M e d i c i n e ,S u z h o u ,J i a n g s u 215000,C h i n a A b s t r a c t :M a t r i x -a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n t i m e -o f -f l i g h t m a s s s p e c t r o m e t r y (MA L D I -T O F M S )i s a n e w t e c h n i q u e w i t h e c o n o m i c a l ,r a p i d ,a c c u r a t e a n d h i g h -t h r o u g h p u t c h a r a c t e r i s t i c s ,w h i c h i s w i d e l y us e d i n t h e r o u t i n e i d e n t i f i c a t i o n o f c l i n i c a l m i c r o o r g a n i s m s .I n r e c e n t y e a r s ,w i t h t h e c o n t i n u o u s d e v e l o pm e n t o f MA L D I -T O F M S t e c h n o l o g y ,i t h a s m a d e u p f o r t h e s h o r t c o m i n g s o f t r a d i t i o n a l m o r p h o l o gi c a l i d e n t i f i c a t i o n t o a c e r t a i n e x t e n t i n t h e l a b o r a t o r y d i a g n o s i s o f c l i n i c a l i n f e c t i o u s f u n g i ,s u c h a s r a p i d i d e n t i f i c a t i o n ,d r u g se n -s i t i v i t y t e s t a n d t y p i n g ,a n d h a s s h o w n g r e a t a p p l i c a t i o n p o t e n t i a l .D u e t o t h e w i d e v a r i e t y ,c o m pl e x s t r u c t u r e ,d i v e r s e d r u g r e s i s t a n c e s p e c t r u m a n d v a r i a b l e p h e n o t y p e o f f u n g i ,t h e i n f l u e n c i n g f a c t o r s a r e r e l a t i v e l y c o m pl e x i n t h e p r o c e s s o f f u n g i a n a l y s i s b y MA L D I -T O F M S .T h i s a r t i c l e r e v i e w s t h e i n f l u e n c i n g f a c t o r s o f f u n gi i d e n -t i f i c a t i o n b y MA L D I -T O F M S u n d e r d i f f e r e n t c u l t u r e c o n d i t i o n s ,p r o t e i n e x t r a c t i o n m e t h o d s a n d p r o t e i n m a pd a t a b a se s .K e y wo r d s :m a t r i x -a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n t i m e -o f -f l i g h t m a s s s p e c t r o m e t r y ; i d e n t i f i c a t i o n o f f u n g i ; f u n g a l s u s c e p t i b i l i t y t e s t i n g ; c l a s s i f i c a t i o n o f f u n gi 近年来,由于恶性肿瘤的高发病率及化疗药物㊁广谱抗菌药物和免疫抑制剂等在临床的广泛应用,侵袭性真菌感染的发生率和病死率呈明显上升趋势[1]㊂真菌感染的临床表现复杂,顽固难治愈,易误诊误治,早期抗真菌治疗对患者生存至关重要㊂抗真菌治疗不充分㊁延迟开始治疗时间均会增加患者的病死率[2]㊂传统的真菌鉴定方式,尤其是丝状真菌的鉴定,主要依赖形态学方法㊂由于检验人员专业水平和经验参差不齐,其准确性和时效性较差,鉴定困难和鉴定错误的情况时有发生,进而导致治疗失败㊁病情延误㊂虽然分子测序技术是真菌鉴定的金标准 ,但其操作复杂㊁价格昂贵且对实验条件和人员要求较高,难以在临床实验室常规开展㊂基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MA L D I -T O F M S)是一种跨学科的检测新技术,具有适应范围广㊁快速㊁准确㊁高通量㊁经济㊁操作方便等优势[3]㊂近几十年来,科研人员对MA L D I -T O F M S 技术在临床真菌的快速鉴定㊁药敏试验等方面不断探索和实践,在一定程度上弥补了传统形态学和分子测序技术上的不足㊂影响质谱鉴定真菌的因素比较复杂,尤其是丝状真菌,在培养条件㊁蛋白质提取方法㊁蛋白图谱数据库均不同的条件下,鉴定结果具有较大差异,仍需进行改进和完善[4]㊂本㊃4012㊃检验医学与临床2023年7月第20卷第14期 L a b M e d C l i n ,J u l y 2023,V o l .20,N o .14Copyright ©博看网. All Rights Reserved.文基于近几年来MA L D I-T O F M S技术在临床真菌鉴定和诊断中的应用进展,总结出不同检测条件对鉴定结果的影响,旨在为临床实验室实施MA L D I-T O F M S技术鉴定真菌提供相应信息㊂1培养条件对MA L D I-T O F M S技术鉴定真菌的影响丝状真菌受生长条件和真菌菌丝体区域的影响,呈现出可变的表型㊂菌龄㊁培养基种类㊁培养条件等均可能会导致蛋白质谱差异,干扰样品的正确鉴定㊂有研究显示,来源相同的尖孢镰刀菌株,在两种不同琼脂培养基平板温度为25ħ的环境下生长1周,蛋白质谱具有明显差异,随着时间的推移,即使在含有相同培养基的琼脂平板上,也会对蛋白质谱产生影响,特别是蛋白质峰的相对高度[5]㊂丝状真菌的孢子和菌丝体具有不同的生物相和蛋白质图谱,在采集固体培养基上的丝状真菌样品时,二者往往被同时采集,进而影响鉴定结果㊂布鲁克系统建议用液体培养基培养丝状真菌,因为液体培养基中丝状真菌分离物主要是菌丝体,可以提高蛋白质谱质量㊂但由于液体培养基存在雾化孢子污染风险和无法可视化宏观和微观表型特征的缺点,临床实验室仍然以直接从固体培养基中收集真菌样品为主,以简化样品制备过程并节省时间㊂对于酵母菌,使用不同的培养基同样会对MA L-D I-T O F M S技术的鉴定对数评分值有明显影响[6]㊂一般而言,采用MA L D I-T O F M S技术分析的菌落,应选择已经经过所用检测系统制造商验证的培养基,以提高鉴定结果与数据库的匹配度,保证鉴定质量㊂总之,用户应了解制造商推荐的培养基优㊁缺点及其孵育条件,以提高MA L D I-T O F M S技术鉴定真菌的性能㊂2标本制备对MA L D I-T O F M S技术鉴定真菌的影响对MA L D I-T O F M S技术来说,标本制备及合适的蛋白质提取方法是影响鉴定灵敏度㊁分辨率和再现性的关键步骤㊂标本制备不当会导致较低的峰分辨率,影响鉴定结果㊂基于MA L D I-T O F M S技术的丝状真菌鉴定在过去几年受到限制,主要原因是缺乏高效的样品制备方法来保证高质量的蛋白质谱㊂与细菌不同,真菌可以通过简单的预处理方法快速准确地获得鉴定结果,而真菌的传统预处理方法,特别是丝状真菌则更为复杂,涉及乙醇㊁甲酸㊁乙腈等试剂和离心等提取过程,不同丝状真菌蛋白质提取方法对质谱鉴定结果的影响差异较大㊂HO N S I G等[7]根据MA L D I-T O F M S技术制造商提供的3种不同标本制备方法,比较各自在鉴定丝状真菌物种水平的识别率,结果显示,液体培养有效识别率最高(76.1%),优于细胞裂解法(62.0%)和完整细胞法(48.9%)㊂除制造商推荐的样本制备方法外,在临床工作中,广大科研人员也不断探索和开发出了许多新的样本制备方法㊂P E N G等[8]描述了一种更方便㊁省时㊁省试剂㊁灵敏的预处理方法:甲酸夹层法㊂使用安图生物质谱仪的A u t o f M S系统时,甲酸夹层法能够实现93.9%的物种级鉴定;当临床库㊁科研库㊁内部数据库结合使用时,使用梅里埃公司的V I T E K M S系统能实现97.3%的物种级鉴定㊂N I N G等[9]创建了两种快速提取丝状真菌蛋白质的方法:氧化锆-二氧化硅磁珠法(Z S B)和聚焦超声法(F U S),并使用V I T E K M S系统评估了两种方法的识别精度㊂按制造商推荐的常规蛋白质提取方法, V I T E K M S系统物种级正确鉴定率为76.42%,Z S B 和F U S物种级正确鉴定率分别为79.67%和76.42%㊂按制造商推荐的常规蛋白质提取程序,每个丝状真菌预处理时间至少需要30m i n,而Z S B和F U S分别将每份标本的操作时间减少至7m i n或5m i n,每个额外的菌株只需多出几秒,从而节省了大量时间㊂通常,实验技术人员采用的预处理方法和策略基于他们的经验或实验室标准操作规程,但这种模式可能会导致反复鉴定,给日常工作带来负担,造成时间㊁人员㊁耗材等成本的浪费㊂因此,实验人员需开拓思维,根据情况选择适当的分析前预处理方法,提高MA L D I-T O F M S技术的鉴定效率和准确率㊂3数据库对MA L D I-T O F M S技术鉴定真菌的影响微生物数据库是MA L D I-T O F M S技术鉴定的关键组成部分,菌株识别的准确率主要依靠菌株数据库的功能,尤其是新物种的鉴定对其依赖性更强㊂目前,在临床实验室主要的数据库有布鲁克公司的B i o-t y p e r系统㊁梅里埃公司的V I T E K M S系统和安图生物公司的A u t o f M S系统等㊂现有的数据库均不够完善,临床真菌的鉴定准确率在不同系统之间存在一定差异㊂有研究对各数据库中存在的菌株进行了评价,对于丝状真菌,B i o t y p e r系统进行种㊁属或复合物的鉴定准确率为76.7%,高于V I T E K M S系统的50.0%;对于酵母菌,B i o t y p e r系统的鉴定准确率为82.9%,低于V I T E K M S系统的93.3%㊂对于数据库中不存在的真菌,V I T E K M S系统比B i o t y p e r系统给出了更多的错误识别[10]㊂还有相似的研究也显示,B i o t y p e r系统对酵母菌株物种水平的鉴定率稍逊于V I T E K M S系统[11]㊂最近有研究评估了3种不同的MA L D I-T O F M S系统在鉴定临床丝状真菌方面㊃5012㊃检验医学与临床2023年7月第20卷第14期 L a b M e d C l i n,J u l y2023,V o l.20,N o.14Copyright©博看网. All Rights Reserved.的表现,V I T E K M S系统最具有优势,96.0%菌株鉴定到物种水平,98.4%到属水平;B i o t y p e r系统42.1%菌株鉴定到物种水平,42.9%到属水平;A u t o f M S系统58.7%菌株鉴定到物种水平,60.3%到属水平[12]㊂在鉴定不同物种复合物内的酵母分离物方面, A u t o f M S系统比V I T E K M S系统具有更高的鉴定准确性,在系统密切相关的物种复合物中鉴定不太常见的物种方面,V I T E K M S系统的鉴定能力仍有待提高[13]㊂性能识别方面,A u t o f M S系统与B i o t y p e r系统相当,但A u t o f M S系统在数据库中提供了更多的真菌物种级结果,测试时间大约是B i o t y p e r系统的一半[14],在临床微生物实验室中,能够提供更高的通量㊂在数据库的构建过程中,其覆盖范围㊁类型等至关重要㊂目前有很多机构致力于构建内部参考数据库,以提高MA L D I-T O F M S技术对罕见的㊁新兴的或地方性真菌的识别率㊂MA L D I-T O F M S技术自建库的构建需用数据库中没有的真菌分离株或物种不断扩展和更新,并用其他数据库或者方法相互验证㊂目前由于各实验室相对独立,不同自建库不能够共享,因此,开发可在线获取的参考频谱数据库十分必要㊂在线获取的参考频谱数据库的开发,能促进不同实验室间进行相互验证和补充,达到资源优化和共享,提高MA L D I-T O F M S技术的诊断效率和拓宽应用范围㊂4MA L D I-T O F M S技术在检测抗真菌药敏试验(A F S T)方面的应用现阶段,根据美国临床和实验室标准协会(C L S I)和欧洲抗菌药物敏感试验委员会的指南,A F S T的参考方法为肉汤稀释法,但这种方法需要较长的时间,会延误患者及时抗真菌治疗的时间㊂基于MA L D I-T O F M S技术,对A F S T进行了两种相对较新的尝试:第一种是基于暴露在不同浓度抗真菌药物时真菌图谱的变化,根据得到的复合相关指数(C C I)作出推断[15]㊂第二种是基于MA L D I B i o t y-p e r系统快速测定抗菌药物敏感性试验(M B T A S-T R A),针对不同浓度的抗真菌剂确定感染因子的生长状况,并与提供相对生长比(R G)的无药物对照组比较,通过定义临界值且根据相应抗真菌浓度的R G,将病原体的生长量分类为易感或耐药[16]㊂基于MA L D I-T O F M S技术的A F S T,目前没有广泛应用于临床真菌性疾病的诊断,各实验室仍处于探索研究阶段,一些研究通过C C I获得了很高的诊断值,但这些结果具有一定差异[17-18]㊂V A T A N S H-E N A S S A N等[16]通过采用M B T A S T R A和C L S I指南推荐的肉汤稀释法,比较分析了对卡泊芬净耐药的白色念珠菌和光滑念珠菌的检测数据,验证了M B T A S T R A方法,结果显示,与肉汤稀释法比较,白色念珠菌M B T A S T R A检测的灵敏度和特异度均为100.0%;光滑念珠菌M B T A S T R A检测的灵敏度㊁特异度和有效性分别为94.0%㊁80.0%和95.0%[16]㊂K N O L L等[19]通过M e t a分析,系统评价了基于MA L D I-T O F M S技术检测酵母菌和丝状真菌对唑类和棘白菌素类抗真菌药物的耐药性,与肉汤稀释法比较,基于MA L D I-T O F M S技术的耐药性检测具有91.1%的灵敏度和95.1%的特异度㊂M B T A S T R A 方法的总体灵敏度达到96.0%,优于C C I的85.3%,两种方法的特异度相似,分别为93.2%和94.2%[19]㊂A F S T模式在物种之间可能有较大差异,因此,快速㊁可靠地鉴定真菌耐药性对患者管理及改善预后至关重要[20]㊂A F S T常用方法的周转时间为24~ 48h,M B T A S T R A周转时间在8h以内[19]㊂因此,基于MA L D I-T O F M S技术的A F S T,有望成为临床实验室快速准确检测真菌耐药性的一种方法㊂5展望尽管MA L D I-T O F M S技术在临床真菌诊断领域存在一定局限,但在过去几年中,MA L D I-T O F M S 技术具有的易用性㊁低耗时㊁低成本及高通量等特点改变了临床实践,为临床实验室诊断真菌感染做出了贡献㊂由于新病原体的出现及不断变化的微生物分类学的推动,未来的研究需进一步改进和扩展真菌参考数据库,优化培养和提取蛋白质的标准化操作程序,加强MA L D I-T O F M S技术在真菌药敏试验㊁真菌菌株分型等方面的应用,实时探索临床真菌物种的演变多样性㊂总之,MA L D I-T O F M S技术的发展为真菌病的临床和治疗管理提供了新方向,为个性化医疗提供了巨大潜力㊂参考文献[1]G O N Z A L E Z-V I C E N T M,R AMO S-AMA D O R J T.F u n-g a l i n f e c t i o n i n i mm u n o c o m p r o m i s e d c h i l d r e n[J].R e vI b e r o a m M i c o l,2021,38(2):75-83.[2]S A V A G E R D,F OW L E R R A,R I S HU A H,e t a l.T h ee f f e c t o f i n a d e q u a t e i n i t i a l e m p i r i c a n t i m i c r o b i a l t r e a t m e n to n m o r t a l i t y i n c r i t i c a l l y i l l p a t i e n t s w i t h b l o o d s t r e a m i n-f e c t i o n s:a m u l t i-c e n t r e r e t r o s p e c t i v e c o h o r t s t u d y[J].P L o S O n e,2016,11(5):e0154944.[3]HO U T Y,C H I A N G-N I C,T E N G S H.C u r r e n t s t a t u s o fMA L D I-T O F m a s s s p e c t r o m e t r y i n c l i n i c a l m i c r o b i o l o g y[J].J F o o d D r u g A n a l,2019,27(2):404-414. 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All Rights Reserved.t o u s f u n g a l g r o w t h a n d s a m p l e p r e p a r a t i o n a i m e d a t m o r e c o n s i s t e n t MA L D I-T O F M S s p e c t r a d e s p i t e v a r i a t i o n s i ng r o w t h r a t e s a n d/o r i n c u b a t i o n t i m e s[J].B i o l M e t h o d sP r o t o c,2019,4(1):b p z003.[6]WA N G H,L I Y,F A N X,e t a l.E v a l u a t i o n o f b r u k e r b i o-t y p e r a n d v i t e k M S f o r t h e i d e n t i f i c a t i o n o f c a n d i d a t r o p i-c a l i s o n d i f f e r e n t s o l i d c u l t u r e m e d i a[J].J M i c r o b i o l I m-m u n o l I n f e c t,2019,52(4):604-611.[7]H O N S I G C,S E L I T S C H B,H O L L E N S T E I N M,e t a l.I d e n-t i f i c a t i o n o f f i l a m e n t o u s f u n g i b y M A L D I-T O F m a s s s p e c-t r o m e t r y:e v a l u a t i o n o f t h r e e d i f f e r e n t s a m p l e p r e p a r a t i o n m e t h o d s a n d v a l i d a t i o n o f a n i n-h o u s e s p e c i e s c u t o f f[J].JF u n g i,2022,8(4):383.[8]P E N G D,Z HU X,L I U Y,e t a l.E v a l u a t i o n o f f o r m i c a c i d s a n d w i c h(F A-s a n d w i c h):a p r e t r e a t m e n t m e t h o d f o r f i l a-m e n t o u s f u n g i,f o r t h e i d e n t i f i c a t i o n o f c l i n i c a l l y r e l e v a n t f i l a m e n t o u s f u n g i b y t w o MA L D I-T O F M S s y s t e m s[J].M e d M y c o l,2022,60(4):m y a c018.[9]N I N G Y T,Y A N G W H,Z HA N G W,e t a l.D e v e l o p i n g t w o r a p i d p r o t e i n e x t r a c t i o n m e t h o d s u s i n g f o c u s e d-u l t r a-s o n i c a t i o n a n d z i r c o n i a-s i l i c a b e a d s f o r f i l a m e n t o u s f u n g i i d e n t i f i c a t i o n b y MA L D I-T O F M S[J].F r o n t C e l l I n f e c tM i c r o b i o l,2021,11:687240.[10]L E V E S Q U E S,D U F R E S N E P J,S O U A L H I N E H,e t a l.A s i d e b y s i d e c o m p a r i s o n o f b r u k e r b i o t y p e r a n d V I T E KM S:u t i l i t y o f MA L D I-T O F M S t e c h n o l o g y f o r m i c r o o r-g a n i s m i d e n t i f i c a t i o n i n a p u b l i c h e a l t h r e f e r e n c e l a b o r a t o-r y[J].P L o S O n e,2015,10(12):e0144878.[11]P O R T E L,G A R C I A P,B R A U N S,e t a l.H e a d-t o-h e a dc o m p a r i s o n o f M i c r o f l e x L T a nd V i te k M S s y s t e m sf o rr o u t i n e i d e n t i f i c a t i o n o f m i c r o o r g a n i s m s b y MA L D I-T O Fm a s s s p e c t r o m e t r y i n c h i l e[J].P L o S O n e,2017,12(5): e0177929.[12]S U N Y,G U O J,C H E N R,e t a l.M u l t i c e n t e r e v a l u a t i o n o f t h r e e d i f f e r e n t MA L D I-T O F M S s y s t e m s f o r i d e n t i f i c a-t i o n o f c l i n i c a l l y r e l e v a n t f i l a m e n t o u s f u n g i[J].M e d M y-c o l,2021,59(1):81-86.[13]Y I Q,X I A O M,F A N X,e t a l.E v a l u a t i o n o f A u t o f M S 1000a nd V i te k M S MA L D I-T O F M S s y s t e m i n i d e n t if i-c a t i o n o f c l o s e l y-r e l a t ed ye a s t s c a u s i n g i n v a s i v ef u ng a ld i se a s e s[J].F r o n t C e l l I nf e c t M i c r o b i o l,2021,11: 628828.[14]P A R K J H,J A N G Y,Y O O N I,e t a l.C o m p a r i s o n o f A u-t o f m s1000a n d b r u k e r b i o t y p e r MA L D I-T O F M S p l a t-f o r m s f o r r o u t i n e i d e n t i f i c a t i o n o f c l i n i c a l m i c r o o r g a n i s m s[J].B i o m e d R e s I n t,2021,2021:6667623.[15]P A U L S,S I N G H P,A S S,e t a l.R a p i d d e t e c t i o n o f f l u-c o n a z o l e r e s i s t a n c e i n c a nd i d a t r o p i c a l i s b y MA L D I-T O FM S[J].M e d M y c o l,2018,56(2):234-241. 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maldi-tof ms名词解释

