石蜡切片组织RNA提取
总RNA的提取及相关实验方法
总RNA的提取(Trizol法提取)在收集到生物材料之后,最好能即刻进行RNA制备工作。
若需暂时储存,则应以液氮将生物材料急速冷冻后,储存于-80℃冷冻柜。
在制备RNA时,将储存于冷冻柜的材料取出,立即以加入液氮研磨的方式打破细胞,不可以先行解冻,以避免RNase的作用。
1.提取组织RNA时,每50~100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解;提取细胞RNA时,先离心沉淀细胞,每5-10 ╳106个细胞加1ml Trizol后,反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞;2.将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟;3.在上述EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿,盖上EP管盖子,在手中用力震荡15秒,在室温下(15℃~30℃)放置2~3分钟后,12000g(2℃~8℃)离心15分钟;4.取上层水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇,在室温下(15℃~30℃)放置10分钟,12000g(2℃~8℃)离心10分钟;5.弃上清,按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤,涡旋混合,7500g(2℃~8℃)离心5分钟,弃上清;6.让沉淀的RNA在室温下自然干燥;7.用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。
PCR实验室常用DNA聚合酶有三种:TaKaRa Taq TM,TaKaRa E X Taq TM和Pyrobest TM DNA Polymerase。
TaKaRa Taq TM是一般的DNA聚合酶,保真性较差,但价钱便宜,一般用于基因表达的检测等。
TaKaRa E X Taq TM是具有Proof reading 活性的耐热性DNA聚合酶,具有一定的保真性,而且其扩增得到的PCR产物3’端附有一个“A”碱基,如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。
Pyrobest TM DNA Polymerase也是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶,其特点是保真性极高,扩增得到的PCR产物为平滑末端。
EASYspin-石蜡包埋组织RNA快速提取试剂盒操作方法及步骤说明书精品
EASYspin 石蜡包埋组织RNA 快速提取试剂盒目录号:RN3001适用范围:适用于快速从福尔马林固定、石蜡包埋组织样品中提取总RNA ,RNA 可用于反转录PCR ,荧光定量PCR 。
❖ 试剂盒组成、储存、稳定性:本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。
储存事项:1. 所有的溶液应该是澄清的,如果环境温度低时溶液可能形成沉淀,此时不应该直接使用,可在37℃水浴加热几分钟,即可恢复澄清。
2. 不合适的储存于低温(4℃或者-20℃)会造成溶液沉淀,影响使用效果,因此运输和储存均在室温下(15℃-25℃)进行。
3. 为避免降低活性,方便运输,提供蛋白酶K 为冻干粉状,收到后,可短暂离心后,加入0.5毫升灭菌水溶解(终浓度40mg/ml )。
因为反复冻融可能会降低酶活性,试剂盒组成 保存50次(RN3001) 裂解液PKD 室温 15 ml 结合液RBC 室温25 ml 漂洗液RW 室温10ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 蛋白酶K 粉 40mg/ml -20℃ 20mg RNase-free H 2O 室温 10 ml 基因组DNA 清除柱和收集管室温 50套 RNA 吸附柱RA 和收集管 室温 50套因此溶解后立即按照每次使用量)分装冻存,-20℃保存。
4.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
❖注意事项1.所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13,000 rpm的传统台式离心机,如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
2.样品处理量绝对不要超过基因组DNA清除柱和RNA吸附柱RA处理能力,否则造成DNA残留或者产量降低。
不同组织细胞种类RNA/DNA相差极大,例如胸腺脾脏DNA含量丰富,超过5mg就会超过柱子处理能力。
COS细胞RNA含量丰富,超过3x106细胞就会超过柱子吸附能力。
所以开始摸索实验条件时,如果不清楚样品DNA/RNA含量时宁可使用较少的样品处理量,如不超过2个10μm厚度石蜡切片。
