真核表达系统的选择和高效表达策略
真核细胞诱导表达系统研究进展
真核细胞诱导表达系统研究进展主要内容一．选题背景二．原核生物表达真核蛋白的缺点三．常见的几种真核表达系统四．总结与展望一、选题背景•随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。
利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段，但由于通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，因此，组成型表达系统的应用受到一定限制。
•基因工程的发展使许多微量蛋白得以大量表，使许多难以制备的蛋白得以表达。
大肠杆菌Ecoli表达系统是目前为止最为有效的和方便的表达系统，可以进行许多异源蛋白的高效表达，但在进行一些蛋白的表达时，会产生许多困难。
二、原核生物表达真核蛋白的缺点1、外源蛋白在E.coli中的大量表达是以不溶性的包涵体的形式存在于细胞内，而包涵体的分离破碎通常会造成目的蛋白的失活；2、真核基因通常含有内含子，在E.coli中是不能进行正确的剪切和拼接的，因此必须表达它的cDNA序列；3、真核生物的许多蛋白都是糖蛋白，用E.coli作为表达宿主，不能对真核蛋白进行正确的糖基化等翻译后加工，很难得到有活性的真核表达系统。
三、常见的几种真核表达系统1、四环素诱导表达系统2、蜕皮激素诱导表达系统3、生物素诱导表达系统4、哺乳动物细胞表达系统1、四环素诱导表达系统此系统的作用依赖于四环素调控的反式作用因子(tTA/rtTA)和反式作用因子依赖的启动子两个成分。
四环素反式激活蛋白(tTA)是一个包含大肠杆菌TN10四环素耐药操纵子阻遏物和单纯疱疹病毒p16蛋白(VP16)C端部分的融合蛋白,tTA依赖启动子由融合有RNA聚合酶Ⅱ启动子的四环素操纵子(tet O)基因序列构成,这种融合使真核细胞中的tet阻遏物成为很强的翻译激活物。
作用机理：在缺乏四环素及其衍生物的条件下tTA与tetO序列结合，使tTA依赖启动子的转录过程被激活；而在存在四环素及其衍生物的条件下，tTA无法与其靶位点相互作用，转录也就无法进行。
真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体
真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体标签：真核细胞酵母表达系统细胞表达载体真核表达系统昆虫表达系统动物表达系统摘要: 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。
原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。
自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。
并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。
随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。
利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。
在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。
该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌)，通过iptg诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。
其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。