maldi-tof ms名词解释
maldi-tof ms名词解释是：质谱技术(masss pectrometry，MS)是分离和检测带电粒子质荷比的分析技术。

随着离子源及质量分析器技术的变革、质谱仪器设计的快速改进等，质谱技术已成为化学分析领域和生命科学领域非常有效的分析工具，尤其在医学领域的应用越来越为广泛和深入。

基质辅助激光解吸飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry简称MALDI-TOFMS）是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱。

临床微生物实验室开始拥有该设备，并广泛将之用于鉴定大量的细菌和真菌，这种鉴定具有高效性和准确性，而且每次实验的成本很低，已经成为微生物鉴定的热门方法。

关于在MALDI-TOF_MS_技术背景下提高临床微生物检验实习教学能力的探讨

中国卫生产业CHINA HEAL TH INDUSTRY关于在MALDI-TOF MS 技术背景下提高临床微生物检验实习教学能力的探讨林慧珍，李泰阶，黄师，林青，王柏莲，蒋诚传，石姗以广西医科大学附属武鸣医院，广西南宁 530199[摘要] 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry ， MALDI-TOF MS ）技术是临床微生物诊断中的一项革命性创新技术，给临床微生物诊断带来了极大的便利，同时也给临床微生物实习带教带来了新的挑战。

本文阐述了MALDI-TOF MS 技术在临床微生物检验实习带教中的应用探讨，旨在充分运用MALDI-TOF MS 技术结合传统鉴定技术，提高临床微生物检验实习的教学能力。

[关键词] 临床微生物检验；MALDI-TOF MS 技术；实习带教；应用效果；教学能力[中图分类号] R19 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2024）01（b ）-0238-04Discussion on Improving the Practical Teaching Ability of Clinical Micro⁃biological Examination Based on MALDI-TOF MS TechnologyLIN Huizhen, LI Taijie, HUANG Shi, LIN Qing, WANG Bolian, JIANG Chengchuan, SHI ShanyiWuming Hospital Affiliated to Guangxi Medical University, Nanning, Guangxi Zhuang Autonomous Region, 530199 China[Abstract] Clinical microbiology testing is one of the important specialties of clinical medical testing and plays an im⁃portant role in the clinical field. By providing accurate clinical microbiology test results and related suggestions, it pro⁃vides scientific basis for doctors' diagnosis and treatment decisions, thereby improving the accuracy of clinical diagno⁃sis and the effectiveness of treatment. Matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) technology is a revolutionary innovative technology in clinical microbiology diagnosis. It brings great convenience to clinical microbiology diagnosis, but also brings new challenges to clinical microbiology internship teaching. This article elaborated on the application of MALDI-TOF MS technology in teaching clinical microbiology testing practice, aiming to fully utilize MALDI-TOF MS technology combined with traditional identification technologyto improve the teaching ability of clinical microbiology testing practice.[Key words] Clinical microbiology testing; MALDI-TOF MS technology; Practice teaching; Application effect; Teach⁃ing capabilities临床微生物学检验综合了临床医学、免疫学、病原生物学、流行病学和细菌耐药监测等多方面的知识和技能，在临床领域中发挥重要的作用[1]。

MALDITOFMS的原理和应用

MALDITOFMS的应用领域
生物医学研究
MALDITOFMS在生物医学研究中被广泛应用于蛋白质组学、代谢组学和药物分析等领域，可以快速鉴定和定量分析生物样品中的各种分子。
食品安全检测
MALDITOFMS可以用于食品中有害物质的快速检测和鉴定，如农药残留、添加剂和微生物污染物等。
环境监测
MALDITOFMS可以用于环境样品中有机污染物的检测和分析，如水体、土壤和空气中的有机化合物。
MALDITOFMS的原理和应用
MALDITOFMS是一种基于飞行时间质谱的分析技术，能够快速、准确地测定样品中的分子质量。
MALDITOFMS的定义和介绍
MALDITOFMS（Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry）是一种分析技术，利用激光将待测样品与辅助基质混合后进行离子化，然后利用飞行时间质谱仪对离子进行分析。
MALDITOFMS的工作原理
MALDITOFMS的工作原理主要分为基质辅助激光解吸（MALDI）和飞行时间质谱（TOF）两个步骤。首先，样品与基质混合后，激光瞬间加热样品，使样品中的分子离子化。然后，离子通过电场加速器，以相同的初速度进入飞行时间质谱仪，最终根据离子的质荷比在检测器上形成质谱图。
MALDITOFMS在环境监测中的应用
MALDITOFMS可以用于环境样品中有机污染物的检测和分析，如水体、土壤和空气中的有机化合物。这有助于评估环境质量，保护生态平衡。
MALDITO展和改进，进一步提高分析速度、灵敏度和分辨率。未来，它有望在更广泛的领域得到应用，为科学研究和社会发展做出更大的贡献。

MALDI-TOF MS直接鉴定血培养阳性病原的临床应用

文章编号：1673-8640（2021）04-0424-06 中图分类号：R446.1 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2021.04.016 MALDI-TOF MS直接鉴定血培养阳性病原的临床应用侯伟伟，江　涟，李　冬（同济大学附属同济医院检验科，上海 200065）摘要：目的　了解基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）直接快速检测血培养报阳样本的可行性。

方法　收集同济大学附属同济医院报阳血培养样本682例，从血培养瓶直接抽取血液至分离胶采血管离心富集细菌后，采用MALDI-TOF MS进行直接鉴定（快速质谱法）。

同时对报阳血培养标本进行涂片镜检及转种培养后，分别采用Vitek 2 Compact自动化鉴定药敏仪及MALDI-TOF MS对培养菌落进行鉴定，比较两者鉴定结果的一致性，结果不一致的菌株采用16S rDNA基因测序进行验证。

结果　682例血培养阳性样本中，有664例检出单数菌，其中539例（81.2%）快速质谱法可准确鉴定（种/属），122例（18.4%）未鉴定出（种/属），仅3例（0.5%）鉴定错误，分别为泛菌属、肺炎克雷伯菌和头状葡萄球菌。

664株菌株中，革兰阴性菌367株，革兰阳性菌286株，念珠菌11株，以转种培养后质谱鉴定结果为标准，革兰阴性菌、革兰阳性菌、念珠菌快速质谱法的鉴定准确率（种/属）分别为85.8%/6.0%、65.0%/3.1%、63.6%/0；革兰阴性杆菌的鉴定准确率显著高于革兰阳性球菌和真菌，差异有统计学意义（χ2=57.967，P<0.01；χ2=7.21，P<0.05）。

革兰阴性菌中，肠杆菌科、非发酵菌及其他革兰阴性菌鉴定准确率（种/属）分别为89.0%/5.0%、65.0%/10.0%、66.7%/22.2%。

革兰阳性菌中，葡萄球菌属、肠球菌属、链球菌属和其他革兰阳性菌鉴定准确率（属/种）分别为70.9%/1.1%、71.4%/2.4%、40.5%/10.8%、50%/7.1%。

MALDI-TOF-MS技术及应用

线性模式（reflection）
反射模式下TOF的分辨率高于线性模式
Bruker公司仪器示意图
ABI公司仪器示意图
岛津公司仪器示意图
Detector
Helium collision cell for fragment generation
Ion gate for parent ion selection
MALDI TOF MS的构成
variable attenuator laser
trigger diode
1.8 m linear
250 l/s turbo
检测器2：反射模式
250 l/s turbo
检测器1：线性模式
线性模式和反射模式
反射模式（linear） 1. 一般测试分子量小于4000的样品 2. 分辨率高，单同位素清晰准确 1. 一般测试大分子量样品（M>4000） 2. 分辨率低，得到是平均分子量的质荷比
E：离子在加速电场获得的动能; U：加速电场电压 z：离子所带电荷; v：离子飞行速度; t：离子飞行时间; m：离子质量 L：飞行管道长度 c：常数
质量分析范围：500Da---100KDa
1.3 MALDI-TOF-MS质谱的分析步骤
1：基质与多肽样本共同置于刚靶上。
3. 多肽离子在TOF管里飞行，飞行速度取决于多肽离子的M/Z的大小
Matrix - CHCA
常用基质及选择
基质
HCCA
样品
蛋白，多肽，糖，小分子，极性聚合物
DHB
HPA Dithranol IAA
蛋白，多肽，糖，小分子，极性聚合物
核苷酸非极性聚合物非极性聚合物
MALDI-TOF质谱的原理

