真核表达系统的选择和高效表达策略
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真核表达系统的选择和高效表达策略
哺乳动物细胞表达系统
• 与其他的真核表达体系相比,哺乳动物细胞表达的 蛋白与天然蛋白的结构、糖基化类型和方式几乎 相同且能正确组装成多亚基蛋白,但成本较高。近 年来,研究者们主要通过改造宿主细胞和基因导入 方法来提高外源蛋白的表达效率。哺乳动物细胞 表达系统常用的宿主细胞有CHO、COS、BHK、 SP2 /0、N IH3T3等。将外源基因导入哺乳动物 细胞内的方法,主要有化学法、电穿孔法、基因枪 法和哺乳动物病毒载体系统等。
五、真核表达系统的选择和高效表达策略 真核生物表达系统主要包括： 酵母表达系统、杆状病毒表达系统、哺乳动 物细胞表达系统、 转基因植物表达系统、 杜氏盐藻生物反应器等五种表达系统。 其中应用最广泛的是酵母表达系统。
真核表达系统的选择和高效表达策略
真核表达系统的优点
• 真核表达系统具有翻译后的加工修饰体系, 表达的外源蛋白更接近于天然蛋白质。
真核表达系统的选择和 高效表达策略
2020/11/29
真核表达系统的选择和高效表达策略
教学内容
• 一、PCR引物的设计与实验操作技巧； 二、基因组文库的建立与筛选； 三、定向进化技术在微生物酶制剂研究中
• 的应用； 四、原核表达系统的选择和高效表达策略；
• 五、真核表达系统的选择和高效表达策略。
真核表达系统的选择和高效表达策略
• 在重组药物的多种表达体系中,转基因植物是最经济的。同 一种重组蛋白在植物中的生产成本是微生物发酵体系的2% -10% ,是哺乳动物细胞生产的0.1%。
真核表达系统的选择和高效表达策略
杜氏盐藻生物反应器
• 杜氏盐藻是一种单细胞真核藻类,没有细胞壁，原生质外 仅有一层糖蛋白和神经氨酸组成的外膜，具有一个杯状、 大型的叶绿体,体积约占细胞的一半。 盐藻是极其耐盐的， 可以在0. 05 - 5 mol/ l氯化钠的极端环境中生存。盐藻属 于光和自养生物,能利用简单的培养基进行培养，富含β胡 萝卜素、甘油、蛋白质等。盐藻作为新型的真核生物反应 器，除了具有转录和翻译后的加工能力外，还具有经济廉 价、简单有效、安全可靠等特点。由于它能在高盐条件下 培养，所以不会污染其他的微生物，这点是哺乳动物细胞 所不及的。外源基因在盐藻中的表达主要是集中在cat、 bar、gus和egfp等报告基因上,大多为瞬时表达。目前,只 有乙肝表面抗原(HbsAg)和筛选标记bar基因能够在盐藻中 稳定表达。 盐藻作为一种新型的生物反应器,目前还不能 真正生产外源性物质。 研究者们正从强启动子的筛选、 高效转化载体的构建、最佳转化方法的确立等几方面努力， 目前已经取得了一定的成果。
真核表达系统的选择和高效表达策略
巴斯德毕赤酵母表达系统
• 毕赤酵母能够成功表达出多种外源蛋白,是由于毕赤酵母 具有以下独特的优点:
• (1) 能够快速繁殖和进行高密度培养; • (2) 具有强启动子- 乙醇氧化酶(AOX1)基因启动子,并且能 • 够严格调控外源基因的表达; • (3) 可以对外源蛋白进行类似真核的加工折叠和翻译后修 • 饰,产物从而具有天然蛋白的活性; • (4) 表达产量高,杂蛋白少,并且能够胞外分泌表达,容易分 • 离提纯; • (5) 培养条件简单,成本低。 • 毕赤酵母与最早研究的酿酒酵母相比,能够高密度培养,
真核表达系统的选择和高效表达策略
酵母表达系统