石蜡包埋组织中RNA提取方法的改进和完善
石蜡包埋组织中RNA提取方法的改进和完善孟青,杨文秀,胡军,高勤(贵阳医学院病理学教研室,贵州贵阳550004)[摘要]目的:建立和完善石蜡组织RNA提取的方法。
方法:收集临床病理诊断用石蜡包埋组织块共100例,经RNA灭活处理后,进行组织切片、脱蜡、清洗、消化等一系列提取前预处理,用TRIZOL试剂提取组织的RNA,并在-20C长时间沉淀RNA。
对提取的RNA以核酸测定仪检测RNA的浓度和纯度,并通过RT-PCR检查提取RNA 的!-actin基因,以检测提取RNA的质量。
结果:100例石蜡包埋组织中提取的RNA经过核酸测定仪测定后,浓度在20~50mmoi/L,260nm及280nm光密度比在1.75~2.0;经过RT-PCR反应,提取的RNA都能扩增出190bp的!-actin目的片段。
结论:通过RNA提取前对材料的一系列合理处理,从福尔马林固定、石蜡包埋档案组织材料中提取小片段RNA进行目的基因mRNA检测,可以成为一种稳定成熟的方法应用于临床病理诊断。
[关键词]RNA,肿瘤;石腊包埋;逆转录聚合酶链反应[中图分类号]R730.23 [文献标识码]A [文章编号]1000-2707(2005)03-0241-03The Improvement of Isolation Technigue of RNA from Formalin-fixedand Paraffin-embedded TissuesMENG Oing,YANG Wen-xiu,HU Jun,GAO Oin(Department of Pathology,Guiyang Medical College,Guiyang550004,China)[Abstract]Objective:To improve the technigue for extracting RNA from formaiin-fixed and paraffin-embedded tissue.Methods:Sampies of100cases that diagnosed pathoiogicaiiy were coiiected.After some pretreatment such as deparaffinage,washing,digestion,totai RNA were extracted from these tis-sues with TRIZOL reagent and,then,kept at-20C for iong time(above2h)to settie RNA.The pureness and content of these RNA extracts were assayed with a nucieic acid detecting instrument and the guaiity of the extracts was tested with detecting of gene!-actin with RT-PCR.Results:The con-centration of RNA in the extracts were between20~50mmoi/L.The ratio of260nm/280nm were be-tween1.75~2.00.The RNA of!-actin were detected in aii cases.Conclusions:The reasonabie pre-treatment adopted in this study makes it feasibie to extract RNA from formaiin-fixed and paraffin-em-bedded tissue and to detect genes specific to some diseases in daiiy pathoiogicai diagnosis.[Key words]RNA,neopiasm;paraffin embedding;reverse transcriptase poiymerase chain reaction在实际临床病理诊断和病理回顾性研究中,来源最丰富、最容易获得的是经过石蜡包埋保存的档案组织。
石蜡包埋组织中提取RNA的方法改良
【 关键 词 】 石蜡包埋组织 ; N ;m 3 H R A n 2一 1
长期 以来 , 一方 面南于固定 和包埋处理使 R A分 子被 N 化学修饰或被降解 ,另一方面 由于 固定剂引起组织蛋 白质
1 临床资料 :4例肺腺 癌为大连 大学附 属新 华 医院胸外 2 科 19 9 8年 1 至 19 年 1 手 术 病 例 。 月 98 2月 2 主要试剂 : 鼠抗 人 n 3 H, m2 一 单克 隆抗 体 是 美 国 O cgn noe e Si c 公 司 产品 ,二 抗 、A c ne e D B试剂 盒均 为 Sna rt公 司产 a tCuz 品 。 m2 一 引物(:’G A c G A T C A c T 一 : n 3 Hl a5 c G c G G T A A C A 3; 一 b