MALDI-TOF-MS快速鉴别MRSA和MSSA的应用研究

MALDI-TOF-MS快速鉴别MRSA和MSSA的应用研究白秀伟;王立丽;刘晓一;凌云映;祁小真;刘建晖【期刊名称】《检验医学与临床》【年(卷),期】2022(19)S01【摘要】目的探讨基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)快速鉴别甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)及甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)的可行性,为临床提供一种快速简便的方法,方便指导临床用药。

方法用MALDI-TOF-MS鉴定的48株金黄色葡萄球菌,经Kirby-Bauer法确认为MRSA 和MSSA后,从仪器上查看各个菌株的特征峰,再利用SPSS软件对特征峰进行聚类分析,最终随机选取59株金黄色葡萄球菌对其外部验证符合率。

结果Kirby-Bauer 法耐药性检测显示16株是MSSA,32株是MRSA,48株菌株的特征峰经过SPSS 软件聚类分析后,聚类为2类,能够将MRSA和MSSA区分开来,外部验证的59株金黄色葡萄球菌结果符合率MRSA 72.97%(27/37),MSSA 68.18%(15/22)。

结论MALDI-TOF-MS能够快速鉴别MRSA和MSSA,为临床提供一种新的快速鉴别方法。

【总页数】3页(P100-102)【作者】白秀伟;王立丽;刘晓一;凌云映;祁小真;刘建晖【作者单位】北京华信医院检验科【正文语种】中文【中图分类】R44【相关文献】1.微流控LAMP芯片构建及在MRSA快速检测中的应用研究2.鸡肿瘤病快速鉴别诊断试剂盒及其应用研究3.羊肉掺假鉴别快速荧光定量PCR芯片制备及应用研究4.实时荧光定量聚合酶链反应快速检测MRSA的应用研究5.B型钠尿肽快速检测在急诊科呼吸困难患者鉴别诊断中的临床应用研究因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

MALDI—TOF生物质谱成像技术的进展

以及标志物的鉴定等方面［。灵敏度和分辨率主１］
重要的环节，也是近年来各国研究者和质谱仪器厂商研究的热点。目前，质喷涂的方式包括手动气基
要受激光器频率和能量、样本切片质量、质喷涂效基果等因素影响。高频率（０Ｈｚ和１０Ｈｚ的固体２０００）激光器已经普遍用于ＭＡＬ质谱中，在较短时ＤＩ可
２基质喷涂设备
提高基质喷涂技术的重复性，获得分布均匀和大小合适的基质结晶颗粒是提高质谱图像灵敏度和
分辨率的重要手段，ＭＡＬＩＩ是Ｄ — ＭＳ样品处理中最
发展主要在改善灵敏度、高分辨率、提扩大应用范围
摘
要
随着书基一ＭＡＬＤＩＴＯＦ等生物质谱仪器性能的提升和应用领域的扩大，于ＭＡＬＤＩ的质谱成像技术已成啦带— 蒂综一述一
为研究肿瘤标志物、物代谢、药脂类分布等方面的有力手段。最新样品前处理方法以及自动化基质喷涂等技术的发
会导致每次喷雾的均匀度、厚度不一致，次喷雾也多容易导致重结晶位置发生变化。近年我们探索了新型的质谱成像基质喷雾器，其特征在于：
（）喷雾调节室带有一个可调节气流的入口和１
一
多肽分布，近年来研究对象涵盖到了脂类、分子药小
质覆盖一直是ＩＭＳ的一个技术瓶颈。近年来，些一

探索MALDI-TOF MS技术及其在食品微生物检测方面的应用

FOOD INDUSTRY I THEORY探索MALDI-TOF MS技术及其在食品微生物检测方面的应用文I李晓萌周长民沈阳市食品药品检验所摘要：MALDI-TOF MS技术是一种新型工具，可以使用该工具来检测生物大分子，具有较多优势，如准确性较高、通量较高、所需成本较低等。

然而，在食品微生物检测方面，该技术仍存在一定的不足。

基于此，本文对MALDI-TOF MS技术进行了分析，对MALDI-TOF MS技术在食品微生物检测方面的应用进行了探讨，希望能帮助到相关人士。

关键词：MALDI-TOF MS技术；微生物检测；飞行时间质谱引言：最近几年以来，MALDI-TOF MS 技术取得较快发展，其是一种软电离技术方法，MALDI-TOF MS技术的出现，促使传统的质谱技术得以变革，MALDI-TOF MS技术可筛选生物大分子（如多肽以及蛋白质等）的高通量，亦可对寡核晋酸与基因多态性进行分析，该技术具有以下优点：不会打碎分子；可检测的范围较宽，最大范围可达400kDa；可对混合物进行检测；对盐有着较强的容忍性。

因此，MALDI-TOF用于多方面，如蛋白子组学以及临床医学等。

1.MALDI-TOF MS技术原理MALDI-TOF MS技术由MALDOI 技术以及TOF MS（飞行时间质谱）组合而成。

对于MALDOI际而言，其原理主要基于基质与待测物的混合，并且包围基质，通过共结晶薄膜，由于待测物浓度低于基质浓度，脱部分麒能量被基质分子吸收，竝转進气态，促使基质离子的形成，在基质离子与待测物碰撞的过程中，待测物被离子化，在此过程中，高分子并不会断裂，常常只形成分子、离子或者其多聚体。