• 主要包括酿酒酵母、裂殖酵母、克鲁维酵母、 甲醇酵母等表达系统。其中甲醇酵母基因表 达系统是一种最近发展迅速的外源蛋白质生 产系统，也是目前应用最广泛的酵母表达系 统。主要有H. polymorpha、Candida Bodinii、 Pichia Pastoris三种, 其中Pichia Pastoris作 为基因表达系统使用得最多、最广泛。由于 它具有无可匹敌的高表达特性,已被认为是最 具有发展前景的生产蛋白质的真核表达系统 之一。
真核表达系统的选择和高效表达策略
杆状病毒表达系统
• 昆虫杆状病毒表达系统是目前国内外十分推崇的 真核表达系统。利用杆状病毒结构基因中多角体 蛋白的强启动子构建的表达载体,可使很多真核目 的基因得到有效甚至高水平的表达。它具有真核 表达系统的翻译后加工功能,如二硫键的形成、糖 基化及磷酸化等,使重组蛋白在结构和功能上更接 近天然蛋白;其最高表达量可达昆虫细胞蛋白总量 的50%;可表达非常大的外源性基因(～200kD);具 有在同一个感染昆虫细胞内同时表达多个外源基 因的能力;对脊椎动物是安全的。由于病毒多角体 蛋白在病毒总蛋白中的含量非常高,至今已有很多 外源基因在此蛋白的强大启动子作用下获得高效 表达。
• pGAPZ. ②分泌表达载体。如p HIL2S1 ,p PIC9 K,p PICZα,p GAPZα。
• 目前主要采用酵母内源性的信号肽来引导外源基 因表达产物的分泌, 常用α2 因子信号肽。许多蛋 白的正确构象和翻译后加工(如糖基化等) 都是在 分泌途中完成的。
真核表达系统的选择和高效表达策略
Βιβλιοθήκη Baidu
真核表达系统的选择和高效表达策略
外源基因的转化及整合
• 将构建好的表达载体转入巴斯德毕赤酵母中诱导表达，其 常用的转化方法是电转化法和原生质体法,其中电转化法 最为方便,转化效率最高,最容易产生多拷贝整合. Zeocin 抑制细胞壁的形成,因此pPICZ 系列不能使用原生质体法 进行转化。转化时,载体DNA 必须切成线状才能与染色体 进行同源重组,将整个载体连同外源基因整入宿主染色体. 通常有以下几种整合方式: ①双位点互换。发生在染色体 AOX1 位点和表达质粒中的PAOX1及转录终止区,产生的 表达菌的表型为His+Mut-。②AOX1单位点互换。发生在 染色体和表达质粒的AOX1 区。产生的表型是His+Mut+。 ③His 单位点置换。发生在染色体His 位点和表达质粒的 His 位点,使得1 个或多个表达单位插入在His 位点,产生的 表型也是His+Mut+。巴斯德毕赤酵母载体在宿主染色体上 大多为单拷贝整合,由于PAOX1 的强启动性和整合后的稳 定性, 所以单拷贝也能获得较高的产量。
真核表达系统的选择和高效表达策略
信号肽序列
• 可供毕赤酵母选择的信号肽有外源蛋白自 身的信号肽和酵母本身的信号肽. 有些蛋白 的自身信号肽不能被毕赤酵母有效利用,可 试用甲醇酵母信号肽。目前可供选择的酵
母信号肽有2交配因子的前导肽序列、酸
性磷酸酶信号肽和蔗糖酶信号肽等。其中
酿酒酵母 2交配因子前导肽序列的使用最
真核表达系统的选择和高效表达策略
转基因植物表达系统
• 转基因植物是指利用一定的手段将外源性或内源性的基因 导入到植物体内,使植物的遗传性状改变而产生的植物体。 转基因植物作为生物反应器已在药物蛋白的生产中被广泛 使用,成功表达的药用蛋白质和多肽有:人的细胞因子、表 皮生长因子、促红细胞生成素、干扰素、生长激素、单克 隆抗体等. 烟草、马铃薯、大豆、香蕉、莴苣、羽扇豆等 作为生物反应器生产口服疫苗,也得到了人们的广泛关注。 转基因植物疫苗和药用蛋白的表达系统主要有农杆菌介导 的核转化系统、植物病毒瞬时高效表达载体和植物叶绿体 高效表达系统。 在研究成功的转基因植物药用蛋白中, 80%是由农杆菌介导形成的转基因植物表达系统生产。