21 0 0年 4月 上 第 2卷 第 7期
Ap i rl 2 1 0 0 V 0. 1 2 NO7 .
中国中 医药咨讯
J u n l fC n r dt n l ieeMe iieI fr to o r a hiaT a io a n s dcn nomain o i Ch ・69 ・
R A, 用 RT P R和 免 疫 组 化 方 法 检 测 2 N 应 —C 4例 石 蜡 包 埋 肺 腺 癌 组织 中 n 2 一 基 因 m N 及 其 蛋 白的 表 达 。结 果 : 从 石 m 3 Hl RA ①
蜡包 埋肺腺癌 组织 中提取 的总 R A质量较高 ; m 3 H1 因 m N N ②n 2 一 基 R A和其 蛋白表达率分别为 6 . 2 %和 6 . R — C 5 8 %, T P R结果 8
石蜡切片组织RNA提取PPT课件
3. RNA 抽提
1.2.2 二甲苯脱石蜡 1.2.2.1. 加入1ml 二甲苯,至上述离心管中,盖紧盖子,剧烈 震荡混匀5min;瞬时离心,将附着在管壁的组织收集至管底; 50℃,3min,离心机最大转速室温离心2min,弃上清。 注意: 二甲苯有毒,应尽量在通风橱中开盖操作,以减少实验 室空气污染。 1.2.2.2. 观察形成的组织沉淀是否很紧实,如果异常,重复 1.2.2.1实验操作。 1.2.2.3. 加入1ml无水乙醇至离心管中,剧烈震荡混匀2min,离 心机最大转速(13200rpm)室温离心2min,小心弃上清;重复此 步骤一次。
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3. RNA 抽提
1.2.3.2 加入4μL Protease后,上下颠倒混匀,如果组织附着 在管壁上,用枪头或瞬时离心使组织浸入到裂解液里。 1.2.3.3 置于恒温金属浴中孵育,50℃,500rpm摇动3h;然后 70℃,500rpm摇动20min。 注意:如果延长70℃反应时间,有可能导致RNA降解,故不要随 意延长时间。
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3. RNA 抽提
1.2.4.4 加500µL Wash2/3至Filter Cartridge上,10,000g, 30s,弃滤液。 1.2.4.5 空甩,10,000g,30s,,去除残留洗液。 1.2.5 DNA酶消化和RNA分离纯化
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3. RNA 抽提
1.2.4 总核酸提取
1.2.4.2 混匀,吸取700µL混合液至过滤柱里,为放止堵住 过滤柱,避免吸到大块未被消化掉的组织块到过滤柱里,然 后10,000g,30s,弃滤液至原管。 1.2.4.3 加700µL Wash1至Filter Cartridge上,10,000g, 30s,弃滤液。
组织石蜡切片 rna 提取试剂盒 用处
组织石蜡切片RNA提取试剂盒是一种用于从组织样本中提取RNA的实验试剂盒。
它的用处包括但不限于以下几个方面:1. 研究基因表达组织石蜡切片RNA提取试剂盒可以帮助科研人员从组织样本中提取出RNA,进而研究基因的表达情况。
通过分析组织中的RNA,可以了解特定基因在不同组织中的表达水平,从而揭示基因在生物体内的功能和调控机制。
2. 疾病诊断与治疗利用组织石蜡切片RNA提取试剂盒提取组织中的RNA,可以帮助医学研究人员研究与疾病相关的基因表达变化。
这对于疾病的早期诊断、疾病的分子机制研究以及疾病治疗靶点的筛选具有重要意义。
3. 药物研发在药物研发过程中,需要了解候选分子对于特定基因的调控情况,以及候选分子在不同组织中的代谢情况。
组织石蜡切片RNA提取试剂盒可以帮助药物研发人员获取组织样本中的RNA信息,为药物靶点的筛选和药效评价提供数据支持。
4. 癌症研究在癌症研究领域,组织石蜡切片RNA提取试剂盒可以帮助科研人员研究肿瘤组织中的基因表达情况,发现潜在的癌症标志物和治疗靶点,为个性化治疗提供依据。
5. 组织工程在组织工程领域,需要了解工程组织中细胞的基因表达情况,以评估工程组织的生物学特性和功能。
组织石蜡切片RNA提取试剂盒可以帮助研究人员从组织样本中提取RNA,为工程组织的设计和评估提供必要的基因表达数据。
总结起来,组织石蜡切片RNA提取试剂盒在基础医学研究、临床医学应用、药物研发、癌症研究、组织工程等领域都具有重要的应用价值。
它为科研人员提供了方便、快速、高效的方式来提取组织样本中的RNA,为相关研究和应用提供了可靠的实验基础。
随着生物技术和医学研究的不断深入,相信组织石蜡切片RNA提取试剂盒的应用领域还会不断拓展,为人类健康和疾病治疗带来新的突破和进展。
随着生物技术和医学研究的不断深入,组织石蜡切片RNA提取试剂盒的应用领域正在不断扩展和深化。
在医学研究领域,组织石蜡切片RNA提取试剂盒不仅扮演着起到提取RNA的作用,同时它还在分子医学、疾病机制研究、药物研发等方面发挥着重要作用。
石蜡切片rna提取步骤
石蜡切片rna提取步骤