对于TOFMS原理而言，是基于飞行距离以及加速电压，待测物质的m/z（m表示待测物质的质子数，z表示待测物质的电荷数）与飞行时间的平方成正比例关系。

在电场的作用下，生物大分子以较快的速度通过飞行管道，依据达到的离子数目与检测时间，得到峰强度值的图谱，以此被分析器检测。

vitek maldi-tof ms技术在临床分离诺卡菌快速鉴定中的简易流程优化

㊀２０１９,３５(１１)中国人兽共患病学报C h i n e s e J o u r n a l o f Z o o n o s e sD O I :１０．３９６９/j．i s s n ．１００２－２６９４．２０１９．００．１６９论㊀著V I T E K M A L D I ＧT O F M S 技术在临床分离诺卡菌快速鉴定中的简易流程优化王㊀鹏,隗㊀明,杨春霞,谷㊀丽国家科技重大专项资助(N o ．２０１５Z X １０００３００３)通讯作者:谷㊀丽,E m a i l :gu l i ２０１３２２７＠f o x m a i l ．c o m ;O R C I D :００００Ｇ０００２Ｇ３３１８Ｇ３９０２作者单位:首都医科大学附属北京朝阳医院感染和临床微生物科,北京㊀１０００２０摘㊀要:目的㊀本研究利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱ＧV I T E K MA L D I ＧT O F M S ,对临床分离诺卡菌进行快速㊁准确㊁简易的菌种鉴定.方法㊀对４６株临床分离的诺卡菌进行研究,以１６Sr R N A 和g y r B 基因测序结果为参考标准,探索V I T E K MA L D I ＧT O F M S 技术在诺卡菌菌种鉴定程序中的关键步骤,优化鉴定流程.结果㊀４６株诺卡菌共有４３(９３．５％)株可鉴定至种水平,４５(９７．８％)株可鉴定至属水平.对分离率最高的盖尔森基兴诺卡菌和鼻疽诺卡菌的鉴定率更是高达１０００％(２２/２２和７/７株).结论㊀实验结果表明,V I T E K MA L D I ＧT O F M S 技术可以实现对临床分离诺卡菌的快速㊁准确鉴定,简易鉴定流程为广泛应用于临床微生物实验室提供了重要基础保障.关键词:基质辅助激光解析电离飞行时间质谱;诺卡菌;快速鉴定;简易流程中图分类号:R ３７９．１㊀㊀㊀文献标识码:A ㊀㊀㊀文章编号:１００２－２６９４(２０１９)１１－０９８９－０７S i m p l i f i e d p r o c e d u r e s o fV I T E K M A L D I ＧT O F M S i n r a p i d i d e n t i f i c a t i o no f N o c a r d i a i n c l i n i cWA N GP e n g ,W E IM i n g,Y A N GC h u n Ｇx i a ,G U L i (B e i j i n g C h a o Ｇy a n g H o s p i t a l ,C a p i t a lM e d i c a lU n i v e r s i t y ,D e p a r t m e n t o f I n f e c t i o u sD i s e a s e s a n dC l i n i c a lM i c r o b i o l o g y ,B e i j i n g １０００２０,C h i n a )A b s t r a c t :T h e s p e c i e s i d e n t i f i c a t i o no f N o c a r d i a i sc h a l l e n g i n g d u e t or a p i d l y e v o l v i n g t a x o n o m y ．I nt h es t u d y,MA L D I ＧT O F M S (m a t r i x Ｇa s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n /i o n i z a t i o nm a s s s p e c t r o m e t r y )a s a n a d v a n c e d p r o t e o m i c t e c h n o l o g y wa s u s e d f o r i Ｇd e n t i f i c a t i o no f c l i n i c a l N o c a r d i a i s o l a t e s ．At o t a l o f ４６N o c a r d i a i s o l a t e sw e r e i s o l a t e d f r o mc l i n i c a l s p e c i m e n s i nt h e s t u d y ．M o l e c u l a r i d e n t i f i c a t i o no f N o c a r d i a s p p ．w a s p e r f o r m e du s i n gp a r t i a l １６Sr R N Aa n d g y r B g e n es e qu e n c e sa st h er e f e r e n c e s t a n d a r d ．N o c a r d i a s p e c i e s i d e n t i f i c a t i o nb y V I T E K MA L D I ＧT O F M S w a se x p l o r e d ．A sr e s u l t s ,f o r t y Ｇt h r e eo f ４６(９３．５％)N o c a r d i a i s o l a t e s c o u l db e i d e n t i f i e d t os p e c i e s Ｇl e v e l ,w h i l e４５(９７．８％)i s o l a t e s c o u l db e i d e n t i f i e dt o g e n u s Ｇl e v e l ．T h em o s t f r e q u e n t l y e n c o u n t e r e d s p e c i e s ,N．c y r i a c i g e o r g i c a a n dN．f a r c i n i c aw e r e a l l i d e n t i f i e dw i t h１００．０％a c c u r a c y (２２/２２a n d７/７)．T h e r e s u l t sm e n t i o n e da b o v e i n d i c a t e d t h a t a r a p i d ,a c c u r a t e ,a n d s i m p l i f i e d p r o c e d u r e o f N o c a r d i a s p e c i e s i d e n t i f i c a t i o n c a n b e a c c o m p l i s h e db y V I T E K MA L D I ＧT O F M S ,a n dw i l l b eu s e d i n c l i n i c a lm i c r o b i o l o g y l a b o r a t o r i e s ．K e yw o r d s :m a t r i x Ｇa s s i s t e d l a s e rd e s o r p t i o n /i o n i z a t i o n Ｇt i m eo f f l i g h tm a s ss p e c t r o m e t r y ;N o c a r d i a ;r a p i di d e n t i f i c a t i o n ;s i m pl i f i e d p r o c e d u r e s S u p p o r t e db y t h eN a t i o n a l S c i e n c e a n dT e c h n o l o g y M a j o rP r o j e c t (N o ．２０１５Z X １０００３００３)C o r r e s p o n d i n g a u t h o r :G uL i ,E m a i l :gu l i ２０１３２２７＠f o x m a i l ．c o m ㊀㊀诺卡菌广泛存在于环境当中,在河流,土壤,灰尘,腐败物和动物粪便均可作为腐生菌被发现[１].目前,有相当一部分比例的诺卡菌种可以引起人类感染,尤其以免疫低下的病人为主[２Ｇ３].肺诺卡菌病是人感染诺卡菌最常见的致病类型[１].自从磺胺被引入到临床治疗诺卡菌感染以来,诺卡菌的致死率急剧下降,如脑脓肿㊁肺部感染及皮肤和软组织感染治愈率分别达到５０％㊁９０％,和１００％[４].然而近年来诺卡菌病发生率为年０．４７~２．０２/１０万[３,５Ｇ６]和死９８９亡率(３１％~４０％)㊁以及诺卡菌磺胺耐药率(２％~４３％)[７]逐步增加,因此诺卡菌感染成为一个不容忽视的问题.对于大多数临床微生物实验室而言,诺卡菌的药敏试验不能常规开展,临床医生只能根据治疗经验用药.然而据国外大多数文献报道,不同种的诺卡菌具有不同的药敏模式[８Ｇ１１].所以在实验室进行诺卡菌菌种的鉴定,对临床医生准确用药具有非常重要的意义.如今,经典的生物化学鉴定方法不仅费时费力,而且随着诺卡菌菌种库的不断扩大,分辨不同种的能力也受到了很大程度限制;１６Sr R N A测序方法虽然是菌种鉴定的金标准,但此方法工作量大且技术复杂,目前大多数临床微生物实验室不具备常规开展测序工作的资源和能力[１２],而且目前针对于诺卡菌鉴定的荧光定量P C R尚无商业化产品.基于以上几点原因,在临床微生物实验室常规开展诺卡菌的菌种鉴定存在较大挑战.近年来,MA L D IＧT O F M S由于其快速㊁准确㊁灵敏㊁自动化及高通量等特点,在微生物鉴定中的应用发展迅猛.根据国外文献报道,德国布鲁克公司的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(B r u k e rMA L D IＧT O F M S)在诺卡菌菌种鉴定中的应用已占据一席之地[１３Ｇ１５].而法国梅里埃公司的V I T E K MA L D IＧT O F M S在该菌种鉴定上起步较晚,尚需进一步对临床分离诺卡菌进行菌种鉴定能力的评估[１６].虽然两家公司MA L D IＧT O F M S技术对于诺卡菌的菌种鉴定均已起步,但是其复杂的蛋白提取过程,以及昂贵的试剂耗材,都是阻碍其在微生物实验室广泛开展的不利因素.在本研究中,我们在诺卡菌鉴定通用流程基础上,通过探索诺卡菌V I T E K MA L D IＧT O F M S 鉴定的影响因素和关键步骤,发展了一个快速㊁准确并且廉价㊁操作简易的诺卡菌菌种鉴定方法,为其在临床微生物实验室常规开展提供了重要基础保障.１㊀材料和方法１．１㊀标本来源及实验流程㊀收集北京朝阳医院自２０１１年１月至２０１８年６月期间临床分离的革兰染色阳性分枝状串珠样,并且弱抗酸染色阳性的疑似诺卡菌４６株,将其分纯培养后分别进行１６Sr R N A 和g y r B两个基因片段测序,而后与G e n B a n k中的模式菌比对,将最佳匹配结果作为参考标准;将不同菌龄(早期菌落和典型菌落)菌株分别用两种不同的样本处理方法进行V I T E K MA L D IＧT O F M S鉴定,结果与参考标准对比,实验流程如图１所示.早期菌落为仅一区有明显生长,不同菌种间略有差异,通常在４８h以内;典型菌落为三区均有生长,且第三区有单一菌落形态,培养时长在４８h 以上.㊀㊀∗根据C L S IMM１８对于１６S r R N A基因序列鉴定细菌的标准:待测菌序列与模式菌对比,相似度ȡ９９．０％且与其他种相似度之差大于０．８％,才能鉴定到种,相似度ȡ９９．０％与其他种相似度之差差值小于０．８％,只能鉴定到属或多个种;相似度＜９９．０％,可能为新种[１７].图１㊀V I T E K M A L D IＧT O F M S对诺卡菌的鉴定性能研究及关键步骤探索流程图F i g．１㊀F l o wd i a g r a mo fN o c a r d i a i d e n t i f i c a t i o na b i l i t y a n dk e y s t e p s e x p l o r a t i o nb y V i t e k M A L D IＧT O F M S０９９中国人兽共患病学报２０１９,３５(１１)１．２㊀１６Sr R N A 和g y r B 测序㊀用１μL 接种环取一环纯菌落完全分散在１００μL 去离子水中(若菌落干燥可用研磨器分散),１００ħ沸水浴１０m i n ,１０６２５g 离心１０m i n ,取上清作为模板.P C R 反应体系:１７３μL 去离子水;２．５μL １０ˑE x T a qT M B u f f e r (M g ２＋pl u s )(T a K a R a B i o ,日本);２μL d N T P M i x t u r e (T a K a R aB i o );０．５μL 正向引物(１０μm o l /L )和０．５μL 反向引物(１０μm o l /L );０．２μLE xT a q T M (T a K a R aB i o )和２μL 模板.应用G e n e A m p ʻRP C R S y s t e m ９７００(A p p l i e d B i o s ys Ｇt e m s ,美国)扩增,条件设置为:酶在９５ħ下活化５m i n ,随后将下一过程循环３５次:９５ħ变性１５s ,５６ħ退火２０s ,７２ħ延伸２０s ,最后在７２ħ下延伸７m i n .使用A B I ３７３０X LD N A 测序仪(A p p l i e dB i o Ｇs ys t e m s )对P C R 产物进行双向测序.１６S r R N A 引物序列:正向５ᶄＧG C T T A A C A C A T G C A A G T C G Ｇ３ᶄ,反向５ᶄＧG A A T T C C A G T C T C C C C T G Ｇ３ᶄ;g yr B 引物序列:正向５ᶄＧC T T C G C C A A C A C C A T C A A C A C Ｇ３ᶄ,反向５ᶄＧT G A T G A T C G A C T G G A C C T C G Ｇ３ᶄ.使用L a s e r ge n e７．１(D N A S T A R ,I n c ．,M a d i Ｇs o n ,W I )中的S e qM a n 程序拼接序列.使用B L A S Tv ．２．２．１０,将每株诺卡菌的部分１６Sr R N A 和g y r B 序列与G e n B a n k 数据库中的模式菌株序列进行比较,以序列最大的相似性鉴定至菌种水平.１．３㊀V I T E K MA L D I ＧT O F M S 质谱鉴定㊀将待测菌分别接种到两块哥伦比亚血平板(天津金章)中,３７ħ恒温恒湿温箱孵育,早期菌落和典型菌落分别进行如下操作,流程如图２所示.(A )提蛋白,(B )直接涂布法,(C )菌悬液涂布法图２㊀诺卡菌鉴定流程F i g ．２㊀P r o c e d u r e s o f N o c a r d i a i d e n t i f i c a t i o nb y Vi t e k M A L D I ＧT O F M S １９９１１期王㊀鹏,等:V I T E K MA L D I ＧT O F M S 技术在临床分离诺卡菌快速鉴定中的简易流程优化㊀㊀提蛋白M S 鉴定流程:在安全柜中用１μL 接种环取一环待测菌加入含５００μL ７０％乙醇(T h e r m o F i s h e rS c i e n t i f i c ,美国,质谱纯)的磨菌瓶中(b i o M ér i e u x ,法国)(E p pe n d o rf 管中内有０．５mm 玻璃珠),水平震荡仪震荡５m i n 直到细菌均匀在酒精中,室温放置１０m i n ,将菌悬液转入１．５m LE p Ｇpe n d o rf 管中,１０６２５g 离心２m i n ,弃上清,向沉淀中加入１０μL７０％甲酸(b i o M ér i e u x ,法国)吹吸沉淀室温放置５m i n ,加入１０μL 乙腈(T h e r m oF i s h Ｇe rS c i e n t i fi c ,美国,质谱纯)混匀,１０６２５g 离心２m i n ,取１μL 上清双孔位涂于靶板,待完全干燥加入１μLC H C A 基质(b i o M ér i e u x,法国),完全干燥后进行V I T E K M S 分析.直接涂布法M S 鉴定流程:将易分散早期菌落直接双孔位涂布于靶板上,加入１．５μL C H C A 基质,完全干燥后进行V I T E K M S 分析;菌悬液涂布法M S 鉴定流程:将不易分散的菌落用提蛋白M S 鉴定流程中的方法分散后,将菌悬液涂布在靶板上,待完全干燥后做M S 分析.结果判读:若双孔位鉴定结果一致,直接报告鉴定结果(种㊁复合群);若双孔位结果不一致时,则重复鉴定３次,选取鉴定率＞６０％且至少出现３次的结果;如果无鉴定结果,则待测菌株无法鉴定.２㊀结㊀果２．１㊀１６S r R N A 和g y r B 测序结果㊀将１６Sr R N A 和g y r B 序列与G e n B a n k 数据库中的模式菌株序列进行比较,４６株菌均为诺卡菌属,其中分离率最高的是盖尔森基兴诺卡菌(N ．c y r i a c i g e o r g i c a )２２株,占比４７．８％,其次分别为鼻疽诺卡菌(N ．fa r Ｇc i n i c a )７株(１５．２％),脓肿诺卡菌(N ．ab sc e s s u s )５株(１０．９％),北京诺卡菌(N ．b e i j i n g e n s i s )４株(８７％),华莱士诺卡菌(N ．w a l l a c e i )３株(６．５％),豚鼠耳炎诺卡菌(N ．o t i t i d i s c a v i a r u m )３株(６５％),新星诺卡菌(N ．n o v a )和亚洲诺卡菌(N ．a s i a t i c a )各１株(２．２％).２．２㊀V I T E K MA L D I ＧT O F M S 诺卡菌鉴定结果㊀使用早期菌落做M S 鉴定,成功鉴定到种４３株(表１),鉴定率均为９９．９％,多于使用典型菌落鉴定到种的３９株,区别在于c y ０１㊁c y ０２㊁c y ３４和c y３５共４株菌,典型菌落鉴定均无结果,分别对应２株北京诺卡菌和２株华莱士诺卡菌;编号c y ４５测序结果为新星诺卡菌,不同菌龄结果无差别,只能鉴定到复合群水平,与同为新星诺卡菌复合群的非洲诺卡菌鉴定率各占５０％;编号c y ４６是一株亚洲诺卡菌,M S 无鉴定结果.提蛋白与菌落直接涂布两种不同的前处理方法对早期菌落进行M S 鉴定时,结果完全一致,都能够将４６株菌中的４３株菌成功鉴定到种,占所有分离菌的９３．５％,包括全部鼻疽诺卡菌(７株)㊁盖尔森基兴诺卡菌(２２株)㊁华莱士诺卡菌(３株)㊁脓肿诺卡菌(５株)和豚鼠耳炎诺卡菌(３株),４株北京诺卡菌中的３株也成功鉴定到种,且每一株鉴定率均高达９９９％;编号c y０３的北京诺卡菌双孔位鉴定重复多次,鉴定率均ɤ５０％,北京诺卡菌与脓肿诺卡菌二选一或者加上巴西诺卡菌三选一.表１㊀不同前处理方法和不同时期菌落V I T E K M A L D I ＧT O F M S 对诺卡菌的鉴定结果T a b ．１㊀I d e n t i f i c a t i o no fN o c a r d i ab y VI T E K M A L D I ＧT O F M Sw i t hd i f f e r e n t p r e t r e a t m e n tm e t h o d s a n d i nd i f f e r e n t g r o w t h s t a ge s 编号参考标准早期菌落(＜４８h )M S 鉴定结果典型菌落(＞４８h )M S 鉴定结果提蛋白直接涂布提蛋白菌悬液涂布c y ０１N ．b e i j i n g e n s i s N ．b e i j i n g e n s i s N ．b e i j i n g e n s i s n o i d n o i d c y ０２N ．b e i j i n g e n s i s N ．b e i j i n ge n s i s N ．b e i j i n ge n s i s n o i d n o i d c y ０３N ．b e i j i n g e n s i s N ．b e i j i n ge n s i s /N ．a b s c e s s u s o rN ．b e i j i n ge n s i s /N ．a b s c e s s u s/N ．b r a s i l i e n s i s N ．b e i j i n ge n s i s /N ．a b s c e s s u s o rN ．b e i j i n ge n s i s /N ．a b s c e s s u s/N ．b r a s i l i e n s i s n o i dn o i d c y ０４N ．b e i j i n g e n s i s N ．b e i j i n g e n s i s N ．b e i j i n g e n s i s N ．b e i j i n g e n s i s n o i dc y ０５N ．f a r c i n i c a N ．f a r c i n i c a N ．f a r c i n i c a N ．f a r c i n i c a N ．f a r c i n i c a c y ０６N ．f a r c i n i c a N ．f a r c i n i c a N ．f a r c i n i c a N ．f a r c i n i c a N ．f a r c i n i c a c y０７N ．fa r c i n i c a N ．fa r c i n i c a N ．fa r c i n i c a N ．fa r c i n i c a N ．fa r c i n i c a ２９９中国人兽共患病学报２０１９,３５(１１)表１(续)编号参考标准早期菌落(＜４８h )M S 鉴定结果典型菌落(＞４８h )M S 鉴定结果提蛋白直接涂布提蛋白菌悬液涂布c y ０８N ．f a r c i n i c a N ．f a r c i n i c a N ．f a r c i n i c a N ．f a r c i n i c a N ．f a r c i n i c a c y ０９N ．f a r c i n i c a N ．f a r c i n i c a N ．f a r c i n i c a N ．f a r c i n i c a N ．f a r c i n i c a c y １０N ．f a r c i n i c a N ．f a r c i n i c a N ．f a r c i n i c a N ．f a r c i n i c a N ．f a r c i n i c a c y １１N ．fa r c i n i c a N ．f a r c i n i c a N ．f a r c i n i c a N ．f a r c i n i c a N ．fa r c i n i c a c y １２N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a c y １３N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a c y １４N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a c y １５N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a c y １６N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a c y １７N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a c y １８N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a c y １９N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a c y ２０N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a c y ２１N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a c y ２２N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a c y ２３N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a c y ２４N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a c y ２５N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a c y ２６N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a c y ２７N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a c y ２８N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a c y ２９N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a c y ３０N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a c y ３１N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a c y ３２N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a N ．