• 得高表达, Genzyme 也利用GAP 启动子表达人几丁质酶, 不仅获得高表达,而且还可以避免蛋白酶水解。 此外， Phongdara 在Hansenul apolymorpha克隆到酸性磷酸 酶(p HO1) 基因启动子，这些启动子丰富了甲醇酵母对启 动子的选择。
真核表达系统的选择和高效表达策略
真核表达系统的选择和高效表达策略
酵母表达系统的优点
• ①酵母长期广泛应用于酿酒和食品工业, 不 会产生毒素, 安全可靠; ②酵母是真核生物, 能进行一些表达产物的加工, 有利于保持生 物产品的活性和稳定性; ③外源基因在酵母 中能分泌表达,表达产物分泌至胞外不仅有 利于纯化, 而且避免了产物在胞内大量蓄积 对细胞的不利影响; ④遗传背景清楚, 容易 进行遗传操作; ⑤ 较为完善的表达控制系统, 如PMA1 和PDR5 等强启动子可以介导目的 蛋白高水平表达, 表达蛋白的丰度可以达到 膜蛋白的10%;
真核表达系统的选择和高效表达策略
酵母表达系统的优点
• 此外, 采用诱导表达启动子可以在时间上严格控制 目的蛋白的表达, 如GAL1- 10( 半乳糖诱导) 、 PH05( 胞外无机磷诱导) 和HSE( 37℃温度诱导) ; ⑥生长繁殖迅速, 培养周期短, 工艺简单, 生产成 本低。
• 酵母菌用于真核基因的表达、分析, 既具有原核表 达系统生长迅速、操作简单、价格便宜等优点, 又 具有类似哺乳动物细胞的翻译后修饰过程, 因而特 别适用于大量生产真核重组蛋白, 正是由于有这些 优点, 使酵母功能基因组的研究得以走在生物功能 基因组研究的前列, 是应用最为普遍的真核表达系 统之一。
为广泛。 酶切割位点周围氨基酸序列及外 源蛋白的3 级结构可以影响信号肽的加工效 率。
真核表达系统的选择和高效表达策略
毕赤酵母表达载体的种类
• Invitrogen 公司开发出了若干系列的表达载体可 供选择。当前常用的巴斯德毕赤酵母表达载体可 分为2 类. ①胞内表达载体。如 pHIL2D2 ,pAO815 ,p PIC3 K,PICZ , pHWO10 ,
毕赤酵母表达载体上的选择标记
• 选择标记一般为对应于营养缺陷型受体 的野生型基因, 常用his4 , 也可用来源于酿 酒酵母的arg4基因和suc2基因. kanr基因和 Shbler 基因（Zeocin抗性基因）也能够作 为细菌和酵母菌的选择标记，并且携带这 两个标记的表达载体较其他表达载体更易 于筛选。
真核表达系统的选择和高效表达策略
巴斯德毕赤酵母表达载体的结构与 功能
真核表达系统的选择和高效表达策略
毕赤酵母表达载体的启动子
• Pichia pastoris 含有两个基因编码醇氧化酶:AOX1和 AOX2 ,二者序列有92 %同源性,但是AOX1表达水平高于 AOX2。AOX1 启动子的表达受甲醇严格调控。 以甲醇为 碳源生长时,约5%的mRNA由AOX1 基因转录。 PGAP(三 磷酸甘油醛脱氢酶启动子) 是最近在毕赤酵母中克隆到的 一个组成型启动子,GAP 启动子不需甲醇诱导,发酵工艺更 为简单.。Vassilen 利用GAP 启动子表达乙肝表面抗原获
真核表达系统的选择和高效表达策略
真核表达系统的选择和高效表达策略
Pichia pastoris表达载体