石蜡切片RNA提取是从组织切片中获取RNA的一种方法,通常用于病理学研究。
以下是一般的步骤:
切片准备:
获取包含感兴趣组织的石蜡包埋切片,确保切片的质量和完整性。
脱蜡:
将切片置于适当的脱蜡溶液中,通常使用挥发性有机溶剂或低熔点的脱蜡剂,以去除石蜡。
这一步骤通常需要多次反复,确保充分脱蜡。
去脂质:
利用脱脂剂去除切片中的脂质,以提高RNA的纯度。
组织裂解:
使用裂解缓冲液将切片中的组织细胞裂解,释放RNA。
这可以通过将切片浸泡在裂解缓冲液中,或者直接在切片上涂覆裂解缓冲液来实现。
RNA提取:
使用RNA提取试剂盒或方法,如酚/氯仿法、琼脂糖柱法等,从裂解的组织中提取RNA。
这一步骤通常包括酚酚氯仿相分离,然后通过醇沉淀法或其他方法纯化RNA。
DNase I 处理:
通过使用DNase I来降解可能残留在RNA中的基因组DNA,以确保纯化的RNA是无DNA的。
RNA沉淀:
将RNA在异丙醇中沉淀,然后通过离心将RNA沉淀下来。
洗涤:
对RNA沉淀进行洗涤,以去除残留的盐和污染物。
干燥:
将RNA溶解并在适当的条件下干燥,准备进行后续的实验,如逆转录和定量PCR。
检测和质量控制:
使用分光光度计或其他RNA检测方法,如琼脂糖凝胶电泳、生物分析仪等,对提取的RNA进行浓度和纯度的检测和质量控制。
每一步都需要在RNAase-free(不含RNase酶)条件下进行,以避免RNA的降解。
整个过程需要严格控制实验室条件和使用RNase-free试剂、器具。
石蜡包埋组织rna完全解交联的方法
石蜡包埋组织rna完全解交联的方法石蜡包埋是一种固定和保护组织样本的方法,而RNA的完全解交联通常是在样本被包埋后的步骤。
以下是一种在石蜡包埋的组织中实现RNA完全解交联的基本方法:获取石蜡切片:从包埋组织中获得石蜡切片。
这通常涉及到用刀片或者微tome 从石蜡块上切割薄片的过程。
脱脂:将石蜡切片放置在去石蜡剂(如xylene)中,以去除石蜡。
这个步骤通常需要进行多次,确保完全去除石蜡。
水洗:将脱脂后的切片经过一系列浓度递减的醇(如95%、70%)和水洗涤,以去除去脂剂。
蛋白酶消化:使用蛋白酶(如蛋白酶K)进行组织中的蛋白质消化。
这一步有助于打破蛋白质的交联,使得RNA更容易被释放。
RNA抽提:使用适当的RNA抽提试剂(如TriZol)进行RNA的抽提。
这可以通过将抽提试剂加入组织样本中并进行机械破碎来完成。
DNA酶处理:在RNA抽提过程中,使用DNA酶来降解DNA。
这有助于进一步减少RNA和DNA之间的交联。
氨基酸处理:有时候,对组织进行氨基酸处理(例如,通过加入氨基酸溶液)可以帮助打破RNA的交联结构。
DNase I处理:使用DNase I处理,以进一步降解可能残留的DNA。
这可以在RNA 抽提后、纯化RNA前进行。
RNA纯化:对抽提的RNA进行纯化,通常通过使用RNA纯化试剂盒。
这一步有助于去除潜在的污染物。
质控:对解交联后的RNA进行质控,例如通过琼脂糖凝胶电泳或分析仪器,确保RNA的完整性和纯度。
这些步骤可以在确保RNA完全解交联的同时,最大限度地保留RNA的完整性和稳定性。
ffpe rna降解规律
ffpe(福尔马林固定石蜡包埋)rna降解规律是指从福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的组织标本中提取RNA时,RNA可能会发生降解的情况。
从石蜡包埋组织中提取RNA时,石蜡可以阻碍消化液对组织的渗透,因此,彻底脱蜡非常重要。
传统的脱蜡方式为二甲苯脱蜡,二甲苯脱蜡不仅容易造成核酸片段化和得率低,而且对人有毒害,切片越厚或存放时间越长,脱蜡效果越差。
此外,在RNA提取过程中,通过加入蛋白酶K消化与核酸结合的组蛋白,加入DNase 去除核酸中的DNA,最后得到纯净的RNA分子,可以减少RNA降解的风险,保证RNA的含量和完整性。
总的来说,从FFPE组织中提取RNA需要选择合适的方法和试剂,并注意操作细节,以减少RNA降解的风险,保证提取的RNA的质量。
石蜡包埋组织切片miRNA提取
加入150 μl裂解液RF以及10 μl Proteinase K于沉淀中,彻底涡旋混匀。
Step 8
55℃孵育15 min之后80℃孵育15 min。
Step 9
冰上放置3 min,12,000 rpm (~13,400×g)离心15 min,转移上清至新的2 ml RNase-Free离心管中。
Step 2
迅速将切片或刮取的样本置于1.5 ml RNase-free的离心管中,加入1 ml二甲
苯,剧烈涡旋10 sec。
Step 3
12,000 rpm(~13,400×g )室温离心2 min, 弃上清。
注意:建议用移液枪吸除上清,不要吸到沉 淀;不要用倾倒去除上清。
Step 4
在上述管中加入1 ml无水乙醇,涡旋混匀10 sec。
Step 18
将吸附柱CR3转入一个新的RNase-Free离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100 μl RNaseFree ddH2O,室温放置2 min,12,000 rpm (~13,400×g)离心2 min。 洗脱缓冲液体积不应少于30 μl,体积过小影响回收效率。RNA溶液请于-70℃保存,以防降解。