c y r i a c i g e o r g i c a c y ３３N ．c y r i a c i g e o r gi c a N ．c y r i a c i g e o r gi c a N ．c y r i a c i g e o r gi c a N ．c y r i a c i g e o r gi c a N ．c y r i a c i g e o r gi c a c y ３４N ．w a l l a c e i N ．w a l l a c e i N ．w a l l a c e i n o i d n o i d c y ３５N ．w a l l a c e i N ．w a l l a c e i N ．w a l l a c e i n o i dn o i dc y ３６N ．w a l l a c e i N ．w a l l a c e i N ．w a l l a c e iN ．w a l l a c e iN ．w a l l a c e ic y ３７N ．a b s c e s s u s N ．a b s c e s s u s N ．a b s c e s s u s N ．a b s c e s s u s N ．a b s c e s s u s c y ３８N ．a b s c e s s u s N ．a b s c e s s u s N ．a b s c e s s u s N ．a b s c e s s u s N ．a b s c e s s u s c y ３９N ．a b s c e s s u s N ．a b s c e s s u s N ．a b s c e s s u s N ．a b s c e s s u s N ．a b s c e s s u s c y ４０N ．a b s c e s s u s N ．a b s c e s s u s N ．a b s c e s s u s N ．a b s c e s s u s N ．a b s c e s s u s c y ４１N ．a b s c e s s u sN ．a b s c e s s u s N ．a b s c e s s u s N ．a b s c e s s u s N ．a b s c e s s u sc y ４２N ．o t i t id i s c a v i a r u m N ．o t i t i d i s c a v i a r u m N ．o t i t i d i s c a v i a r u m N ．o t i t i d i s c a v i a r u m N ．o t i t i d i s c a v i a r u m c y ４３N ．o t i t i d i s c a v i a r u m N ．o t i t i d i s c a v i a r u m N ．o t i t i d i s c a v i a r u m N ．o t i t i d i s c a v i a r u m N ．o t i t i d i s c a v i a r u m c y ４４N ．o t i t i d i s c a v i a r u mN ．o t i t i d i s c a v i a r u mN ．o t i t i d i s c a v i a r u mN ．o t i t i d i s c a v i a r u mN ．o t i t i d i s c a v i a r u mc y ４５N ．n o v a N ．n o v a/N ．a fr i c a n a N ．n o v a/N ．a fr i c a n a N ．n o v a/N ．a fr i c a n a N ．n o v a/N ．a fr i c a n a c y４６N ．a s i a t i c a n o i dn o i dn o i dn o i d㊀㊀N ．c y r i a c i g e o r g i c a ,盖尔森基兴诺卡菌;N ．f a r c i n i c a ,鼻疽诺卡菌;N ．a b s c e s s u s ,脓肿诺卡菌;N ．b e i j i n g e n s i s ,北京诺卡菌;N ．w a l l a c e i ,华莱士诺卡菌;N ．o t i t i d i s c a v i a r u m ,豚鼠耳炎诺卡菌;N ．n o v a ,新星诺卡菌;N ．a s i a t i c a ,亚洲诺卡菌;N ．b r a s i l i e n s i s ,巴西诺卡菌;n o i d,无鉴定结果３９９１１期王㊀鹏,等:V I T E K MA L D I ＧT O F M S 技术在临床分离诺卡菌快速鉴定中的简易流程优化３㊀讨㊀论与临床致病相关的诺卡菌菌种水平鉴定虽然具有挑战性,但不同诺卡菌种有不同的药敏模式[８Ｇ１１],鉴定至菌种水平显得尤为重要.为探索V i t e k MA L D IＧT O F M S鉴定诺卡菌方法是否可靠,我们收集了４６株临床分离株验证其鉴定性能.首先我们将典型的细菌菌落(分纯培养３d后)按照梅里埃公司提供的标准化操作程序(S O P)要求,使用甲酸和乙腈提取蛋白后进行M S分析,得到８４．８％(３６/４３)的菌种水平鉴定率.通过与参考标准方法比较我们发现该方法对于北京诺卡菌和华莱士诺卡菌鉴定性能较差.大多数诺卡菌都是干燥不易分散的,尤其北京诺卡菌和华莱士诺卡菌还有噬琼脂现象,这更增加了制备菌悬液提取蛋白的难度.在分纯培养的过程中我们发现,培养早期的菌落容易从培养基上刮下,所以我们采用标准的甲酸㊁乙腈提取蛋白制备方法采用年轻 (培养时间＜４８h)菌落制备样品进行鉴定.相较于典型菌落(培养时间＞４８h),菌种水平鉴定率从８４．８％提高到９３．５％(４３/４６).该结果标明,菌龄小于４８h的鉴定结果显著优于菌龄大于４８h的菌种鉴定结果.所以菌龄是诺卡菌鉴定中的关键因素之一,其与K h o t等和M c T a gＧg a r t等的研究结果一致[１３,１８],具体的机制还需进一步深入研究.和大多数诺卡菌不同,鼻疽诺卡菌湿润易分散,直接用接种环就能将其均匀涂布在靶板上,和其他常见菌一样,直接加C H C A基质,６株鼻疽诺卡菌全部鉴定到种.受鼻疽诺卡菌启发,我们将不同菌龄的诺卡菌采用非提蛋白Ｇ即直接将菌或菌悬液涂于靶板做M S鉴定,结果如表１所示:＜４８h直接涂布鉴定结果与提蛋白鉴定结果完全一致;＞４８h菌悬液涂板鉴定和提蛋白鉴定结果相比,仅有一株北京诺卡菌无鉴定结果,该结果是否提蛋白并不是诺卡菌鉴定的关键步骤,所以诺卡菌V I T E K MA L D IＧT O F M S鉴定中提取蛋白过程可以省略.基于采用早期菌落和省略提取蛋白过程,使诺卡菌鉴定通用流程发展成为一个更加简单㊁经济㊁快速的鉴定流程.选取早期菌落直接涂布法,省去了机械分散破碎的过程,节约了甲酸㊁乙腈提取蛋白的成本,更重要的是减少培养时间,更早地为临床提供病原学结果.该研究结果显示,采用本文鉴定流程,诺卡菌菌种鉴定率为９３．５％,与先前的报道略有提高.有报道称,在商业数据库的基础上结合其内部相关数据,可以获得更高的鉴定率[１９].目前,我们使用的V I T E K MA L D IＧT O F M S V３．０的鉴定库包含１５种诺卡菌,亚洲诺卡菌不在其中,后期随着我们分离的诺卡菌菌种和数量的增多,建立本中心的诺卡菌数据库具有重要意义.相较于测序方法,V I T E K MA L D IＧT O F M S操作方法简单,数据分析采用自动化方案(所测峰图与数据库中标准菌株峰图比对),菌种鉴定所需时间短(２０~３０m i n);但数据库中仅有常见致病菌种数据,所以对于不常见诺卡菌致病菌种,还需要借助于测序方法进行鉴定.目前V I T E K MA L D IＧT O F M S采用提取蛋白鉴定流程还广泛应用于结核分枝杆菌㊁其他需氧放线菌以及丝状真菌等不易分散的干燥菌落,均采用标准鉴定流程[２０Ｇ２２],是否可以忽略提取蛋白步骤尚无相关报道,有待进一步验证.V I T E K MA L D IＧT O F M S技术在诺卡菌快速鉴定中具有重要的应用价值.当然,未来只有进一步优化相关样品处理方法,完善鉴定数据库,才能使V I T E K MA L D IＧT O F M S技术更广泛的应用于临床微生物实验室,更好地服务于医生进行疾病诊断.致谢:感谢北京朝阳医院感染和临床微生物科全体同事对诺卡菌分离做出的贡献.利益冲突:无本文引用格式:王鹏,隗明,杨春霞,等．V I T E K MA L D IＧT O F M S技术在临床分离诺卡菌快速鉴定中的简易流程优化[J]．中国人兽共患病学报,２０１９,３５(１１):９８９Ｇ９９５．D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１００２Ｇ２６９４．２０１９．００．１６９参考文献:[１]B r o w nＧE l l i o t tB A,B r o w n J M,C o n v i l l eP S．C l i n i c a l a n d l a b o r aＧt o r y f e a t u r e s o f t h eM y o c a r d i a l s p p．b a s e do nc u r r e n tm o l e c u l a r t a x o n o m y[J]．C l i n M i c r o b i o lR e v,２００６,１９(２):２５９Ｇ２８２．D O I:１０．１１２８/C M R．１９．２．２５９Ｇ２８２．２００６[２]K i m Y K,S u n g H,J u n g J,e t a l．I m p a c t o f i mm u n e s t a t u s o n t h e c l i n i c a l c h a r a c t e r i s t i c s a n d t r e a t m e n t o u t c o m e s o f n o c a r d i o s i s[J]．D i a g n M i c r o b i o l I n f e c t D i s,２０１６,８５(４):４８２Ｇ７．D O I:１０．１０１６/j．d i a g m i c r o b i o．２０１６．０５．００４[３]M i n e r o MV,M a r i n M,C e r c e n a d oE,e ta l．N o c a r d i o s i sa t t h e t u r no f t h e c e n t u r y[J]．M e d i c i n e,２００９,８８(４):２５０．D O I:１０．１０９７/M D．０b０１３e３１８１a f a１c８[４]S o r r e l lT C,M i t c h e l l D H,I r e d e l l J R．N o c a r d i a s p e c i e s．I n:B e nＧn e t t J E,M a n d e l lG L,D o l i nR,e d i t o r s．M a n d e l l,D o u g l a s,a n d B e n n e t t s p r i n c i p l e s a n d p r a c t i c eo f i n f e c t i o u sd i s e a s e s[M]．６t h e d．E l s e v i e r S c i e n c eH e a l t hS c i e n c e d i v,２００５:２９１６Ｇ２９２４．[５]T r e m b l a y J,T h i b e r tL,A l a r i e I,e t a l．N o c a r d i o s i s i nQ u e b e c, C a n a d a,１９８８－２００８[J]．C l i n M i c r o b i o l I n f e c t,２０１１,１７(５):６９０Ｇ６９６．D O I:１０．１１１１/j．１４６９Ｇ０６９１．２０１０．０３３０６．x[６]H u i C H,A uVW,R o w l a n dK,e t a l．P u l m o n a r y n o c a r d i o s i s r eＧ４９９中国人兽共患病学报２０１９,３５(１１)v i s i t e d :e x p e r i e n c e o f ３５p a t i e n t s a t d i a g n o s i s [J ]．R e s pi r M e d ,２００３,９７(６):７０９Ｇ１７．D O I :１０．１０５３/r m e d ．２００３．１５０５[７]M c G u i n n e s s S L ,W h i t i n g SE ,B a i r dR ,e t a l ．N o c a r d i o s i s i n t h e T r o p i c a lN o r t h e r nT e r r i t o r y o fA u s t r a l i a ,１９９７－２０１４[J ]．O pe n F o r u m I nf e c t D i s ,２０１６,３(４):o f w ２０８．D O I :１０．１０９３/o f i d /o f w ２０８[８]Y a s s i n A F ,R a i n e y F A ,S t e i n e rU．N o c a r d i ac y r i a c i g e o r gi c i s p ．n o v [J ]．I n t JS ys tE v o lM i c r o b i o l ,２００１,５１(P t４):１４１９Ｇ１４２３．D O I :１０．１０９９/００２０７７１３Ｇ５１Ｇ４Ｇ１４１９[９]W a l l a c eR J J r ,T s u k a m u r aM ,B r o w nB A ,e t a l ．C e f o t a x i m e Ｇr e Ｇs i s t a n t N o c a r d i aa s t e r o i d e s s t r a i n s a r e i s o l a t e s o f t h e c o n t r o v e r Ｇs i a l s p e c i e s N o c a r d i af a r c i n i c a [J ]．JC l i n M i c r o b i o l ,１９９０,２８(１２):２７２６Ｇ３２．[１０]L a r r u s k a i n J ,I d i g o r a s P ,M a r i m ón J M ,e t a l ．S u s c e p t i b i l i t y of １８６N o c a r d i a s p ．i s o l a t e s t o ２０a n t i m i c r o b i a l ag e n t s [J ]．A n t i Ｇm i c r o bA ge n t sC h e m o t h e r ,２０１１,５５(６):２９９５Ｇ２９９８．D O I :１０．１１２８/A A C ．０１２７９Ｇ１０[１１]Y a s s i nA F ,S t r äu b l e r B ,S c h u m a n nP ,e t a l ．N o c a r d i a p u r i s s p．n o v [J ]．I n t J S ys t E v o lM i c r o b i o l ,２００３,５３(P t ５):１５９５Ｇ１５９９．D O I :１０．１０９９/i js ．０．０２５９３Ｇ０[１２]B u c k w a l t e rS P ,O l s o nS L ,C o n n e l l y BJ ,e ta l ．E v a l u a t i o no f m a t r i x Ｇa s s i s t e d l a s e rd e s o r p t i o ni o n i z a t i o n Ｇt i m eo f f l i gh t m a s s s p e c t r o m e t r y f o r i d e n t i f i c a t i o no f M y c o b a c t e r i u m s p e c i e s ,N o Ｇc a r d i a s p e c i e s ,a n do t h e r a e r o b i c a c t i n o m y c e t e s [J ]．JC l i n M i Ｇc r o b i o l ,２０１６,５４(２):３７６Ｇ３８４．D O I :１０．１１２８/J C M．０２１２８Ｇ１５[１３]K h o t P D ,B i r dB A ,D u r r a n tR J ,e t a l ．I d e n t i f i c a t i o no fN o c a r Ｇd i as pe c i e sb y m a t r i x Ｇa s s i s t e dl a s e rd e s o r pt i o ni o n i z a t i o n Ｇt i m e o f f l i g h t m a s ss p e c t r o m e t r y [J ]．J C l i n M i c r o b i o l ,２０１５．５３(１０):３３６６Ｇ３３６９．D O I :１０．１１２８/J C M．００７８０Ｇ１５[１４]T o y o k a w aM ,K i m u r aK ,N i s h i I ,e t a l ．R e l i a b l e a n d r e pr o d u c Ｇi b l em e t h o d f o r r a p i d i d e n t i f i c a t i o no fN o c a r d i a s p e c i e sb y m a Ｇt r i x Ｇa s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n /i o n i z a t i o n t i m e Ｇo f Ｇf l i g h t m a s s s p e c t r o m e t r y [J ]．R i n s h oB i s e i b u t s h u J i n s o k uS h i n d a nK e n k y u Ｇk a i S h i ,２０１３,２４(１):１Ｇ８．D O I :１０．１３７１/j o u r n a l ．po n e ．００５４７４０[１５]V e r r o k e nA ,J a n s s e n s M ,B e r h i nC ,e t a l ．E v a l u a t i o no fm a Ｇt r i x Ｇa s s i s t e dl a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n Ｇt i m e o ff l i g h t m a s s s p e c t r o m e t r y f o r i d e n t i f i c a t i o no fn o c a r d i as p e c i e s [J ]．JC l i n M i c r o b i o l ,２０１０．４８(１１):４０１５Ｇ４０２１．D O I :１０．１１２８/J C M．０１２３４Ｇ１０[１６]G i r a r dV ,M a i l l e rS ,P o l s i n e l l i S ,e t a l ．R o u t i n e i d e n t i f i c a t i o no fN o c a r d i as p e c i e sb y MA L D I ＧT O F m a s ss p e c t r o m e t r y [J ]．D i a gn M i c r o b i o l I n f e c tD i s ,２０１７．８７(１):７Ｇ１０．D O I :１０．１０１６/j ．d i a gm i c r o b i o ．２０１６．０９．０２４[１７]C l i n i c a l a n d L a b o r a t o r y St a n d a r d s I n s t i t u t e ．P e r f o r m a n c e s t a n d a r d s f o ra n t i m i c r o b i a ls u s c e p t i b i l i t y t e s t i n g :t w e n t yＧf i f t h i n f o r m a t i o n a l s u p p l e m e n t (M １００ＧS ２８)[S ]．W a y n e :C l i n i c a l a n d l a b o r a t o r y st a n d a r d s i n s i t u t e ,２０１８:１Ｇ２９６．[１８]M c T a g g a r tL R ,C h e n Y ,P o o p a l a r a ja h R ,e ta l ．I n c ub a t i o n t i m ea n dc u l t u r em ed i a i m p a c t s u c ce s sof i d e n t i f i c a t i o no fN o Ｇc a r d i a s p p ．b y MA L D I ＧT o F m a s ss p e c t r o m e t r y [J ]．D i ag n M i Ｇc r o b i o l I n f e c tD i s ,２０１８,９２(４):２７０Ｇ２７４．D O I :１０．１０１６/j ．d i a g Ｇm i c r o b i o ．２０１８．０６．０１６[１９]M a r i n M ,R u i zA ,I gl e s i a sC ,e t a l ．I d e n t i f i c a t i o no fN o c a r d i a s p e c i e s f r o m c l i n i c a l i s o l a t e su s i n g MA L D I ＧT O F m a s ss pe c Ｇt r o m e t r y [J ]．C l i n M i c r o b i o l I nf e c t ,２０１８,２４(１２):１３４２e ５Ｇ１３４２e ８．D O I :１０．１０１６/j．c m i ．２０１８．０６．０１４[２０]B o d y BA ,B e a r d MA ,S l e c h t a E S ,e ta l ．E v a l u a t i o no ft h e V i t e k M Sv ３．０M a t r i x ＧA s s i s t e d L a s e rD e s o r pt i o nI o n i z a t i o n ＧT i m e o fF l i g h tM a s s S p e c t r o m e t r y S y s t e mf o r I d e n t i f i c a t i o no f M y c o b a c t e r i u m a n d N o c a r d i a S pe c i e s [J ]．J C l i n M i c r o b i o l ,２０１８,５６(６):J C M．００２３７Ｇ１８．D O I :１０．１１２８/J C M．００２３７Ｇ１８[２１]L u oL ,C a o W ,C h e n W ,e t a l ．E v a l u a t i o no f t h eV I T E K M Sk n o w l e d g eb a s ev e r s i o n３．０f o rt h e i d e n t i f i c a t i o no fc l i n i c a l l yr e l e v a n t M y c o b a c t e r i u m s p e c i e s [J ]．E m e r g M i c r o b e sI n f e c t ,２０１８,７(１):１１４．D O I :１０．１０３８/s ４１４２６Ｇ０１８Ｇ０１２０Ｇ３[２２]R yc h e r t J ,S l e c h t aE S ,B a r k e rA P ,e t a l ．M u l t i c e n t e rE v a l u a Ｇt i o no f t h eV i t e kM Sv ３．０S y s t e mf o r t h e Ide n t if i c a t i o no f F i l a Ｇm e n t o u sF u n gi [J ]．JC l i n M i c r o b i o l ,２０１８,５６(２):J C M．０１３５３Ｇ１７．D O I :１０．１１２８/J C M．０１３５３Ｇ１７收稿日期:２０１９Ｇ０４Ｇ２８㊀编辑:张智芳关于著作权事项１．作者对来稿的真实性及科学性负责.依照«中华人民共和国著作权法»有关规定,本刊可对来稿做文字修改㊁删节.凡有涉及原意的修改,则提请作者考虑.修改稿逾期２个月未修回者,视作自动撤稿.２．来稿一经接受,作者亲笔签署本刊«版权转让协议»后,论文的专有使用权即归«中国人兽共患病学报»所有;本刊有权以电子期刊㊁光盘版㊁A P P 终端㊁微信等其他方式出版刊登论文,未经本刊同意,该论文的任何部分不得转载他处.３．文章在投稿后如作者顺序㊁个数如需变动,需提交全体作者同意修改说明,并附有全体作者亲笔签名及单位盖章.如修回后,经编辑部修改即在中国知网做论文首发,此时不允许修改作者及作者单位.４．相关事宜请联系本刊编辑部:福州市津泰路７６号«中国人兽共患病学报»编辑部,邮政编码:３５０００１,电话:０５９１－８７５５２０１８/８７５６３５８２,E m a i l :r s g h b ＠v i p．s i n a ．c o m .５９９１１期王㊀鹏,等:V I T E K MA L D I ＧT O F M S 技术在临床分离诺卡菌快速鉴定中的简易流程优化。