但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难;而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。
为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域，其优点是：①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性，故不存在基因的非特异性激活或抑制;②能诱导基因高效表达，可达105倍，为其他系统所不及;③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关”，还可人为地调控基因表达量。
真核表达系统的选择和高效表达策略
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信号肽序列
• 可供毕赤酵母选择的信号肽有外源蛋白自 身的信号肽和酵母本身的信号肽. 有些蛋白 的自身信号肽不能被毕赤酵母有效利用,可 试用甲醇酵母信号肽。目前可供选择的酵
酵母表达系统的优点此外采用诱导表达启动子可以在时间上严格控制目的蛋白的表达如gal110半乳糖诱导ph05胞外无机磷诱导和hse37温度诱导生长繁殖迅速培养周期短工艺简单生产成酵母菌用于真核基因的表达分析既具有原核表达系统生长迅速操作简单价格便宜等优点具有类似哺乳动物细胞的翻译后修饰过程因而特别适用于大量生产真核重组蛋白正是由于有这些优点使酵母功能基因组的研究得以走在生物功能基因组研究的前列是应用最为普遍的真核表达系统之一
容易实现工业化,并且不存在酿酒酵母的过度糖基化问题, 也不易产生免疫原性问题。
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巴斯德毕赤酵母表达系统
• 巴斯德毕赤酵母菌株： • 一 般 用 于 外 源 基 因 表 达 的 Pichia pastoris 菌 株 有
Y211430 ,M2C10023 , GS115 , X-33，KM71 , SMD1168 等. 根据利用甲醇的能力, 可将巴斯德毕赤酵母分为3 型: ①Mut + 型为甲醇快利用型, 此型毕赤酵母具有完整的 AOX1 和AOX2 基因, 绝大多数毕赤酵母为Mut + 表型。 ② Muts 型,此型毕赤酵母菌(如KM71) 细胞AOX2 基因编码的 醇氧化酶可产生15%AOX活性,为甲醇慢利用型。③Mut型(如M2G10023) , 此型毕赤酵母AOX1 及AOX2 基因均 被敲除,为甲醇不利用型。研究发现, 蛋白酶缺陷型毕赤酵 母, 如SMD1163,SMD1165 和SMD1168 可有效降低外源 目的蛋白的酶解。 一般说来,蛋白胞内表达时,优先考虑用 Muts 表型,对于分泌表达,Mut+和Muts都可使用。甲醇慢 利用型有时比Mut+ 型菌株能够达到更高的表达量。
基因工程3大肠杆菌表达系统
至今，仍未鉴定出通用有效的翻译起始序列的保 守结构，但却已经发展出许多种可以用来有效地降 低在mRNA转录本5’-末端形成二级结构的实验方法， 从而提高克隆的外源基因的表达效率。 例如: 在RBS序列中增加AT含量；诱发特异碱基 发生定点突变；以及使用翻译偶联系统进行克隆基 因的表达。
5、容易进行代谢调控；
6、容易进行DNA重组技术操作； 7、产物的产量、产率高， 8、产物容易提取纯化。
宿主细胞分为两大类：
1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、
链霉菌等；
2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物
细胞等。
一、真核基因的大肠杆菌表达体系
目前，已被用于表达外源蛋白质的表达系 统有细菌（大肠杆菌和枯草杆菌）、酵母、昆 虫、植物和哺乳动物细胞等。但比较而言，大 肠杆菌表达系统具有明显的优越性。