Step 10
加入16 μl的RDD 和10 μl的DNase I
颠倒混匀
室温放置15 min
Step 11
加入320 μl缓冲液RB
涡
涡旋混匀(可能会出现沉淀)
Step 13 and 14
转移700 μl溶液和沉淀入吸附柱CR3中(吸附柱放在收集管中),12,000 rpm (~13,400×g)离心1 min,弃掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中。
Step 5
室温(15-25℃),12000 rpm (~13,400×g)
石蜡切片中提取RNA
分析测试百科»经验共享» [急求]石蜡切片可以做RTPCR吗?2011-10-7 10:47 阿敏[急求]石蜡切片可以做RTPCR吗?[size=4][color=Black][font=楷体_GB2312][b][急求]石蜡切片可以做RTPCR吗?小妹刚开始设计试验,很菜鸟,想请问各位大侠:我做子宫内膜癌的两个基因的rtpcr,石蜡标本可以做rtpcr吗,有什么特殊要求?如果要用冰冻的收集时该注意那些问题呢?[/b][/font][/color][/size]2011-10-7 10:48 +田田+[size=4]当然可以,查询:石蜡包埋组织的DNA提取及其应用[/size]2011-10-7 10:49 阿敏[size=4][color=Black][font=楷体_GB2312][b]谢谢主任,不过大概是我没有讲清楚,我要做的是提取mRNA,逆转录cDNA.听说用石蜡切片很难出结果。
[/b][/font][/color][/size]2011-10-7 10:49 阿敏[size=4][color=Black][font=楷体_GB2312][b]谢谢主任,不过大概是我没有讲清楚,我要做的是提取mRNA,逆转录cDNA.听说用石蜡切片很难出结果。
[/b][/font][/color][/size]2011-10-7 10:49 #甜#[size=4][color=Purple][font=仿宋_GB2312]RNA早降解了,还怎么作RT-PCR!即使是新鲜的标本如果没有及时放入液氮冻存都作不出来。
别在这上面浪费时间了。
[/font][/color][/size]2011-10-7 10:50 131415[size=4]理论上是可以的,也有报道作出来的,但我周围没有,如果有时间和钱,可以一试,否则,就别浪费了[/size]2011-10-7 10:50 韩梅梅[size=4]关键是从石蜡组织中提取RNA,我用如下方法:1. 切片8μm×10张,置1.5ml EP管2. 脱蜡:加二甲苯1200μl, 震荡混匀,8600rpm, 10 min ×33. 无水乙醇1200μl, 震荡混匀,8600rpm, 5min ×24. 吸弃乙醇,37℃烤箱干燥30min5. 加裂解液200μl,酶K(20mg/ml)5μl6. 组织溶解后,95℃水浴10min,7. 4℃冰箱冷却8. 加1mlTrozol混匀,9. 加氯仿200μl,充分混匀,置3min10. 4℃, 13000rpm 15min.11. 吸取水相,加入等体积的异丙醇,-20℃2h12. 4℃, 13000rpm 15min.13. 弃上清,加75%乙醇1200μl清洗,14. 4℃, 11000rpm 10min.15. 弃上清,室温干燥8min,加20μl DEPC水溶解RNA,55℃10min16. -70℃保存[/size]2011-10-7 10:51 韩梅梅[size=4]我按上面的方法提取的石蜡组织里的mRNA ,效果不错.操作要注意:1.注意DEPC消毒2.活检组织及早固定\包埋3.注意实验的第一步里,切片了马上开始提取4.提取MRNA时,最好有人在一旁指导. [/size]2011-10-7 10:52 微笑的海豚[size=3][color=Navy][b]关于韩梅梅网友“石蜡组织中提取RNA”的几点商榷:1、石蜡包埋组织大多来自病理科,这种组织一般是从手术室几经周折到达病理科,其中间环节较多,很少有人会注意避免RNA的降解,因此这些组织中的RNA是很难逃脱降解的命运;2、即使有RNA保留也很难逃过上述脱蜡、烘烤等处理过程;3、“DEPC消毒”表达不妥,其作用是灭活RNA酶;4、石蜡包埋组织中DNA提取绝对没问题,提取RNA恐怕...............?[/b][/color][/size]2011-10-7 10:52 冰激凌小姐[color=DarkOrchid][size=4][font=楷体_GB2312][b]我有个师姐曾经用石蜡切片做过原位杂交,可以得到阳性结果,但用的是新鲜制备的蜡块,作RT也应该没问题吧[/b][/font][/size][/color]2011-10-7 10:53 饭团团[size=4]求救:请问各路高手,小妹要做的是从石蜡切片中提取DNA,从什么可以较上面的连接节省时间的方法阿?不胜感激!谢谢!急[/size]2011-10-7 10:53 不懂[size=4][color=Sienna]理论上是可以做TR-PCR的,可是效果不是很好,尤其是在石蜡切片上,如果真的想做一下,我认为应该注意一下几点:1 采取的组织应尽快的固定,并且采取时按照做RT-PCR的采样注意事项进行。