MALDI-TOF MS 在聚合物分析中的应用研究进展

MALDI-TOF MS 在聚合物分析中的应用研究进展王大刚;赖春花;倪江鹏;王雷;邹继兆【摘要】In this paper,we mainly introduced the working principle,choice of matrix,the application and the limitations of MALDI-TOF MS in analysis of polymers. In addition,we prospected the develop-ment prospects of MALDI-TOF MS in the future.%近年来，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)作为一种新型的软电离质谱技术，具有有快速、准确、灵敏度高、检测范围广等特点，在化学、生物，医疗卫生等众多领域得到广泛研究和应用。

本文着重介绍了 MALDI-TOF-MS 的工作原理，基质的选择，该技术在聚合物分析中的应用进展，以及存在的问题，并对其发展前景作出展望。

【期刊名称】《分析仪器》【年(卷),期】2016(000)003【总页数】4页(P71-74)【关键词】基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱;基质;聚合物;分析技术【作者】王大刚;赖春花;倪江鹏;王雷;邹继兆【作者单位】深圳大学材料学院深圳特种功能材料重点实验室，深圳 518060;深圳大学材料学院深圳特种功能材料重点实验室，深圳 518060;深圳大学材料学院深圳特种功能材料重点实验室，深圳 518060;深圳大学材料学院深圳特种功能材料重点实验室，深圳 518060;深圳大学材料学院深圳特种功能材料重点实验室，深圳 518060【正文语种】中文基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)是20世纪80年代末发展起来的一种新型“软电离”质谱技术，它不产生或者产生很少的碎片离子，使得不挥发性与热不稳定性的生物大分子和高分子聚合物的检测成为可能。

MALDI-TOF-MS在细菌检测中的应用

MALDI-TOF-MS 在细菌检测中的应用
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2
一、现有的细菌检测方法及其缺陷
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3
现有的细菌检测方法及其缺陷
❖ 经典方法
✓ 初步分类：菌落形态、显微镜检查、以及趋向性试验，如革兰染色、氧化酶和触酶。
✓ 鉴定属或种：以细菌生长代谢过程为基础的特征性的生理生化反应、选择培养基生长情况。
用。
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12
质谱的基本概念
❖ 高真空系统： ✓ 质谱计必须在高真空下才能工作。 ✓ 高真空的阀泵系统一般由前级泵（常用机械泵）和
油扩散泵或分子涡轮泵等组成。 ✓ 扩散泵能使离子源保持在10-6 ～ 10-7毫米汞柱的真
空度。 ✓ 在分析器中还有一只扩散泵，能维持10-7 ～ 10-8毫
种，84.1%能准确鉴定到种，11.3%只能鉴定到属。 ❖ Bizzini等分析1371株临床分离株发现93.2%能鉴定到
种水平，5.3%到属水平。在鉴定到种的水，MS和传统生化方法平一致率为95.1%。
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37
MALDI-TOF-MS在细菌检验中的应用范围
1、细菌菌种鉴定
❖ 在鉴定非发酵菌方面，用人类感染相关的37个属的 248株非发酵菌建立数据库，测定80株临床分离菌，并且和16S rRNA基因序列分析比较。MS能鉴定67株（ 85.9%），9株鉴定错误，2株不能鉴定。
计算机联用，使质谱图的规格化、背景或柱流失峰的
舍弃、元素组成的给出、数据的储存和计算、多次扫
描数据的累加、未知化合物质谱图的库检索，以及打
印数据和出图等工作均可由计算机执行，大大简化了
操作手续。
纯化
离子分离
分析