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外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理
• • • • • 启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数
转录水平
翻译水平
（1）启动子
要使克隆的外源基因高水平表达的最佳 启动子，必须具备以下几个条件： 1）必须是一个强启动子。 2）这个启动子应能呈现一种低限的基础表达 水平。使用高度抑制型的启动子是一种极为 重要的条件。 3）这种启动子应是诱导型的，能通过简单的 方式使用廉价的诱导物而得以诱导，如物理 （如热）和化学（如IPTG）诱导 。
（5）翻译终止密码
对mRNA翻译终止而言，一个必不可少的条 件是必须存在终止密码子。因此，在构建大肠杆 菌表达载体时，通常安置上全部的三个终止密码 子，以便阻止发生核糖体的“跳跃”现象。
cho细胞表达系统及筛选原理
cho细胞表达系统及筛选原理Cho细胞表达系统及筛选原理一、引言Cho细胞表达系统是一种常用的哺乳动物细胞表达系统，被广泛应用于重组蛋白的生产。
本文将介绍Cho细胞表达系统的原理以及其在蛋白质筛选中的应用。
二、Cho细胞表达系统的原理Cho细胞是一种中国仓鼠卵巢细胞系，具有较高的生长速度和蛋白质表达能力。
Cho细胞表达系统主要包括以下几个关键步骤。
1. 转染将目标基因导入Cho细胞中，通常使用质粒转染法或病毒载体转染法。
质粒转染法通过将目标基因插入质粒DNA中，然后利用转染试剂将质粒DNA导入细胞内。
病毒载体转染法则通过构建携带目标基因的病毒载体，将其感染到Cho细胞中。
2. 选择性筛选为了确保只有转染成功的细胞能够表达目标蛋白，通常在培养基中添加适当的选择性抗生素，如G418或葡萄糖酸钾。
只有转染成功的细胞才能抵抗抗生素的作用，存活下来。
3. 扩增和表达经过筛选的细胞将被扩增培养，以获得足够数量的细胞进行大规模蛋白质表达。
通常选择合适的培养基和培养条件，以提高细胞的生长速度和蛋白质表达水平。
4. 蛋白质纯化经过表达的目标蛋白质需要进行纯化，以去除其他杂质。
常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。
通过这些方法，可以获得高纯度的目标蛋白质。
三、Cho细胞表达系统在蛋白质筛选中的应用Cho细胞表达系统在蛋白质筛选中具有以下优势。
1. 高表达水平Cho细胞具有较高的蛋白质表达能力，能够快速产生大量目标蛋白。
这对于需要大量蛋白质的研究和工业应用非常有利。
2. 真核细胞表达与原核细胞表达系统相比，Cho细胞表达系统能够实现真核细胞蛋白质表达。
这使得Cho细胞表达系统适用于需要进行正确的蛋白质翻译修饰、蛋白质折叠和组装的蛋白质研究。
3. 可选择性筛选通过添加适当的选择性抗生素，可以筛选出成功表达目标蛋白的细胞。
这样可以确保筛选后的细胞具有较高的表达水平和纯度。
4. 灵活性Cho细胞表达系统可以应用于多种类型的蛋白质，包括单链抗体、重组蛋白、酶等。
蛋白质表达的常见问题及其解决办法
蛋白质表达的常见问题及其解决办法蛋白质表达是生物学研究中的一个关键步骤，它涉及到将基因信息转化为具有功能性蛋白质的过程。
然而，在蛋白质表达的过程中，常常会遇到一些问题，这些问题可能会影响到研究的进展和结果。
本文将介绍蛋白质表达中常见的问题，并提供相应的解决办法。
一、表达系统选择不当在蛋白质表达过程中，选择合适的表达系统是至关重要的。
不同的表达系统在表达效率、折叠状态和产量等方面存在差异。
常见的表达系统包括大肠杆菌（E. coli）、酵母、哺乳动物细胞等。
找到适合自己研究目的的表达系统是解决表达问题的第一步。
解决办法：根据研究的目的和所需蛋白质的特性选择合适的表达系统。
对于简单蛋白质，E. coli系统往往是一个不错的选择。
对于复杂的蛋白质，可以考虑使用酵母或哺乳动物细胞系统。
