石蜡切片组织RNA提取

受破坏RNA（固定步骤）
二甲苯：溶解并去除石蜡
降低RNA 得率 蛋白酶K：消化与RNA结合的组蛋白 后续分析困难

注：RNA降解
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内容
有关石蜡组织切片
1、样品处理
补：DNA石蜡组织 切片。
样品处理
2、RNAபைடு நூலகம்提
试剂及仪器
RNA 质控RNA 提取 RNA 质控 定量 电泳
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样品处理
组织蜡块
从石蜡切片组织中提取RNA
董进曲/ Jinqu Dong 2013.12.26
ANNUAL BUSINESS REVIEW
概览
有关石蜡组织切片
补：DNA石蜡组织 切片。
试剂及仪器
样品处理 定量
RNA 质控RNA 提取
RNA 质控
电泳
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有关石蜡切片
石蜡切片（paraffin section）： 组织学常规制片技术中最为
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3. RNA 抽提
1.2.4.4 加500µ L Wash2/3至Filter Cartridge上，10,000g，30s，弃 滤液。 1.2.4.5 空甩，10,000g，30s，，去除残留洗液。 1.2.5 DNA酶消化和RNA分离纯化
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3. RNA 抽提
1.2.5.2 加入60µ LDNase mix至每个Filter Cartridge中心，盖上管盖， 室温孵育30min。 1.2.5.3 加700µ L Wash1至Filter Cartridge上，室温孵育30-60s后， 10,000g，30s，弃滤液。 1.2.5.4 加500µ L Wash2/3至Filter Cartridge上，10,000g，30s，弃 滤液； 1.2.5.5 重复一次4.2.5.4操作后，10,000g，空甩1min。 1.2.5.6 将Filter Cartridge转入另一新Collection Tube管中，加60µ L Elution Solution到滤膜中心，盖上管盖室温静置1min后，最大转 速1min。 1.2.5.7 进行Nano Drop RNA定量，如果不马上定量，将样品保存 于-80℃。
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有关石蜡切片
石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包
埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。 一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日，但标 本可以长期保存使用，为永久性显微玻片标本。
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Ambion1975
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石蜡组织切片RNA提取：实验原理
二甲苯&Ambion1975试剂盒： 通过二甲苯的去蜡以及蛋白酶K使RNA从石蜡组织中裂解释 放，并通过DNA吸附柱有效提取RNA. 关键点：
1.2.3.2 加入4μL Protease后，上下颠倒混匀，如果组织附着在管 壁上，用枪头或瞬时离心使组织浸入到裂解液里。 1.2.3.3 置于恒温金属浴中孵育，50℃，500rpm摇动3h；然后 70℃，500rpm摇动20min。 注意：如果延长70℃反应时间，有可能导致RNA降解，故不要 随意延长时间。
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3. RNA 抽提
1.2.2 二甲苯脱石蜡 1.2.2.1. 加入1ml 二甲苯，至上述离心管中，盖紧盖子，剧烈震荡 混匀5min；瞬时离心，将附着在管壁的组织收集至管底；50℃， 3min，离心机最大转速室温离心2min，弃上清。 注意： 二甲苯有毒，应尽量在通风橱中开盖操作，以减少实验 室空气污染。 1.2.2.2. 观察形成的组织沉淀是否很紧实，如果异常，重复 1.2.2.1实验操作。 1.2.2.3. 加入1ml无水乙醇至离心管中，剧烈震荡混匀2min，离心 机最大转速（13200rpm)室温离心2min，小心弃上清；重复此步 骤一次。
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3. RNA 抽提
1.2.2.4. 弃上清，室温短暂离心，用移液器将剩余的无水乙醇吸 出。 1.2.2.5. 真空旋转浓缩仪干燥组织中残余乙醇（5min)，45℃，浓 缩时间＜20min；如果室温晾干组织沉淀，时间为15-45 min。 。 1.2.3 蛋白酶消化
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3. RNA 抽提
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3. RNA 抽提
1.2.4 总核酸提取
1.2.4.2 混匀，吸取700µ L混合液至过滤柱里，为放止堵住过 滤柱，避免吸到大块未被消化掉的组织块到过滤柱里，然后 10,000g，30s，弃滤液至原管。 1.2.4.3 加700µ L Wash1至Filter Cartridge上，10,000g，30s，弃 滤液。
切片
提取及质检
RNA
实验/数据
存放位置, 使用情况, 是否返还 样品移交记录（实验室间）
实验室信息管理系统 Microsoft Excel 手写记录
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RNA提取前
组织蜡块
切片
提取及质检
RNA
实验/数据
1.1 实验前的准备工作 1.1.1 打开超净台的紫外灯，灭菌15min，然后通风 10min。 1.1.2 在第一次使用Wash1和Wash2/3之前，按照下 列步骤加入无水乙醇：加入42mL的无水乙醇（如 试剂瓶上所示）至Wash1中，充分混匀，即为工作 液；加入48mL的无水乙醇（如试剂瓶上所示）至 Wash2/3中，充分混匀，即为工作液。 1.1.3 用镊子将刀片蘸取少量酒精，酒精灯上灼烧 刀片，冷却后备用。
广泛应用的方法。石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形 态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断 细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于 其他许多学科领域的研究中。教学中，光镜下观察切片标本 多数是石蜡切片法制备的。活的细胞或组织多为无色透明， 各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差，在一般光镜 下不易清楚区别出；组织离开机体后很快就会死亡和产生组 织腐败，失去原有正常结构，因此，组织要经固定、石蜡包 埋、切片及染色等步骤以免细胞组织死亡，而能清晰辨认其 形态结构。
一个样品用一个解剖刀片 实验前后清洁工作区
经常换手套
无PCR产物区域 尽量防止组织碎片飞散造成交叉污染
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试剂、仪器及耗材
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试剂、仪器及耗材
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试剂、仪器及耗材
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Thanks！
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石蜡组织切片RNA提取步骤
1.石蜡组织切片收集 及鉴定
每个样本以约300ul的石蜡组织切片量 为宜.
2.组织切片刮取
使用一次性解剖刀从组织片中刮取石蜡 组织至离心管中，尽量防止组织碎片飞 散造成交叉污染. 向含有石蜡组织的离心管中加入二甲苯， 通过二甲苯溶解石蜡并去除，再用无水乙 醇去除二甲苯。
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注意事项