MALDI-TOF_MS在NTM_临床分离株快速鉴定中的应用研究

㊃论著㊃D O I:10.3969/j.i s s n.1672-9455.2023.15.005MA L D I-T O F M S在N TM临床分离株快速鉴定中的应用研究*黄琨波1,陈桂春2,林玉玲1,陈清清1,李科1,张建明1ә福建医科大学附属泉州第一医院:1.检验科;2.心内科,福建泉州362000摘要:目的建立临床非结核分枝杆菌(N T M)分离株的快速鉴定方法,为临床N T M病的诊断和治疗提供参考㊂方法收集2018-2020年泉州某三甲医院的临床疑似N TM感染患者的痰液㊁肺泡灌洗液㊁胸部穿刺液和脑脊液等标本,借助基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(MA L D I-T O F M S)技术,通过改良前处理方法(甲酸提取法),摸索上机检测条件,建立临床N TM分离株的快速鉴定方法,并以16S r R N A测序为金标准,验证鉴定的准确性㊂结果收集的50株临床N T M菌株,采用传统(常规)处理方法进行质谱鉴定,仅鉴定出4株,检出率为8.0%,而采用甲酸提取法共鉴定出24株,检出率为48.0%,两种方法检出率比较,差异有统计学意义(P<0.01),且改良处理后鉴定出的24株鉴定结果与P C R测序结果完全一致,符合率为100.0%㊂结论初步建立的N T M甲酸提取前处理的质谱鉴定方法检出率明显提高,具有一定的临床应用价值㊂关键词:基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱;非结核分枝杆菌;鉴定中图法分类号:R446.5文献标志码:A文章编号:1672-9455(2023)15-2162-05A p p l i c a t i o n o f M A L D I-T O F M S i n r a p i d i d e n t i f i c a t i o n o f N T M c l i n i c a l i s o l a t e s*HU A N G K u n b o1,C H E N G u i c h u n2,L I N Y u l i n g1,C H E N Q i n g q i n g1,L I K e1,Z HA N G J i a n m i n g1ә1.D e p a r t m e n t o f L a b o r a t o r y;2.D e p a r t m e n t o f C a r d i o l o g y,Q u a n z h o u F i r s t H o s p i t a l A f f i l i a t e d t o F u j i a nM e d i c a l U n i v e r s i t y,Q u a n z h o u,F u j i a n362000,C h i n aA b s t r a c t:O b j e c t i v e T o e s t a b l i s h a r a p i d i d e n t i f i c a t i o n m e t h o d f o r c l i n i c a l n o n-t u b e r c u l o u s m y c o b a c t e r i-u m(N T M)i s o l a t e s a n d p r o v i d e r e f e r e n c e f o r t h e d i a g n o s i s a n d t r e a t m e n t o f c l i n i c a l N T M d i s e a s e. M e t h o d s S a m p l e s s u c h a s s p u t u m,a l v e o l a r l a v a g e f l u i d,c h e s t p u n c t u r e f l u i d,a n d c e r e b r o s p i n a l f l u i d w e r e c o l-l e c t e d f r o m p a t i e n t s w i t h c l i n i c a l l y s u s p e c t e d N TM i n f e c t i o n i n2018-2020i n a t e r t i a r y h o s p i t a l o f Q u a n z h o u, C h i n a.W i t h t h e h e l p o f M a t r i x-A s s i s t e d L a s e r D e s o r p t i o n/I o n i z a t i o n T i m e o f F l i g h t M a s s S p e c t r o m e t r y (MA L D I-T O F-M S)t e c h n o l o g y,a r a p i d i d e n t i f i c a t i o n m e t h o d o f c l i n i c a l N T M i s o l a t e s w a s e s t a b l i s h e d b y i m-p r o v i n g t h e p r e t r e a t m e n t m e t h o d(t h e i m p r o v e d f o r m i c a c i d e x t r a c t i o n m e t h o d)a n d e x p l o r i n g t h e d e t e c t i o n c o n d i t i o n s.T h e a c c u r a c y o f i d e n t i f i c a t i o n w a s v e r i f i e d b y16S r R N A s e q u e n c i n g a s t h e g o l d s t a n d a r d. R e s u l t s A m o n g t h e50c l i n i c a l N T M s t r a i n s c o l l e c t e d,o n l y4s t r a i n s w e r e i d e n t i f i e d b y m a s s s p e c t r o m e t r y u-s i n g t h e t r a d i t i o n a l(c o v e n t i o n a l)t r e a t m e n t m e t h o d w i t h d e t e c t i o n r a t e o f8.0%,w h i l e24s t r a i n s w e r e i d e n t i-f i e d b y m a s s s p e c t r o m e t r y u s i n g t h e i m p r o v e d f o r m i c a c i d e x t r a c t i o n m e t h o d a f t e r p r e t r e a t m e n t w i t h d e t e c t i o n r a t e o f48.0%.T h e d i f f e r e n c e o f d e t e c t i o n r a t e b e t w e e n t h e t w o m e t h o d s w a s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t(P<0.01),a n d t h e i d e n t i f i c a t i o n r e s u l t s o f t h e24s t r a i n s i d e n t i f i e d b y t h e i m p r o v e d t r e a t m e n t w e r e c o m p l e t e l yc o n s i s t e n t w i t h t h e s e q u e n c i n g r e s u l t s o f P C R,w i t h c o m p l i a n c e r a t e o f100.0%.C o n c l u s i o n T h ede t e c t i o n r a t e of t h e m a s s s p e c t r o m e t r i c i d e n t i f i c a t i o n m e t h o d o f N T M f o r m i c a c i d p r e t r e a t e d s u b s t a n c e i s s ig n i f i c a n t l y i m p r o v e d,whi c h h a s c e r t a i n c l i n i c a l a p p l i c a t i o n v a l u e.K e y w o r d s:MA L D I-T O F M S;n o n-t u b e r c u l o u s m y c o b a c t e r i u m;i d e n t i f i c a t i o n非结核分枝杆菌(N T M)病是指人体感染了N T M引起相关组织或脏器的病变㊂N T M肺病与肺结核有着类似的临床症状和影像特征,二者无法通过痰标本抗酸染色进行区分,常造成误诊[1]㊂目前可以通过胶体金和荧光P C R检测等手段初步排除结核菌的感染,但仍无法明确诊断N T M病,更无法区分至㊃2612㊃检验医学与临床2023年8月第20卷第15期 L a b M e d C l i n,A u g u s t2023,V o l.20,N o.15*基金项目:福建省卫生健康中青年骨干人才培养项目(2020G G A075);福建省泉州市科技计划项目(2021N059S)㊂作者简介:黄琨波,男,主管技师,主要从事临床医学检验方面的研究㊂ә通信作者,E-m a i l:0591350004@163.c o m㊂Copyright©博看网. All Rights Reserved.亚种,误诊率也较高㊂滞后的鉴定技术严重阻碍了N T M病的诊治[2]㊂由于诊断困难㊁高度耐药且容易复发,近年来我国N T M病的发病率明显上升,对人类健康构成极大的威胁[3]㊂N T M传统培养方法操作繁杂,培养周期长,可重复性差,加之分枝杆菌大多属于慢生长菌,培养条件较苛刻,不易生长,已无法满足临床实际工作的需求[3]㊂近年来,基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(MA L D I-T O F M S)技术在临床微生物鉴定中的应用日渐广泛㊂MA L D I-T O F M S与传统方法和分子生物学技术相比,具有快速㊁准确㊁灵敏及经济等优点,尽管不能完全替代传统培养方法,但也弥补了传统方法操作复杂㊁费时等不足[4-5]㊂MA L D I-T O F M S 技术在国内用于N T M的鉴别较少见,因此临床参考数据较为有限[6]㊂本研究拟通过优化质谱上机前处理条件,建立适用于临床的N T M MA L D I-T O F M S 鉴定方法㊂现报道如下㊂1材料与方法1.1菌株来源收集2018-2020年泉州某三甲医院微生物实验室的部分临床疑似N T M感染(涂片抗酸染色阳性,分离培养并经结核D N A检测为阴性,初步鉴为N T M)患者的痰液㊁肺泡灌洗液㊁胸部穿刺液和脑脊液等样本㊂采用改良罗氏培养基(L-J培养基)进行分离培养㊂N T M参考株来源于美国菌种保藏中心㊂1.2仪器与试剂主要仪器:全自动快速生物质谱检测系统(B r u k e r D a l t o n i k G m b H);基因扩增仪(杭州博日科技有限公司);二氧化碳培养箱(赛默飞世尔科技公司)㊂主要试剂:基质液;甲酸水溶液;乙腈水溶液;无水乙醇;固体培养基;哥伦比亚血琼脂平板; P C R试剂盒㊁E x T a q D N A聚合酶及标准分子量D N A(M a r k e r)购自T a K a R a公司㊂1.3方法1.3.1传统(常规)质谱法1.3.1.1临床标本前处理(1)痰标本:首先将痰样本转移至螺口管中,视样本具体性状,在生物安全柜内加入1~2倍体积的N-乙酰-L-半胱胺酸-氢氧化钠(N A L C-N a O H)处理液㊂旋紧盖子,在涡旋振荡器上涡旋振荡充分混匀,静置15m i n㊂小心打开盖子,加入适量磷酸盐缓冲液(p H值为6.8)至总体积约40 m L;3000ˑg离心20m i n,弃上清液用l m L磷酸盐缓冲液重悬沉淀,并将重悬液接种至新的培养基上㊂(2)支气管灌洗液㊁脑脊液等无菌体液:直接将样本离心后取沉淀接种进行培养㊂1.3.1.2 N T M菌株筛选将经B a c t e c MG T960系统培养阳性的分枝杆菌菌液接种于罗氏培养基上,37ħ持续培养4周,记录菌落的生长状态㊂其中,经结核D N A检测呈阴性的初步判定为N T M㊂1.3.1.3菌株D N A提取采用煮沸裂解法进行菌株D N A的提取㊂1.3.2 MA L D I-T O F M S改良前处理(甲酸提取法) 1.3.2.1标本处理(1)在1.5m L的离心管中先加入300μL去离子水;转移分枝杆菌样本到上述离心管中(避免取到培养基,尽可能转移1~3份10μL接种环的菌量㊂取菌量更直观的概念:离心管中2μL 水的量代表一小份沉淀,5μL的量代表合适大小的沉淀);煮沸30m i n以灭活分枝杆菌(可使用95ħ的金属浴或水浴)㊂(2)使用移液枪反复吹打混匀,然后涡旋振荡至少1m i n,在离心管中形成悬液㊂(3)添加900μL的无水乙醇溶液,然后悬液振荡至少1m i n㊂(4)离心菌体细胞(离心2m i n,13000r/m i n)并吸净上清液㊂(5)将第4步重复一次,使用移液枪小心吸取剩下的乙醇,以完全除去乙醇溶液㊂(6)将10μL 70%甲酸水溶液加入沉淀物中,通过移液枪反复吹打,然后进行涡旋充分混匀,(7)加入10μL乙腈,通过移液枪反复吹打混合悬液㊂(8)离心细菌提取物(离心2m i n,13000r/m i n)㊂1.3.2.2 MA L D I-T O F M S测定参考质谱仪的操作说明进行㊂1.3.316S r R N A测序1.3.3.1 P C R扩增参考文献[7]合成16S r R N A 基因的引物,引物均由上海生工生物有限公司合成㊂P C R体系50μL,2x T a q M a s t e r M i x25μL,D N A模板5μL,引物(10p m o l/L)各1μL,d d H2O18μL㊂阳性对照为标准株,阴性对照组为d d H2O㊂P C R反应条件:94ħ预变性5m i n,94ħ变性1m i n,60ħ退火1m i n,72ħ延伸1m i n,第2~4步30个循环,最后72ħ充分延伸10m i n㊂将配好的体系放置到P C R仪中进行P C R反应㊂1.3.3.2 P C R序列分析扩增产物经电泳检测验证后,取20p m o l/L扩增产物送往上海生工生物技术有限公司进行纯化及测序㊂将基因序列分析结果与G e n B a n k中分枝杆菌标准序列进行比对,相似度最高的菌种为标本所属菌种㊂1.4统计学处理采用S P S S20.0统计软件进行数据分析㊂计数资料以例数或百分比表示,采用χ2检验㊂以P<0.05为差异有统计学意义㊂2结果2.1标本收集基本情况本研究共收集临床微生物实验室初步鉴定为N T M的标本50例,以呼吸内科㊁㊃3612㊃检验医学与临床2023年8月第20卷第15期 L a b M e d C l i n,A u g u s t2023,V o l.20,N o.15Copyright©博看网. All Rights Reserved.感染科㊁I C U和发热门诊来源的标本较为常见㊂将已有标本转种于固体培养基上,以获取单个菌落用于后续实验分析㊂2.2传统(常规)质谱方法与甲酸提取法的鉴定结果比较用传统(常规)质谱方法共鉴定出4例菌株,检出率为8.0%(4/50),包括脓肿分枝杆菌3例和鸟分枝杆菌1例㊂采用甲酸提取法共鉴定出24株菌株,检出率为48.0%(24/50),鉴定结果见表1㊂在26株未能鉴定出结果的菌株中,有6株的蛋白指纹图谱具有良好波谱谱峰㊂两种方法检出率比较,差异有统计学意义(P<0.05)㊂表1甲酸提取法鉴定结果序号编号菌种结果鉴定分值序号编号菌种结果鉴定分值16200801鸟分枝杆菌2.127136210204胞内分枝杆菌2.000 26200116鸟分枝杆菌1.834146210029胞内分枝杆菌1.985 36210220堪萨斯分枝杆菌2.114156200786胞内分枝杆菌1.415 46201512脓肿分枝杆菌2.0991********胞内分枝杆菌1.487 56201374鸟分枝杆菌1.648176201751胞内分枝杆菌1.603 66201383脓肿分枝杆菌1.837186201069胞内分枝杆菌1.977 76201659脓肿分枝杆菌1.947196201178马赛分枝杆菌1.446 86201635脓肿分枝杆菌2.0352********堪萨斯分枝杆菌1.998 96200949福特分枝杆菌1.339216201628隐藏分枝杆菌1.467 106200961哥伦比亚分枝杆菌1.414226201388拟杆菌分枝杆菌1.983 11121030607猿分枝杆菌1.947236201753马赛分枝杆菌1.514 126210501产粘液分枝杆菌2.012246201842马赛分枝杆菌1.7432.316s r R N A基因测序结果2.3.116s r R N A基因扩增将甲酸提取法处理后有鉴定结果的菌株,采用加热裂解法提取核酸,以16S F㊁16S R作为引物进行16s r R N A基因扩增,分2批次扩增,第1次扩增10株,第2次扩增14株,共扩增了24株菌株,凝胶电泳结果表明全部有明亮的目的基因扩增条带出来,选用M a r k分子量大小约为2.0 k b,目的核酸片段分子量约为1.5k b,电泳条带1.0~ 2.0k b,符合试验预期㊂部分凝胶电泳条带见图1㊂注:1~9为菌株扩增结果(约1500b p);10为相对分子质量标准D L2000;11为阴性对照㊂图116s r R N A基因扩增凝胶电泳结果2.3.2测序结果分析将甲酸提取法处理后有鉴定结果的菌株的扩增产物送上海生物技术公司进行测序,通过G e n B a n k进行B l a s t比对,结果显示24株均为N T M,结果与质谱鉴定完全一致,符合率为100.0%,其中胞内分枝杆菌6株,马赛分枝杆菌3株,脓肿分枝杆菌4株,哥伦比亚分枝杆菌1株,鸟分枝杆菌3株,福特分枝杆菌1株,堪萨斯分枝杆菌2株,拟杆菌分枝杆菌1株,隐藏分枝杆菌1株,产黏液分枝杆菌1株,猿分枝杆菌1株㊂3讨论N T M毒性弱于结核分枝杆菌,大多是机会性致病菌,感染范围广,但临床普遍耐药,治疗方案存在较大差异㊂近年来,N T M感染率和发病率逐渐增加,其潜在危害越来越受到重视[3]㊂全球性的结核病高负担国家中,我国的情况一直不容乐观㊂临床患者中发生联合耐药的概率在升高,且具有广泛的耐药率[8-10]㊂因此临床实验室中快速㊁准确地鉴定N T M就显得极为迫切㊂传统生化方法可以用于鉴别MT B C和N T M,却无法避免操作烦琐㊁实验周期长的缺陷,生化培养以细菌生长特点和生化反应为依据作出判断,本身存在一定的局限性㊂近年来,分子诊断技术已经得到全面发展,P C R㊁P C R直接测序法㊁限制性片段长度多态性聚合酶链反应(P C R-R F L P)已成为较常用的鉴定结核分枝杆菌的方法[11]㊂有文献报道P C R-核酸探针技术,能有效鉴别23种临床常见分枝杆菌;P C R单链构象多态性(P C R-㊃4612㊃检验医学与临床2023年8月第20卷第15期 L a b M e d C l i n,A u g u s t2023,V o l.20,N o.15Copyright©博看网. All Rights Reserved.S S C P)分析技术㊁荧光定量P C R(q P C R)技术等,能够对特定的一种或多种N T M进行快速鉴定,极大地丰富了临床分枝杆菌鉴定实验方法;基因芯片技术即c D N A微阵列芯片,能够对临床常见20种N T M进行快速鉴定[12]㊂这些分子生物学技术虽可以快速诊断N T M,但局限于特定的一些分枝杆菌,而且费用高,操作难度较大,对实验室检验人员要求较高,测序引物又因方案不同而变动,引物扩增长度没有达到一定要求,也很难鉴定出相应菌种,难以做到统一操作,故此,探索新的更为简便㊁快速㊁准确的鉴定方法对临床工作意义重大㊂质谱方法是近年快速发展的一种生物质谱技术,具有极大的潜在价值[13-15]㊂MA L D I-T O F M S技术的基本原理是获取细菌蛋白质,形成质量图谱㊂国内已有MA L D I-T O F M S技术应用于细菌分型㊁耐药分析的相关文献报道,充分显示了其巨大的应用价值㊂但国内目前MA L D I-T O F M S在分枝杆菌鉴定的应用中还未达到预期效果,使N T M在质谱鉴定方面远落后于细菌㊂本研究中依照布鲁克公司的操作标准,检出率仅为8.0%(4/50),而采用改良前处理方法(甲酸提取法)后检出率为48.0%(24/50),差异有统计学意义(P<0.01)㊂N T M细胞壁中蜡质成分占60%以上,可抵抗机体免疫力和药物的攻击,同时能耐受搅拌,不易破碎,因此,传统方法不易使其细胞壁破碎释放出蛋白质形成图谱[16-17]㊂而采用改良的甲酸提取法后,甲酸能有效地诱导细胞壁破裂,使得细菌缓慢释放出细胞质中的蛋白,从而提升质谱的鉴定效率[18-19]㊂本研究表明改良前处理方法后的质谱技术用于N T M鉴定,与传统的质谱鉴定方法比较检出率更高;且与传统微生物临床鉴定相比同样具有质谱本身的经济㊁快速等优点㊂因此,用于鉴别N T M与结核分枝杆菌复合群,一定程度上能够满足临床工作中N T M快速鉴定的需求,对于临床N T M菌种鉴定有一定的应用价值㊂标准数据库的菌株库存容量是影响质谱鉴定的一个重要因素[20-21]㊂本研究中发现,采用甲酸提取法时,在26株未能鉴定出结果的菌株中,有6例菌株质谱鉴定图谱峰值比较理想,但却没有明确结果,分析原因可能是由于本实验室数据库不够全面,没有对应的标准菌株,从而导致质谱鉴定结果失败㊂另一个影响因素就是乙腈溶液和甲酸溶液的稀释浓度偏低,对蛋白酸化和提取产生影响㊂除此之外的一个决定性的实验因素是细菌细胞壁坚实,常规实验手段难以破坏细菌细胞壁,导致细菌蛋白质获取困难,甚至蛋白质基本没有提取出来,以致实验分析失败㊂本研究采用了加热㊁加酸㊁加生物酶等方法,以提高蛋白质含量,不过效果并不理想,因此需要探索破除细菌细胞壁的新方法㊂MA L D I-T O F M S技术用于N T M鉴定的临床价值,仍有待于未来大量样本的研究分析给予更为客观和科学的评价㊂本课题在研究过程中,收集标本相对有限,后续研究工作将进一步继续深入开展下去,以期探索出更加准确㊁可靠㊁快速的N TM鉴定技术㊂综上所述,MA L D I-T O F M S技术用于N T M鉴定及分型,具有实际的应用价值,可用于临床实验室检验工作㊂参考文献[1]B I E T F,B O S C H I R O L I M L.N o n-t u b e r c u l o u s m y c o b a c-t e r i a l i n f e c t i o n s o f v e t e r i n a r y r e l e v a n c e[J].R e s V e t S c i, 2014,97:69-77.