此外，还可以尝试使用不同的表达载体和宿主菌株，优化表达条件来提高表达效率和产量。
二、蛋白质无法正确折叠蛋白质的折叠状态是其功能的基础，如果无法正确地折叠，可能导致蛋白质无法发挥预期的功能。
在某些情况下，蛋白质可能会出现聚集、形成夹心态或夹杂体等异常折叠状态。
解决办法：针对无法正确折叠的蛋白质，可以考虑使用分子伴侣（chaperone）辅助折叠。
分子伴侣是一类在细胞中参与蛋白质正确折叠的分子，通过与目标蛋白质相互作用，帮助其正确折叠，并防止其异常聚集。
此外，还可以优化表达条件，如温度、培养基成分等，以提供适合蛋白质折叠的环境。
三、蛋白质表达产量较低蛋白质表达的产量是一个关键指标，特别是对于需要大量蛋白质进行后续实验的研究。
然而，很多时候表达产量较低，难以满足研究需求。
解决办法：提高蛋白质表达产量可以从多个方面入手。
首先，可以优化表达载体和宿主菌株的选择，采用高效表达载体和具有高表达能力的宿主菌株。
其次，可以优化表达条件，如诱导条件、培养温度、培养时间等。
此外，还可以使用辅助表达因子，如融合标签或信号肽，来提高表达产量。
四、目标蛋白质的纯化困难在蛋白质表达之后，需要对目标蛋白质进行纯化，以获取高纯度的蛋白质进行后续实验。
真核细胞表达系统
真核细胞表达系统常用的真核表达系统有酵母、杆状病毒／昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统。
简而言之，酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高，生产成本低，但加工修饰体系与哺乳动物细胞不完全相同；哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质，但其表达量低、操作烦琐。
1.酵母表达系统最早应用于蛋白表达的酵母是酿酒酵母，后来相继出现其他种类酵母，其中甲醇酵母表达系统应用最广泛。
甲醇酵母的表达载体含有大肠杆菌复制起点和筛选标志，可在大肠杆菌大量扩增。
甲醇酵母表达载体中含有与酵母染色体中同源的序列，容易整合入酵母染色体中。
大部分甲醇酵母的表达载体中都含有醇氧化酶基因-1(AOX1)，在强启动子作用下，以甲醇为唯一碳源的条件下诱导外源基因表达。
甲醇酵母表达蛋白一般需很长时问才能达到峰值水平，实验操作过程中有甲醇毒性和一定安全风险。
2.昆虫细胞表达系统杆状病毒载体广泛应用于培养的昆虫细胞中指导外源基因的表达，其中大多含有苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)中的多角体启动子。
杆状病毒系统蛋白表达量很高，而且大部分蛋白质能保持可溶性。
杆状病毒基因组较大(130kb)，可容纳大的外源DNA片段；杆状病毒启动子在哺乳动物细胞中没有活性，安全性较高。
目前常用的是以位点特异性转位至大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体，能快速有效地产生重组杆状病毒。
与通过外源基因重组在昆虫细胞中产生杆状病毒重组体相比，大大简化了操作步骤，缩短了鉴定重组病毒的时间，适于表达蛋白突变体以进行结构或功能的研究。
3.哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞能够指导蛋白质的正确折叠，它所表达的真核蛋白通常能被正确修饰，在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质，几乎都能在细胞内准确定位，在医学研究中得到广泛应用。
虽然哺乳动物细胞表达比大肠杆菌表达难度大，更耗时，成本更高，但是对于熟悉细胞培养的研究人员表达小到中等量的蛋白非常实用。
哺乳动物细胞表达载体包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等。
蛋白质的高效表达和纯化技术