• 毕赤酵母表达载体包括自我复制型的游离载体和整合型载 体，但以整合型载体为主。常见的整合载体又分为胞内表 达和分泌表达2类。胞内表达的载体有pPIC3、pPIC3K、 pPIC3.5K 、 pHILD2 、 pPICZA 、 pPICZAB 和 pPICZAC 等 ； 分 泌 表 达 的 载 体 有 pPIC9 、 pPIC9K 、 pACO815 、 pPICZαA（B、C）和pHILS1等。通用的整合载体多含有 AOX1 启 动 子 ， 有 一 个 外 源 基 因 表 达 框 、 多 克 隆 位 点 （ MCS ） 和 一 个 从 AOX1 基 因 上 拷 贝 下 来 的 终 止 序 列 （TT），作为筛选标记的his4 基因和在细菌中进行复制 起始点和选择标记（如ColE1复制起始点和抗氨苄青霉素 基因）以及AOX13’端的非编码区序列，使外源基因能以 同源重组的方式整合到染色体的AOX1部位。
容易实现工业化,并且不存在酿酒酵母的过度糖基化问题, 也不易产生免疫原性问题。
真核表达系统的选择和高效表达策略
巴斯德毕赤酵母表达系统
• 巴斯德毕赤酵母菌株： • 一 般 用 于 外 源 基 因 表 达 的 Pichia pastoris 菌 株 有
Y211430 ,M2C10023 , GS115 , X-33，KM71 , SMD1168 等. 根据利用甲醇的能力, 可将巴斯德毕赤酵母分为3 型: ①Mut + 型为甲醇快利用型, 此型毕赤酵母具有完整的 AOX1 和AOX2 基因, 绝大多数毕赤酵母为Mut + 表型。 ② Muts 型,此型毕赤酵母菌(如KM71) 细胞AOX2 基因编码的 醇氧化酶可产生15%AOX活性,为甲醇慢利用型。③Mut型(如M2G10023) , 此型毕赤酵母AOX1 及AOX2 基因均 被敲除,为甲醇不利用型。研究发现, 蛋白酶缺陷型毕赤酵 母, 如SMD1163,SMD1165 和SMD1168 可有效降低外源 目的蛋白的酶解。 一般说来,蛋白胞内表达时,优先考虑用 Muts 表型,对于分泌表达,Mut+和Muts都可使用。甲醇慢 利用型有时比Mut+ 型菌株能够达到更高的表达量。
哺乳动物细胞表达系统
• 与其他的真核表达体系相比,哺乳动物细胞表达的 蛋白与天然蛋白的结构、糖基化类型和方式几乎 相同且能正确组装成多亚基蛋白,但成本较高。近 年来,研究者们主要通过改造宿主细胞和基因导入 方法来提高外源蛋白的表达效率。哺乳动物细胞 表达系统常用的宿主细胞有CHO、COS、BHK、 SP2 /0、N IH3T3等。将外源基因导入哺乳动物 细胞内的方法,主要有化学法、电穿孔法、基因枪 法和哺乳动物病毒载体系统等。
五、真核表达系统的选择和高效表达策略 真核生物表达系统主要包括： 酵母表达系统、杆状病毒表达系统、哺乳动 物细胞表达系统、 转基因植物表达系统、 杜氏盐藻生物反应器等五种表达系统。 其中应用最广泛的是酵母表达系统。
真核表达系统的选择和高效表达策略
真核表达系统的优点
• 真核表达系统具有翻译后的加工修饰体系, 表达的外源蛋白更接近于天然蛋白质。
真核表达系统的选择和 高效表达策略
2020/11/29
真核表达系统的选择和高效表达策略
教学内容
• 一、PCR引物的设计与实验操作技巧； 二、基因组文库的建立与筛选； 三、定向进化技术在微生物酶制剂研究中
• 的应用； 四、原核表达系统的选择和高效表达策略；
• 五、真核表达系统的选择和高效表达策略。
真核表达系统的选择和高效表达策略
• 在重组药物的多种表达体系中,转基因植物是最经济的。同 一种重组蛋白在植物中的生产成本是微生物发酵体系的2% -10% ,是哺乳动物细胞生产的0.1%。
真核表达系统的选择和高效表达策略
杜氏盐藻生物反应器