石蜡包埋乳腺癌组织的RNA提取及基因表达研究
石蜡包埋乳腺癌组织的RNA提取及基因表达研究孙冰;郭晓红;张利利;张峰;吴世凯;宋三泰;江泽飞;王敦梅;苏敏【期刊名称】《山东医药》【年(卷),期】2009(49)12【摘要】目的探索从石蜡包埋乳腺癌样本中提取总RNA的质量和产量,并检测其基因的表达情况.方法收集保存时间1~17 a不等的人乳腺癌石蜡组织样本153例,取5 μm厚切片1~15张,用Roche和Ambion两种试剂盒提取总RNA.采用随机引物将mRNA反转录为cDNA,SYBR Green Ⅰ染料法实时荧光定量PCR分析ACTB、GAPDH、RPLPO和GUSB管家基因mRNA的表达情况.结果 153例标本总RNA浓度在3~375 ng/μl范围,总产量0.18~18.5 μg,A260/280值在1.32~2.07范围,RNA琼脂糖凝胶电泳片段弥散在100~1 000 bp之间.81例样本的4个管家基因的平均Ct值在24~30范围,随着样本保存时间的延长,Ct值也逐渐增加.结论从石蜡包埋样品标本中提取的RNA产量及质量可满足实验的要求,总RNA 有所降解,但可以进行目的基因mRNA的检测, 保存10 a以上的样本也能够进行基因表达研究,在基础研究和临床实践方面具有广阔的应用价值.【总页数】3页(P15-17)【作者】孙冰;郭晓红;张利利;张峰;吴世凯;宋三泰;江泽飞;王敦梅;苏敏【作者单位】军事医学科学院附属医院,北京100071;汕头大学医学院;中国科学院,北京基因组研究所;中国科学院,北京基因组研究所;军事医学科学院附属医院,北京100071;军事医学科学院附属医院,北京100071;军事医学科学院附属医院,北京100071;中国科学院,北京基因组研究所;汕头大学医学院【正文语种】中文【中图分类】R737.9【相关文献】1.石蜡包埋乳腺癌组织DNA提取方法 [J], 康毓芝;王永兴;杨宝珍;韩恩善2.肝癌石蜡包埋组织miRNA提取方法的优化 [J], 党裔武;容敏华;陈罡3.石蜡包埋组织中RNA提取方法的改进和完善 [J], 孟青;杨文秀;胡军;高勤4.应用差别PCR检测石蜡包埋乳腺癌组织癌基因扩增时固定剂影响的研究 [J], 陈森清;马国建5.应用差别PCR检测石蜡包埋乳腺癌组织癌基因扩增时固定剂影响的研究 [J], 陈森清;马国建;等因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
从 TFPE Tissue 中提取 RNA
从福尔马林固定、石蜡包埋的组织中提取RNA实验开始前准备:第一次使用Buffer RPE 溶液,需要加入乙醇。
(即向11ml Buffer RPE浓缩液中加入44ml 乙醇(96%-100%)溶液)。
所有Buffer溶液应平衡至室温(15~25℃)。
配置Buffer RPE溶液要摇匀。
设置加热器,加热模块或水浴温度至56℃,方便后续步骤5和步骤9使用。
为了减少等待时间,另外设置加热器,加热模块或水浴温度至80℃,方便后续步骤9使用。
1.用切片机切掉样本中多余的石蜡。
2.每张切片切成5-20μm厚。
如果样本表面已经暴露在空气中,将2-3张切片厚度的样本切掉。
3.立即将切片放在1.5ml或者2ml或者2ml的微量离心管(无备用),盖上管盖。
4.加入160或320μl 脱蜡溶液,涡旋10s 混匀,简短离心使样本沉于管底。
(替换成备注Page25的步骤)5.56℃孵育3min,然后冷却至室温。
6.加入150 或者240μl Buffer PKD,涡旋混匀。
7.11,000xg(10,000rpm) 室温离心1min。
8.向透明液体分层处加入10μl 蛋白酶K。
用移液器上下轻轻吹吸混匀。
9.56℃孵育15min,然后80℃孵育15min。
10.将管底无色透明液体转至一个新的2ml微型离心管。
11.置于冰上孵育3min。
然后,20,000xg(13,500rpm ) 室温离心15min。
12.将上层清夜转至一新的微型离心管中(没提供),注意不要搅动小团物质(组织碎片聚集体?)。
13.加入十分之一总样本量的DNaseBooster Buffer溶液(大约16μl 或25μl )和常备的DNase I 溶液。
颠倒混匀。
简短离心,以除去管盖内壁的液滴。
14.室温孵育15min。
15.加入320μl 或500μl Buffer RBC 来调整体系,充分混匀溶解产物。
16.加入720μl 或1200μl 无水乙醇。
用移液器混匀。
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3.去除石蜡
4.裂解消化DNA
通过蛋白酶消化组蛋白,消化裂解3h。 (加入4µL蛋白酶,)
5.消化DNA与收集RNA
使用Ambion1975纯化柱收集