蛋白质的高效表达和纯化技术蛋白质是细胞中最为基本的分子，不仅构成细胞的基本结构，也参与到细胞的代谢、信号转导等生命活动中。
因此，蛋白质的高效表达和纯化技术是生命科学研究的重要基础。
蛋白质的表达技术主要包括原核和真核表达系统。
原核表达系统包括大肠杆菌和酵母表达系统，这两种表达系统都具有高效的蛋白质表达能力，并且易于操作和大规模生产。
在酵母表达系统中，通常会将目的蛋白质基因插入到酵母表达载体中，然后通过转化酵母细胞实现表达。
大肠杆菌表达系统则是将目的蛋白质基因插入到大肠杆菌表达载体中，然后通过转化大肠杆菌细胞进行表达。
相比于酵母表达系统，大肠杆菌表达系统具有更高的表达速率，但表达的蛋白质常常是未折叠的形态，需要进一步的纯化和折叠过程。
真核表达系统则利用真核细胞本身的细胞器完成蛋白质的表达和折叠，这类表达系统可以用于表达大多数复杂的蛋白质。
例如，哺乳动物细胞表达系统（如CHO细胞和HEK293细胞）是利用哺乳动物细胞自身的蛋白合成机制进行表达的，这种表达系统通常会得到高质量的蛋白质，但生产成本相对较高。
对于高效的蛋白质表达来说，关键是基因的优化和载体的选择。
在基因的优化方面，通常会进行基因的序列优化、信号肽的选取、启动子的选择等操作，以提高蛋白质的表达量和纯度。
而载体的选择则需要根据具体的表达需求进行选择，例如对于大肠杆菌表达系统来说，常用的载体有pET系列载体和pBAD系列载体；对于酵母表达系统来说，常用的载体有pYES2和pGAPZ系列载体；对于哺乳动物细胞表达系统来说，常用的载体有pCDNA3.1和pEF系列载体。
在蛋白质的纯化方面，常用的方法有离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤等。
离子交换层析是利用离子交换树脂对带有带电的蛋白质进行分离，在这个过程中，可以通过改变洗脱缓冲液的pH或离子浓度来调节分离效果。
亲和层析则是通过利用蛋白质与其特异性配体之间的亲和性实现分离，例如亲和层析树脂中的金属离子会与带有多个组氨酸残基的蛋白质结合形成配位键，从而实现分离。
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• (1) 能够快速繁殖和进行高密度培养; • (2) 具有强启动子- 乙醇氧化酶(AOX1)基因启动子,并且能 • 够严格调控外源基因的表达; • (3) 可以对外源蛋白进行类似真核的加工折叠和翻译后修 • 饰,产物从而具有天然蛋白的活性; • (4) 表达产量高,杂蛋白少,并且能够胞外分泌表达,容易分 • 离提纯; • (5) 培养条件简单,成本低。 • 毕赤酵母与最早研究的酿酒酵母相比,能够高密度培养,
真核表达系统的选择和高效表达策略
转基因植物表达系统
• 转基因植物是指利用一定的手段将外源性或内源性的基因 导入到植物体内,使植物的遗传性状改变而产生的植物体。 转基因植物作为生物反应器已在药物蛋白的生产中被广泛 使用,成功表达的药用蛋白质和多肽有:人的细胞因子、表 皮生长因子、促红细胞生成素、干扰素、生长激素、单克 隆抗体等. 烟草、马铃薯、大豆、香蕉、莴苣、羽扇豆等 作为生物反应器生产口服疫苗,也得到了人们的广泛关注。 转基因植物疫苗和药用蛋白的表达系统主要有农杆菌介导 的核转化系统、植物病毒瞬时高效表达载体和植物叶绿体 高效表达系统。 在研究成功的转基因植物药用蛋白中, 80%是由农杆菌介导形成的转基因植物表达系统生产。
真核表达系统的选择和高效表达策略
酵母表达系统
• 主要包括酿酒酵母、裂殖酵母、克鲁维酵母、 甲醇酵母等表达系统。其中甲醇酵母基因表 达系统是一种最近发展迅速的外源蛋白质生 产系统，也是目前应用最广泛的酵母表达系 统。主要有H. polymorpha、Candida Bodinii、 Pichia Pastoris三种, 其中Pichia Pastoris作 为基因表达系统使用得最多、最广泛。由于 它具有无可匹敌的高表达特性,已被认为是最 具有发展前景的生产蛋白质的真核表达系统 之一。