• 杜氏盐藻是一种单细胞真核藻类,没有细胞壁，原生质外 仅有一层糖蛋白和神经氨酸组成的外膜，具有一个杯状、 大型的叶绿体,体积约占细胞的一半。 盐藻是极其耐盐的， 可以在0. 05 - 5 mol/ l氯化钠的极端环境中生存。盐藻属 于光和自养生物,能利用简单的培养基进行培养，富含β胡 萝卜素、甘油、蛋白质等。盐藻作为新型的真核生物反应 器，除了具有转录和翻译后的加工能力外，还具有经济廉 价、简单有效、安全可靠等特点。由于它能在高盐条件下 培养，所以不会污染其他的微生物，这点是哺乳动物细胞 所不及的。外源基因在盐藻中的表达主要是集中在cat、 bar、gus和egfp等报告基因上,大多为瞬时表达。目前,只 有乙肝表面抗原(HbsAg)和筛选标记bar基因能够在盐藻中 稳定表达。 盐藻作为一种新型的生物反应器,目前还不能 真正生产外源性物质。 研究者们正从强启动子的筛选、 高效转化载体的构建、最佳转化方法的确立等几方面努力， 目前已经取得了一定的成果。
真核表达系统的选择和高效表达策略
巴斯德毕赤酵母表达系统
• 毕赤酵母能够成功表达出多种外源蛋白,是由于毕赤酵母 具有以下独特的优点:
• (1) 能够快速繁殖和进行高密度培养; • (2) 具有强启动子- 乙醇氧化酶(AOX1)基因启动子,并且能 • 够严格调控外源基因的表达; • (3) 可以对外源蛋白进行类似真核的加工折叠和翻译后修 • 饰,产物从而具有天然蛋白的活性; • (4) 表达产量高,杂蛋白少,并且能够胞外分泌表达,容易分 • 离提纯; • (5) 培养条件简单,成本低。 • 毕赤酵母与最早研究的酿酒酵母相比,能够高密度培养,
真核表达系统的选择和高效表达策略
酵母表达系统
• 主要包括酿酒酵母、裂殖酵母、克鲁维酵母、 甲醇酵母等表达系统。其中甲醇酵母基因表 达系统是一种最近发展迅速的外源蛋白质生 产系统，也是目前应用最广泛的酵母表达系 统。主要有H. polymorpha、Candida Bodinii、 Pichia Pastoris三种, 其中Pichia Pastoris作 为基因表达系统使用得最多、最广泛。由于 它具有无可匹敌的高表达特性,已被认为是最 具有发展前景的生产蛋白质的真核表达系统 之一。
真核表达系统的选择和高效表达策略
杆状病毒表达系统
• 昆虫杆状病毒表达系统是目前国内外十分推崇的 真核表达系统。利用杆状病毒结构基因中多角体 蛋白的强启动子构建的表达载体,可使很多真核目 的基因得到有效甚至高水平的表达。它具有真核 表达系统的翻译后加工功能,如二硫键的形成、糖 基化及磷酸化等,使重组蛋白在结构和功能上更接 近天然蛋白;其最高表达量可达昆虫细胞蛋白总量 的50%;可表达非常大的外源性基因(～200kD);具 有在同一个感染昆虫细胞内同时表达多个外源基 因的能力;对脊椎动物是安全的。由于病毒多角体 蛋白在病毒总蛋白中的含量非常高,至今已有很多 外源基因在此蛋白的强大启动子作用下获得高效 表达。
• pGAPZ. ②分泌表达载体。如p HIL2S1 ,p PIC9 K,p PICZα,p GAPZα。
• 目前主要采用酵母内源性的信号肽来引导外源基 因表达产物的分泌, 常用α2 因子信号肽。许多蛋 白的正确构象和翻译后加工(如糖基化等) 都是在 分泌途中完成的。
真核表达系统的选择和高效表达策略
Βιβλιοθήκη Baidu
真核表达系统的选择和高效表达策略
外源基因的转化及整合