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RNA提取前
1.2 操作步骤 1.2.1 石蜡包埋组织样品的预处理 1.2.1.1. 取石蜡块和一张干净的称量纸,使用冷却后的洁净刀片将 组织轻轻刮下来,刮片厚度不大于50µ m,尽量避免刮下石蜡。 注意: 切取石蜡组织块的时候,组织碎屑越薄越好,并且尽可能 少地切取石蜡块。 1.2.1.2. 将刮取的组织小心地转移至干净的1.5ml 离心管中,至总体 积约为300 µ L。 1.2.1.3. 如果样品为石蜡切片,可以直接进行后续的脱蜡处理,但 是建议5-20µm石蜡卷量不要超过总厚度80µm:即5µm切片取16片, 而20µm切片取4片。 注意:如果需要进行miRNA实验,石蜡切片厚度应不低于10µm。
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3. RNA 抽提
1.2.4.4 加500µ L Wash2/3至Filter Cartridge上,10,000g,30s,弃 滤液。 1.2.4.5 空甩,10,000g,30s,,去除残留洗液。 1.2.5 DNA酶消化和RNA分离纯化
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3. RNA 抽提
1.2.5.2 加入60µ LDNase mix至每个Filter Cartridge中心,盖上管盖, 室温孵育30min。 1.2.5.3 加700µ L Wash1至Filter Cartridge上,室温孵育30-60s后, 10,000g,30s,弃滤液。 1.2.5.4 加500µ L Wash2/3至Filter Cartridge上,10,000g,30s,弃 滤液; 1.2.5.5 重复一次4.2.5.4操作后,10,000g,空甩1min。 1.2.5.6 将Filter Cartridge转入另一新Collection Tube管中,加60µ L Elution Solution到滤膜中心,盖上管盖室温静置1min后,最大转 速1min。 1.2.5.7 进行Nano Drop RNA定量,如果不马上定量,将样品保存 于-80℃。
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注意事项
使用二甲苯脱蜡,去蜡更完全,但二甲苯有毒;
观察脱蜡后形成的组织沉淀是否很紧实,如果异常,重复脱蜡;
真空旋转浓缩仪干燥组织中残余乙醇,充分干燥影响下一步消化; 电泳:用DEPC水清洗,及配胶(加甲醛);
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控制交叉污染
必须严格控制样品间交叉污染
从石蜡切片组织中提取RNA
董进曲/ Jinqu Dong 2013.12.26
ANNUAL BUSINESS REVIEW
概览
有关石蜡组织切片
补:DNA石蜡组织 切片。
试剂及仪器
样品处理 定量
RNA 质控RNA 提取
RNA 质控
电泳
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有关石蜡切片
石蜡切片(paraffin section): 组织学常规制片技术中最为
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3. RNA 抽提
1.2.4 总核酸提取
1.2.4.2 混匀,吸取700µ L混合液至过滤柱里,为放止堵住过 滤柱,避免吸到大块未被消化掉的组织块到过滤柱里,然后 10,000g,30s,弃滤液至原管。 1.2.4.3 加700µ L Wash1至Filter Cartridge上,10,000g,30s,弃 滤液。
切片
提取及质检
RNA
实验/数据
存放位置, 使用情况, 是否返还 样品移交记录(实验室间)
实验室信息管理系统 Microsoft Excel 手写记录
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RNA提取前
组织蜡块
切片
提取及质检
RNA
实验/数据
1.1 实验前的准备工作 1.1.1 打开超净台的紫外灯,灭菌15min,然后通风 10min。 1.1.2 在第一次使用Wash1和Wash2/3之前,按照下 列步骤加入无水乙醇:加入42mL的无水乙醇(如 试剂瓶上所示)至Wash1中,充分混匀,即为工作 液;加入48mL的无水乙醇(如试剂瓶上所示)至 Wash2/3中,充分混匀,即为工作液。 1.1.3 用镊子将刀片蘸取少量酒精,酒精灯上灼烧 刀片,冷却后备用。
广泛应用的方法。石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形 态结构,也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断 细胞组织的形态变化的主要方法,而且也已相当广泛地用于 其他许多学科领域的研究中。教学中,光镜下观察切片标本 多数是石蜡切片法制备的。活的细胞或组织多为无色透明, 各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差,在一般光镜 下不易清楚区别出;组织离开机体后很快就会死亡和产生组 织腐败,失去原有正常结构,因此,组织要经固定、石蜡包 埋、切片及染色等步骤以免细胞组织死亡,而能清晰辨认其 形态结构。