真核表达系统的选择和高效表达策略
真核表达系统的选择和高效表达策略
Pichia pastoris表达载体
• 毕赤酵母表达载体包括自我复制型的游离载体和整合型载 体，但以整合型载体为主。常见的整合载体又分为胞内表 达和分泌表达2类。胞内表达的载体有pPIC3、pPIC3K、 pPIC3.5K 、 pHILD2 、 pPICZA 、 pPICZAB 和 pPICZAC 等 ； 分 泌 表 达 的 载 体 有 pPIC9 、 pPIC9K 、 pACO815 、 pPICZαA（B、C）和pHILS1等。通用的整合载体多含有 AOX1 启 动 子 ， 有 一 个 外 源 基 因 表 达 框 、 多 克 隆 位 点 （ MCS ） 和 一 个 从 AOX1 基 因 上 拷 贝 下 来 的 终 止 序 列 （TT），作为筛选标记的his4 基因和在细菌中进行复制 起始点和选择标记（如ColE1复制起始点和抗氨苄青霉素 基因）以及AOX13’端的非编码区序列，使外源基因能以 同源重组的方式整合到染色体的AOX1部位。
五、真核表达系统的选择和高效表达策略 真核生物表达系统主要包括： 酵母表达系统、杆状病毒表达系统、哺乳动 物细胞表达系统、 转基因植物表达系统、 杜氏盐藻生物反应器等五种表达系统。 其中应用最广泛的是酵母表达系统。
真核表达系统的选择和高效表达策略
真核表达系统的优点
• 真核表达系统具有翻译后的加工修饰体系, 表达的外源蛋白更接近于天然蛋白质。
真核表达系统的选择和高效表达策略
信号肽序列
• 可供毕赤酵母选择的信号肽有外源蛋白自 身的信号肽和酵母本身的信号肽. 有些蛋白 的自身信号肽不能被毕赤酵母有效利用,可 试用甲醇酵母信号肽。目前可供选择的酵
母信号肽有2交配因子的前导肽序列、酸
性磷酸酶信号肽和蔗糖酶信号肽等。其中
酿酒酵母 2交配因子前导肽序列的使用最
真核表达系统的选择和高效表达策略
酵母表达系统的优点
• 此外, 采用诱导表达启动子可以在时间上严格控制 目的蛋白的表达, 如GAL1- 10( 半乳糖诱导) 、 PH05( 胞外无机磷诱导) 和HSE( 37℃温度诱导) ; ⑥生长繁殖迅速, 培养周期短, 工艺简单, 生产成 本低。
• 酵母菌用于真核基因的表达、分析, 既具有原核表 达系统生长迅速、操作简单、价格便宜等优点, 又 具有类似哺乳动物细胞的翻译后修饰过程, 因而特 别适用于大量生产真核重组蛋白, 正是由于有这些 优点, 使酵母功能基因组的研究得以走在生物功能 基因组研究的前列, 是应用最为普遍的真核表达系 统之一。
真核表达系统的选择和高效表达策略
杆状病毒表达系统
• 昆虫杆状病毒表达系统是目前国内外十分推崇的 真核表达系统。利用杆状病毒结构基因中多角体 蛋白的强启动子构建的表达载体,可使很多真核目 的基因得到有效甚至高水平的表达。它具有真核 表达系统的翻译后加工功能,如二硫键的形成、糖 基化及磷酸化等,使重组蛋白在结构和功能上更接 近天然蛋白;其最高表达量可达昆虫细胞蛋白总量 的50%;可表达非常大的外源性基因(～200kD);具 有在同一个感染昆虫细胞内同时表达多个外源基 因的能力;对脊椎动物是安全的。由于病毒多角体 蛋白在病毒总蛋白中的含量非常高,至今已有很多 外源基因在此蛋白的强大启动子作用下获得高效 表达。
真核表达系统的选择和高效表达策略
酵母表达系统的优点
• ①酵母长期广泛应用于酿酒和食品工业, 不 会产生毒素, 安全可靠; ②酵母是真核生物, 能进行一些表达产物的加工, 有利于保持生 物产品的活性和稳定性; ③外源基因在酵母 中能分泌表达,表达产物分泌至胞外不仅有 利于纯化, 而且避免了产物在胞内大量蓄积 对细胞的不利影响; ④遗传背景清楚, 容易 进行遗传操作; ⑤ 较为完善的表达控制系统, 如PMA1 和PDR5 等强启动子可以介导目的 蛋白高水平表达, 表达蛋白的丰度可以达到 膜蛋白的10%;
真核表达系统的选择和高效表达策略
哺乳动物细胞表达系统