[2]G R I F F I T H D E,A K S AM I T T,B R OWN-E L L I O T T BA,e t a l.A n o f f i c i a l A T S/I D S A s t a t e m e n t:d i a g n o s i s, t r e a t m e n t,a n d p r e v e n t i o n o f n o n t u b e r c u l o u s m y c o b a c t e-r i a l d i s e a s e s[J].A m J R e s p i r C r i t C a r e M e d,2007,175(4):367-416.[3]O L I V A E,A R O S I O M,MA Z Z O L A E,e t a l.R a p i d i d e n t i-f i c a t i o n o f n o n-t u b e r c u l o u s m y c o b a c t e r i a w i t h MA L D I-T O F m a s s s p e c t r o m e t r y[J].I n f e z M e d,2021,29(1):79-84.[4]周昭彦,胡必杰,鲍容,等.MA L D I-T O F质谱快速鉴定非结核分枝杆菌方法的建立和评价[J].中华检验医学杂志,2013,36(7):610-614.[5]中华医学会结核病学分会,非结核分枝杆菌病实验室诊断专家共识编写组.非结核分枝杆菌病实验室诊断专家共识[J].中华结核和呼吸杂志,2016,39(6):438-443.[6]S HAMA E I M,M I R S A E I D I M.N o n t u b e r c u l o u s m y c o b a c-t e r i a,m a c r o p h a g e s,a n d h o s t i n n a t e i mm u n e r e s p o n s e[J].I n f e c t I mm u n,2021,89(8):e0081220.[7]K I M S H,S H I N J H.I d e n t i f i c a t i o n o f n o n t u b e r c u l o u sm y c o b a c t e r i a u s i n g m u l t i l o c o u s s e q u e n c e a n a l y s i s o f16S r R N A,h s p65,a n d r p o B[J].J C l i n L a b A n a l,2018,32(1): e22184.[8]J OHA N S E N M D,H E R R MA N N J L,K R E M E R L.N o n-t u b e r c u l o u s m y c o b a c t e r i a a n d t h e r i s e o f M y c o b a c t e r i u ma b s c e s s u s[J].N a t R e v M i c r o b i o l,2020,18(7):392-407.[9]D E Z WA A N R,V A N I N G E N J,V A N S O O L I N G E N D.U t i l i t y o f r p o B g e n e s e q u e n c i n g f o r i d e n t i f i c a t i o n o f n o n-t u b e r c u l o u s m y c o b a c t e r i a i n t h e N e t h e r l a n d s[J].J C l i n M i c r o b i o l,2014,52(7):2544-2551.[10]V A N I N G E N J.M i c r o b i o l o g i c a l d i a g n o s i s o f n o n t u b e r-c u l o u s m y c o b a c t e r i a l p u l m o n a r yd i se a s e[J].C l i n C h e s tM e d,2015(36):43-54.(下转第2169页)㊃5612㊃检验医学与临床2023年8月第20卷第15期 L a b M e d C l i n,A u g u s t2023,V o l.20,N o.15Copyright©博看网. All Rights Reserved.节纤维蛋白溶解的过程,进而促进血栓形成并抑制血栓的降解和重塑[10]㊂本研究中,模型组㊁N R4A1组大鼠血清N O㊁e N O S㊁6-k e t o-P G F1α水平及N O/E T-1均低于对照组(P<0.05),且模型组均低于N R4A1组(P<0.05);模型组㊁N R4A1组大鼠血清E T-1㊁P A I-1㊁T X B2水平及T X B2/6-k e t o-P G F1α均高于对照组(P<0.05),且模型组均高于N R4A1组(P< 0.05)㊂提示N R4A1可上调N O㊁e N O S㊁6-k e t o-P G F1α水平及N O/E T-1,下调E T-1㊁P A I-1㊁T X B2水平及T X B2/6-k e t o-P G F1α,进而减轻大鼠颈动脉血栓模型中的血栓和炎症㊂综上所述,N R4A1对N F-κB/C O X-2信号通路相关蛋白表达具有负向调控作用,进而减轻大鼠深静脉血栓模型中的血栓和炎症,为临床血栓栓塞性疾病的治疗提供了新的思路和策略㊂参考文献[1]魏安华,贡雪芃,李志勤,等.选择性凝血因子Ⅺa抑制剂防治血栓性疾病的临床研究进展[J].中国新药杂志, 2022,31(17):1707-1711.[2]N U S M,B A S A T E MU R G,G A L A N M,e t a l.N R4A1d e-l e t i o n i n m a r g i n a l z o n e b c e l l s e x a c e r b a t e s a t h e r o s c l e r o s i si n m i c e-b r i e f r e p o r t[J].A r t e r i o s c l e r T h r o m b V a s c B i o l,2020,40(11):2598-2604.[3]田坤,孟路阳,陈世伟.利伐沙班对下肢动脉硬化闭塞症大鼠血管内皮功能及p38MA P K/N F-κB通路的影响[J].中国药师,2018,21(05):757-760.[4]M I A O L,Y A N G Y,L I U Y,e t a l.G l y c e r o l k i n a s e i n t e r-a c t s w i t h n u c l e a r r e c e p t o r N R4A1a n d r e g u l a t e s g l u c o s em e t a b o l i s m i n t h e l i v e r[J].F A S E B J,2019,33(6):6736-6747.[5]Y E T,P E N G J,L I U X,e t a l.O r p h a n n u c l e a r r e c e p t o rT R3/N u r77d i f f e r e n t i a l l y r e g u l a t e s t h e e x p r e s s i o n o f i n-t e g r i n s i n a n g i o g e n e s i s[J].M i c r o v a s c R e s,2019,122:22-33.[6]L I P,B A I Y,Z HA O X,e t a l.N R4A1c o n t r i b u t e s t o h i g h-f a t a s s o c i a t e d e n d o t h e l i a l d y s f u n c t i o n b y p r o m o t i ng C a M K I I-P a r k i n-m i t o ph a g y p a t h w a y s[J].C e l l S t r e s s C h a p e r-o n e s,2018,23(4):749-761.[7]郭阗廷,石锦,陈曦,等.C O X-2靶向干扰对大鼠创伤性深静脉血栓形成的影响[J].生物骨科材料与临床研究, 2022,19(1):11-14.[8]O U M,Z HA N G Y,C U I S,e t a l.U p r e g u l a t e d m i R-9-5p p r o t e c t s a g a i n s t i n f l a mm a t o r y r e s p o n s e i n r a t s w i t h d e e p v e i n t h r o m b o s i s v i a i n h i b i t i o n o f N F-κB p50[J].I n f l a m-m a t i o n,2019,42(6):1925-1938.[9]董泉彬,唐燕华,王维雪,等.心房颤动患者心房组织F G F23/F G F R4表达与心房纤维化的相关性[J].中华医学杂志,2018,98(13):1003-1007.[10]李帅,金爱莲,刘青,等.C y s C㊁P A I-1与急性心肌梗死的早期诊断及疾病严重程度的相关性分析[J].分子诊断与治疗杂志,2022,14(11):1968-1971.(收稿日期:2023-02-03修回日期:2023-06-10)(上接第2165页)[11]L I U W,L I U S,L I P,e t a l.R e t i n i t i s p i g m e n t o s a:p r o g r e s si n m o l e c u l a r p a t h o l o g y a n d b i o t h e r a p e u t i c a l s t r a t e g i e s[J].I n t J M o l S c i,2022,23(9):4883.[12]B A R I S A,B A Y R A K T A R B.I d e n t i f i c a t i o n o f t h e m y c o-b ac t e r i a l s t r a i n s i s o l a t ed f r o m c l i n i c a l s pe c i m e n s u s i n gh s p65P C R-R F L P m e t h o d[J].S i s l i E t f a l H a s t a n T i p B u l, 2020,54(3):364-370.[13]黄永红.非结核分枝杆菌感染的实验诊断应用进展[J].实用医技杂志,2013,20(1):44-46.[14]P A T E L R.MA L D I-T O F M S f o r t h e d i a g n o s i s o f i n f e c-t i o u s d i s e a s e s[J].C l i n C h e m,2015,61(1):100-111. [15]C R O X A T T O A,P R O D'HOM G,G R E U B G.A p p l i c a-t i o n s o f MA L D I-T O F m a s s s p e c t r o m e t r y i n c l i n i c a l d i a g-n o s t i c m i c r o b i o l o g y[J].F E M S M i c r o b i o l R e v,2012,36(2):380-407.[16]R I N D I L,P U G L I S I V,F R A N C O N I I,e t a l.R a p i d a n d a c-c u r a t e ide n t if i c a t i o n o f n o n t u b e r c u l o u s m y c o b a c t e r i a d i-r e c t l y f r o m p o s i t i v e p r i m a r y MG I T c u l t u r e s b y MA L D I-T O F M S[J].M i c r o o rg a n i s m s,2022,10(7):1447.[17]L I B,Z HU C,S U N L,e t a l.P e r f o r m a n c e e v a l u a t i o n a n dc l i n i c a l v a l id a t i o n o f o p t i m i ze d n u c l e o t i d e MA L D I-T O F-M S f o r m y c o b a c t e r i a l i d e n t i f i c a t i o n[J].F r o n t C e l l I n f e c t M i c r o b i o l,2022,12:1079184.[18]B A G N A R I N O J,B A R B A R I N I D,R U S S E L L O G,e t a l.M y c o b a c t e r i u m c h i m a e r a i d e n t i f i c a t i o n u s i n g MA L D I-T O F M S t e c h n o l o g y:a p r a c t i c a l a p p r o a c h f o r t h e c l i n i c a l m i c r o b i o l o g y l a b o r a t o r i e s[J].M i c r o o r g a n i s m s,2022,10(6):1184.[19]P A S T R O N E L,C U R T O N I A,C R I S C I O N E G,e t a l.E-v a l u a t i o n o f t w o d i f f e r e n t p r e p a r a t i o n p r o t o c o l s f o r MA L D I-T O F M S n o n t u b e r c u l o u s m y c o b a c t e r i a i d e n t i f i-c a t i o n f r o m l i q u id a n d s o l i d me d i a[J].M i c r o o r g a n i s m s,2023,11(1):120.[20]MO U S S A M,C A U V I N E,L E P I O U F F L E A,e t a l.AMA L D I-T O F M S d a t a b a s e f o r f a s t i d e n t i f i c a t i o n o f V i b-r i o s p p.p o t e n t i a l l y p a t h o g e n i c t o m a r i n e m o l l u s k s[J].A p p l M i c r o b i o lB i o t e c h n o l,2021,105(6):2527-2539.[21]HO N N A V A R P,G HO S H A K,P A U L S,e t a l.I d e n t i f i-c a t i o n o f m a l a s s e z i a s p e c i e s b y MA L D I-T O F M S a f t e r e x p a n s i o n o fd a t a b a s e[J].D i a g n M i c r o b i o l I n fe c t D i s, 2018,92(2):118-123.(收稿日期:2022-12-20修回日期:2023-06-10)㊃9612㊃检验医学与临床2023年8月第20卷第15期 L a b M e d C l i n,A u g u s t2023,V o l.20,N o.15Copyright©博看网. 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角色，近年来在微生物的鉴定方面已经有了很广泛
的应用＿２Ｊ。
一可能取代现有的
对于真菌和细菌鉴定方法。在细菌鉴定方面，除了部分少见菌株因数据库尚未建立相关参考谱图而暂
基金项目：国家高技术研究发展计划（２０１１ＡＡ０２Ａ１０７）。作者单位：中国医学科学院北京协和医学院研究生院，中国医学科学院北京协和医院检验科，北京１００７３０。
用于微生物鉴定，为微生物的鉴定带来了革命性的
变化。ＭＡＬＤＩ — ＴＯＦＭＳ是简便快速、高通量、低成
及分辨率高等特点，为生命科学等领域提供了一种
强有力的分析测试手段，并正扮演着越来越重要的
张丽，徐英春
关键词：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱；诊断新技术；病原菌诊断
中图分类号：Ｒ３７８文献标志码：Ａ文章编号：１００９ — ７７０８（２０１３）０３～０２２６ — ０６
ａｓｓｉｓｔｅｄｌａｓｅｒｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎｔｉｍｅｏｆｆｌｉｇｈｔ
末出现了软电离技术，如ＭＡＬＤＩ和电喷雾电离技
术，开始利用质谱来分析生物大分子物质，如完整的
蛋白质［１。ＭＡＬＤＩ — ＴＯＦＭＳ具有灵敏度、准确度
ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ＭＡＬＤＩ — ＴＯＦＭＳ）是近年发展
起来的一种新型软电离质谱技术，目前不但应用于肿瘤、风湿性关节炎、阿尔茨海默病等的诊断，还可
２２６
中国感染与化疗杂志２０１３年５月２０日第１３卷第３期ＣｈｉｎＪＩｎｆｅｃｔＣｈｅｍ。ｔｈｅｒ，Ｍａｙ２叭？，ｏｌ，ｌ！：
・
综述
・
ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ在临床微生物实验室的应用研究进展
ＴＯＦＭＳ鉴定效果也很好，大大快于常规鉴定方法，并且通过特殊的标本处理流程，也可用于丝状真
菌鉴定。另外，ＭＡＬＤＩ — ＴＯＦＭＳ已经能够成功地
酸（ＦＡ）等。基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离。因此它是
助激光解吸电离离子源（ＭＡＬＤＩ）、飞行时间质量分
析器（ＴＯＦ）和检测器。ＭＡＬＤＩ的原理是用激光照
射样品与基质形成的共结晶薄膜，常用的基质主要
包括２，５－二羟基苯甲酸（ＤＨＢ）、一氰基一４一羟基肉桂酸（ＣＨＣＡ）、３，５－二甲氧基一４一羟基肉桂酸（ＳＡ）、甲
ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＭＡＬＤＩ — ＴＯＦｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｉｎｃｌｉｎｉｃａｌｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
ＺＨＡＮＧＬｉ。ＸＵＹｉｎｇｃｈｕｎ．（ＰｅｋｉｎｇＵｎｉｏｎＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅＨｏｓｐｉｔａｌ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＭｅｄｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ＆ＰｅｋｉｎｇＵｎｉｏｎＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００７３０，Ｃｈｉｎａ）
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（ｍａｔｒｉｘ－
一
用于部分微生物亚种水平的鉴定和耐药机制的
检测。
质谱是用来分析各种混合物质荷比的分析仪器，质谱仪基于不同的电离设备和检测设备而分为
不同的类型。在早期的质谱技术中，只能检测相对
种软电离技术，适用于混合物及生物大分子的
测定Ⅲ ３］。ＴＯＦ的原理是离子在电场作用下加速飞
过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而
分子质量较小的生物分子，如脂类。上世纪８０年代
时无法鉴定外，ＭＡＬＤＩ — ＴＯＦＭＳ已经能够鉴定出大部分的细菌；在酵母样真菌鉴定方面，ＭＡＬＤＩ —
、
ＭＡＬＤＩ — ＴＯＦＭＳ简介及工作原理
ＭＡＬＤＩ — ＴＯＦＭＳ主要由三部分组成：基质辅