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有关石蜡切片
石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包
埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。 一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日,但标 本可以长期保存使用,为永久性显微玻片标本。
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Ambion1975
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石蜡组织切片RNA提取:实验原理
二甲苯&Ambion1975试剂盒: 通过二甲苯的去蜡以及蛋白酶K使RNA从石蜡组织中裂解释 放,并通过DNA吸附柱有效提取RNA. 关键点:
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3. RNБайду номын сангаас 抽提
1.2.2 二甲苯脱石蜡 1.2.2.1. 加入1ml 二甲苯,至上述离心管中,盖紧盖子,剧烈震荡 混匀5min;瞬时离心,将附着在管壁的组织收集至管底;50℃, 3min,离心机最大转速室温离心2min,弃上清。 注意: 二甲苯有毒,应尽量在通风橱中开盖操作,以减少实验 室空气污染。 1.2.2.2. 观察形成的组织沉淀是否很紧实,如果异常,重复 1.2.2.1实验操作。 1.2.2.3. 加入1ml无水乙醇至离心管中,剧烈震荡混匀2min,离心 机最大转速(13200rpm)室温离心2min,小心弃上清;重复此步 骤一次。
1.2.3.2 加入4μL Protease后,上下颠倒混匀,如果组织附着在管 壁上,用枪头或瞬时离心使组织浸入到裂解液里。 1.2.3.3 置于恒温金属浴中孵育,50℃,500rpm摇动3h;然后 70℃,500rpm摇动20min。 注意:如果延长70℃反应时间,有可能导致RNA降解,故不要 随意延长时间。
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石蜡组织切片RNA提取步骤
1.石蜡组织切片收集 及鉴定
每个样本以约300ul的石蜡组织切片量 为宜.
2.组织切片刮取
使用一次性解剖刀从组织片中刮取石蜡 组织至离心管中,尽量防止组织碎片飞 散造成交叉污染. 向含有石蜡组织的离心管中加入二甲苯, 通过二甲苯溶解石蜡并去除,再用无水乙 醇去除二甲苯。
一个样品用一个解剖刀片 实验前后清洁工作区
经常换手套
无PCR产物区域 尽量防止组织碎片飞散造成交叉污染
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试剂、仪器及耗材
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试剂、仪器及耗材
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试剂、仪器及耗材
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Thanks!
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受破坏RNA(固定步骤)
二甲苯:溶解并去除石蜡
降低RNA 得率 蛋白酶K:消化与RNA结合的组蛋白 后续分析困难
注:RNA降解
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内容
有关石蜡组织切片
1、样品处理
补:DNA石蜡组织 切片。
样品处理
2、RNA抽提
试剂及仪器
RNA 质控RNA 提取 RNA 质控 定量 电泳
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样品处理
组织蜡块
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3. RNA 抽提
1.2.2.4. 弃上清,室温短暂离心,用移液器将剩余的无水乙醇吸 出。 1.2.2.5. 真空旋转浓缩仪干燥组织中残余乙醇(5min),45℃,浓 缩时间<20min;如果室温晾干组织沉淀,时间为15-45 min。 。 1.2.3 蛋白酶消化
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3. RNA 抽提