• 将构建好的表达载体转入巴斯德毕赤酵母中诱导表达，其 常用的转化方法是电转化法和原生质体法,其中电转化法 最为方便,转化效率最高,最容易产生多拷贝整合. Zeocin 抑制细胞壁的形成,因此pPICZ 系列不能使用原生质体法 进行转化。转化时,载体DNA 必须切成线状才能与染色体 进行同源重组,将整个载体连同外源基因整入宿主染色体. 通常有以下几种整合方式: ①双位点互换。发生在染色体 AOX1 位点和表达质粒中的PAOX1及转录终止区,产生的 表达菌的表型为His+Mut-。②AOX1单位点互换。发生在 染色体和表达质粒的AOX1 区。产生的表型是His+Mut+。 ③His 单位点置换。发生在染色体His 位点和表达质粒的 His 位点,使得1 个或多个表达单位插入在His 位点,产生的 表型也是His+Mut+。巴斯德毕赤酵母载体在宿主染色体上 大多为单拷贝整合,由于PAOX1 的强启动性和整合后的稳 定性, 所以单拷贝也能获得较高的产量。
真核表达系统的选择和高效表达策略
信号肽序列
• 可供毕赤酵母选择的信号肽有外源蛋白自 身的信号肽和酵母本身的信号肽. 有些蛋白 的自身信号肽不能被毕赤酵母有效利用,可 试用甲醇酵母信号肽。目前可供选择的酵
母信号肽有2交配因子的前导肽序列、酸
性磷酸酶信号肽和蔗糖酶信号肽等。其中
酿酒酵母 2交配因子前导肽序列的使用最
真核表达系统的选择和高效表达策略
转基因植物表达系统
• 转基因植物是指利用一定的手段将外源性或内源性的基因 导入到植物体内,使植物的遗传性状改变而产生的植物体。 转基因植物作为生物反应器已在药物蛋白的生产中被广泛 使用,成功表达的药用蛋白质和多肽有:人的细胞因子、表 皮生长因子、促红细胞生成素、干扰素、生长激素、单克 隆抗体等. 烟草、马铃薯、大豆、香蕉、莴苣、羽扇豆等 作为生物反应器生产口服疫苗,也得到了人们的广泛关注。 转基因植物疫苗和药用蛋白的表达系统主要有农杆菌介导 的核转化系统、植物病毒瞬时高效表达载体和植物叶绿体 高效表达系统。 在研究成功的转基因植物药用蛋白中, 80%是由农杆菌介导形成的转基因植物表达系统生产。
• 得高表达, Genzyme 也利用GAP 启动子表达人几丁质酶, 不仅获得高表达,而且还可以避免蛋白酶水解。 此外， Phongdara 在Hansenul apolymorpha克隆到酸性磷酸 酶(p HO1) 基因启动子，这些启动子丰富了甲醇酵母对启 动子的选择。
真核表达系统的选择和高效表达策略
真核表达系统的选择和高效表达策略
酵母表达系统的优点
• ①酵母长期广泛应用于酿酒和食品工业, 不 会产生毒素, 安全可靠; ②酵母是真核生物, 能进行一些表达产物的加工, 有利于保持生 物产品的活性和稳定性; ③外源基因在酵母 中能分泌表达,表达产物分泌至胞外不仅有 利于纯化, 而且避免了产物在胞内大量蓄积 对细胞的不利影响; ④遗传背景清楚, 容易 进行遗传操作; ⑤ 较为完善的表达控制系统, 如PMA1 和PDR5 等强启动子可以介导目的 蛋白高水平表达, 表达蛋白的丰度可以达到 膜蛋白的10%;
真核表达系统的选择和高效表达策略
酵母表达系统的优点
• 此外, 采用诱导表达启动子可以在时间上严格控制 目的蛋白的表达, 如GAL1- 10( 半乳糖诱导) 、 PH05( 胞外无机磷诱导) 和HSE( 37℃温度诱导) ; ⑥生长繁殖迅速, 培养周期短, 工艺简单, 生产成 本低。
• 酵母菌用于真核基因的表达、分析, 既具有原核表 达系统生长迅速、操作简单、价格便宜等优点, 又 具有类似哺乳动物细胞的翻译后修饰过程, 因而特 别适用于大量生产真核重组蛋白, 正是由于有这些 优点, 使酵母功能基因组的研究得以走在生物功能 基因组研究的前列, 是应用最为普遍的真核表达系 统之一。
为广泛。 酶切割位点周围氨基酸序列及外 源蛋白的3 级结构可以影响信号肽的加工效 率。
真核表达系统的选择和高效表达策略
毕赤酵母表达载体的种类