使用二甲苯脱蜡，去蜡更完全，但二甲苯有毒；
观察脱蜡后形成的组织沉淀是否很紧实，如果异常，重复脱蜡;
真空旋转浓缩仪干燥组织中残余乙醇,充分干燥影响下一步消化; 电泳：用DEPC水清洗，及配胶（加甲醛）;
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控制交叉污染
必须严格控制样品间交叉污染

3.去除石蜡
4.裂解消化DNA
通过蛋白酶消化组蛋白,消化裂解3h。 （加入4µL蛋白酶，）
5.消化DNA与收集RNA
使用Ambion1975纯化柱收集
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RNA提取前
1.2 操作步骤 1.2.1 石蜡包埋组织样品的预处理 1.2.1.1. 取石蜡块和一张干净的称量纸，使用冷却后的洁净刀片将 组织轻轻刮下来，刮片厚度不大于50µ m，尽量避免刮下石蜡。 注意： 切取石蜡组织块的时候，组织碎屑越薄越好，并且尽可能 少地切取石蜡块。 1.2.1.2. 将刮取的组织小心地转移至干净的1.5ml 离心管中，至总体 积约为300 µ L。 1.2.1.3. 如果样品为石蜡切片，可以直接进行后续的脱蜡处理，但 是建议5-20µm石蜡卷量不要超过总厚度80µm：即5µm切片取16片， 而20µm切片取4片。 注意：如果需要进行miRNA实验，石蜡切片厚度应不低于10µm。