• 与其他的真核表达体系相比,哺乳动物细胞表达的 蛋白与天然蛋白的结构、糖基化类型和方式几乎 相同且能正确组装成多亚基蛋白,但成本较高。近 年来,研究者们主要通过改造宿主细胞和基因导入 方法来提高外源蛋白的表达效率。哺乳动物细胞 表达系统常用的宿主细胞有CHO、COS、BHK、 SP2 /0、N IH3T3等。将外源基因导入哺乳动物 细胞内的方法,主要有化学法、电穿孔法、基因枪 法和哺乳动物病毒载体系统等。
毕赤酵母表达载体上的选择标记
• 选择标记一般为对应于营养缺陷型受体 的野生型基因, 常用his4 , 也可用来源于酿 酒酵母的arg4基因和suc2基因. kanr基因和 Shbler 基因（Zeocin抗性基因）也能够作 为细菌和酵母菌的选择标记，并且携带这 两个标记的表达载体较其他表达载体更易 于筛选。
容易实现工业化,并且不存在酿酒酵母的过度糖基化问题, 也不易产生免疫原性问题。
真核表达系统的选择和高效表达策略
巴斯德毕赤酵母表达系统
• 巴斯德毕赤酵母菌株： • 一 般 用 于 外 源 基 因 表 达 的 Pichia pastoris 菌 株 有
Y211430 ,M2C10023 , GS115 , X-33，KM71 , SMD1168 等. 根据利用甲醇的能力, 可将巴斯德毕赤酵母分为3 型: ①Mut + 型为甲醇快利用型, 此型毕赤酵母具有完整的 AOX1 和AOX2 基因, 绝大多数毕赤酵母为Mut + 表型。 ② Muts 型,此型毕赤酵母菌(如KM71) 细胞AOX2 基因编码的 醇氧化酶可产生15%AOX活性,为甲醇慢利用型。③Mut型(如M2G10023) , 此型毕赤酵母AOX1 及AOX2 基因均 被敲除,为甲醇不利用型。研究发现, 蛋白酶缺陷型毕赤酵 母, 如SMD1163,SMD1165 和SMD1168 可有效降低外源 目的蛋白的酶解。 一般说来,蛋白胞内表达时,优先考虑用 Muts 表型,对于分泌表达,Mut+和Muts都可使用。甲醇慢 利用型有时比Mut+ 型菌株能够达到更高的表达量。
• 在重组药物的多种表达体系中,转基因植物是最经济的。同 一种重组蛋白在植物中的生产成本是微生物发酵体系的2% -10% ,是哺乳动物细胞生产的0.1%。
真核表达系统的选择和高效表达策略
杜氏盐藻生物反应器
• 杜氏盐藻是一种单细胞真核藻类,没有细胞壁，原生质外 仅有一层糖蛋白和神经氨酸组成的外膜，具有一个杯状、 大型的叶绿体,体积约占细胞的一半。 盐藻是极其耐盐的， 可以在0. 05 - 5 mol/ l氯化钠的极端环境中生存。盐藻属 于光和自养生物,能利用简单的培养基进行培养，富含β胡 萝卜素、甘油、蛋白质等。盐藻作为新型的真核生物反应 器，除了具有转录和翻译后的加工能力外，还具有经济廉 价、简单有效、安全可靠等特点。由于它能在高盐条件下 培养，所以不会污染其他的微生物，这点是哺乳动物细胞 所不及的。外源基因在盐藻中的表达主要是集中在cat、 bar、gus和egfp等报告基因上,大多为瞬时表达。目前,只 有乙肝表面抗原(HbsAg)和筛选标记bar基因能够在盐藻中 稳定表达。 盐藻作为一种新型的生物反应器,目前还不能 真正生产外源性物质。 研究者们正从强启动子的筛选、 高效转化载体的构建、最佳转化方法的确立等几方面努力， 目前已经取得了一定的成果。
• pGAPZ. ②分泌表达载体。如p HIL2S1 ,p PIC9 K,p PICZα,p GAPZα。
• 目前主要采用酵母内源性的信号肽来引导外源基 因表达产物的分泌, 常用α2 因子信号肽。许多蛋 白的正确构象和翻译后加工(如糖基化等) 都是在 分泌途中完成的。
真核表达系统的选择和高效表达策略
真核表达系统的选择和 高效表达策略
2020/11/29
真核表达系统的选择和高效表达策略
教学内容
• 一、PC酶制剂研究中
• 的应用； 四、原核表达系统的选择和高效表达策略；
• 五、真核表达系统的选择和高效表达策略。
真核表达系统的选择和高效表达策略