• Invitrogen 公司开发出了若干系列的表达载体可 供选择。当前常用的巴斯德毕赤酵母表达载体可 分为2 类. ①胞内表达载体。如 pHIL2D2 ,pAO815 ,p PIC3 K,PICZ , pHWO10 ,
毕赤酵母表达载体上的选择标记
• 选择标记一般为对应于营养缺陷型受体 的野生型基因, 常用his4 , 也可用来源于酿 酒酵母的arg4基因和suc2基因. kanr基因和 Shbler 基因（Zeocin抗性基因）也能够作 为细菌和酵母菌的选择标记，并且携带这 两个标记的表达载体较其他表达载体更易 于筛选。
真核表达系统的选择和高效表达策略
巴斯德毕赤酵母表达载体的结构与 功能
真核表达系统的选择和高效表达策略
毕赤酵母表达载体的启动子
• Pichia pastoris 含有两个基因编码醇氧化酶:AOX1和 AOX2 ,二者序列有92 %同源性,但是AOX1表达水平高于 AOX2。AOX1 启动子的表达受甲醇严格调控。 以甲醇为 碳源生长时,约5%的mRNA由AOX1 基因转录。 PGAP(三 磷酸甘油醛脱氢酶启动子) 是最近在毕赤酵母中克隆到的 一个组成型启动子,GAP 启动子不需甲醇诱导,发酵工艺更 为简单.。Vassilen 利用GAP 启动子表达乙肝表面抗原获
真核表达系统的选择和高效表达策略
真核表达系统的选择和高效表达策略
Pichia pastoris表达载体
• 毕赤酵母表达载体包括自我复制型的游离载体和整合型载 体，但以整合型载体为主。常见的整合载体又分为胞内表 达和分泌表达2类。胞内表达的载体有pPIC3、pPIC3K、 pPIC3.5K 、 pHILD2 、 pPICZA 、 pPICZAB 和 pPICZAC 等 ； 分 泌 表 达 的 载 体 有 pPIC9 、 pPIC9K 、 pACO815 、 pPICZαA（B、C）和pHILS1等。通用的整合载体多含有 AOX1 启 动 子 ， 有 一 个 外 源 基 因 表 达 框 、 多 克 隆 位 点 （ MCS ） 和 一 个 从 AOX1 基 因 上 拷 贝 下 来 的 终 止 序 列 （TT），作为筛选标记的his4 基因和在细菌中进行复制 起始点和选择标记（如ColE1复制起始点和抗氨苄青霉素 基因）以及AOX13’端的非编码区序列，使外源基因能以 同源重组的方式整合到染色体的AOX1部位。
容易实现工业化,并且不存在酿酒酵母的过度糖基化问题, 也不易产生免疫原性问题。
真核表达系统的选择和高效表达策略
巴斯德毕赤酵母表达系统
• 巴斯德毕赤酵母菌株： • 一 般 用 于 外 源 基 因 表 达 的 Pichia pastoris 菌 株 有
Y211430 ,M2C10023 , GS115 , X-33，KM71 , SMD1168 等. 根据利用甲醇的能力, 可将巴斯德毕赤酵母分为3 型: ①Mut + 型为甲醇快利用型, 此型毕赤酵母具有完整的 AOX1 和AOX2 基因, 绝大多数毕赤酵母为Mut + 表型。 ② Muts 型,此型毕赤酵母菌(如KM71) 细胞AOX2 基因编码的 醇氧化酶可产生15%AOX活性,为甲醇慢利用型。③Mut型(如M2G10023) , 此型毕赤酵母AOX1 及AOX2 基因均 被敲除,为甲醇不利用型。研究发现, 蛋白酶缺陷型毕赤酵 母, 如SMD1163,SMD1165 和SMD1168 可有效降低外源 目的蛋白的酶解。 一般说来,蛋白胞内表达时,优先考虑用 Muts 表型,对于分泌表达,Mut+和Muts都可使用。甲醇慢 利用型有时比Mut+ 型菌株能够达到更高的表达量。