小胶质细胞培养及鉴定
BV2小胶质细胞经典激活及替代激活的诱导及鉴定
BV2小胶质细胞经典激活及替代激活的诱导及鉴定发表时间：2016-06-01T16:50:22.310Z 来源：《河南中医》2015年8月作者：吴非1,2 罗涛2 郭远瑾2 黎红华1 梅元武2[导读] 小胶质细胞是中枢神经系统内重要的固有免疫细胞，也是介导免疫反应的主要效应细胞。
吴非1,2 罗涛2 郭远瑾2 黎红华1 梅元武2（1.广州军区武汉总医院神经内科湖北武汉 430070）（2.华中科技大学协和医院神经内科湖北武汉 430022）【摘要】目的：观察BV2小胶质细胞经典激活及替代激活后代谢分子的变化，判断鉴别M1及M2极化型小胶质细胞的方法。
方法：小胶质细胞以100ng/ml的LPS及20ng/mL的IL-4分别经典激活及替代激活24小时，以ELISA方法检测IL-12、IL-10、TNF-α的分泌量，以实时荧光定量聚合酶链反应检测iNOS、Arg-1、IL-10、IL-12的mRNA表达，以流式细胞术检测细胞膜MMr蛋白表达。
结果：小胶质细胞被LPS 经典激活后呈M1型极化，IL-12、TNF-α分泌量、iNOSmRNA、IL-12mRNA表达量明显升高，与生理对照组比较有统计学差异（p<0.05)。
小胶质细胞被IL-4替代激活后呈M2极化， IL-10分泌量、Arg-1mRNA及IL-10mRNA表达量显著升高，流式细胞术检测MMr蛋白荧光强度较生理对照组显著上升（p<0.05)。
结论：小胶质细胞的能够被LPS经典激活呈M1型极化，IL-4替代激活呈M2型极化，M1/M2极化状态的小胶质细胞能够通过检测炎性相关因子、精氨酸代谢分子及细胞膜特异性蛋白三个方面得到鉴别。
【关键词】小胶质细胞；经典激活；替代激活；M1/M2型极化；脂多糖；白介素-4【中图分类号】R741 【文献标识码】B 【文章编号】1003-5028（2015）8-0651-02The Identification of Classical or Alternative Activation on BV2 MicrogliaWu Fei1,2,Luo Tao2,GuoYuan-jing2,Li Hong-Hua1, Mei Yuan-wu2（1 Department of neurology, Wuhan General Hospital of Guangzhou Military 430070）（2.Department of neurology, Wuhan Union Hospital, HuaZhong University of Science and Technology 430022)【Abstract】Objective：To observe the changes in metabolic molecule of BV2 microglia after it is classical or alternative activated, and judge the methods to identify the M1 or M2 -type polarized microglia cells. Methods：BV2 microglia cells were classical activated by LPS in the concentration of 100ng/ml and alternative activated by IL-4 in the concentration of 20ng/mL for 24 hours, then ELISA was used to measure the levels of IL-12, IL-10, TNF-α , and Real-time PCR was used to detect the mRNA expression of iNOS,Arg-1, IL-10 and IL-12. Flow cytometry(FCM) was used to measure the levels of MMr membrane protein . Results：Microglia presented M1-type polarization state after it were classical activated, the secretion of IL-12 and TNF-α, the expression of iNOS mRNA and IL-12mRNA were significantly increased , and the difference were significant compare with that of in normal control group（P<0.05）. Microglia presented M2-type polarization state after it were alternative activated, and the secretion of IL-10, the expression of Arg-1mRNA and IL-10mRNA were significantly increased, and the difference were significant compared with that of in normal control group（P<0.05）. The levels of MMr were also increased significantly measured by Flow cytometry(FCM). Conclusion： BV2 microglia could present M1-type polarization state after it were classical activated, M2-type polarization state after alternative activated. The two type polarization could be identified detected from three aspects including inflammatory factors , arginine metabolic molecular and specific cell membrane proteins. 【Keywords】microglia，classical activation，alternative activation，M1/M2 type polarization， lipopolysaccharide，interleukin-4 小胶质细胞是中枢神经系统内重要的固有免疫细胞，也是介导免疫反应的主要效应细胞[1]。
BV-2 小鼠小胶质瘤细胞
BV-2 小鼠小胶质瘤细胞
简单介绍
BV-2 小鼠小胶质瘤细胞，ATCC细胞|细胞系|细胞株|肿瘤细胞株|细胞|贴壁细胞|悬浮细胞|；细胞库管理规范，提供的细胞株背景清楚，提供参考文献和最优培养条件；
BV-2 小鼠小胶质瘤细胞的详细介绍
BV-2 小鼠小胶质瘤细胞
培养条件：
完全培养基：RPMI 1640+10%胎牛血清
培养条件：37.0C carbon dioxide(CO2),5%
传代方法：
收到细胞后，取出培养瓶在倒置显微镜下观察细胞生长情况。
（一）如果细胞未长满，用75%酒精喷洒整个瓶消毒后放到超菌台内，严格无菌操作，打开细胞培养瓶，吸出培养液，仅留下10ml培养液在瓶内继续培养。
(二)如果细胞已长满，即可进行传代培养。
具体步骤如下：
1. 弃去培养液，用PBS（不含钙，镁离子）洗1-2次。
2. 加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，倒转放于37度培养箱1-3分钟预热，然后又将培养瓶倒转大约30秒后，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆分散，轻敲几下培养培养瓶，细胞随即脱落下来。
3. 加入6-8ml完全培养基，吸出，分到新的培养瓶中。
一传二。
注意：传代后一半用我们的培养基，一半用你们的，以免细胞不适应而造
成生长不好。
冻存方法：冻存液：95%完全培养液，5%DMSO
储存：液氮储存。
小胶质细胞的研究方法
小胶质细胞的研究方法小胶质细胞是一类位于中枢神经系统的非神经元细胞，它们在神经发育、维持神经环境稳定以及参与神经传导等方面发挥着重要的作用。
因此，研究小胶质细胞的方法对于深入了解神经系统的功能和疾病机制具有重要意义。
本文将介绍几种常用的小胶质细胞研究方法。
一、细胞培养小胶质细胞的细胞培养是研究小胶质细胞的基础方法之一。
细胞培养可以提供一个受控的实验环境，使得研究者可以对小胶质细胞进行多种实验操作。
通常，从小鼠或人脑中分离小胶质细胞，然后将其培养在含有合适培养基和生长因子的培养皿中。
通过细胞培养，可以研究小胶质细胞的形态、生理功能以及对外界刺激的响应等方面的特性。
二、免疫组织化学免疫组织化学是一种常用的研究小胶质细胞的方法。
通过标记特定的抗体，可以检测和定位小胶质细胞中的蛋白质或其他分子。
例如，通过使用特异性抗体标记小胶质细胞的特定表面标志物，可以帮助研究者确定细胞的类型和分布情况。
此外，免疫组织化学还可以用于检测小胶质细胞在神经系统中的反应和功能改变。
三、转录组学分析转录组学分析是研究小胶质细胞基因表达的重要方法。
通过RNA 测序技术，可以全面地了解小胶质细胞中基因的表达水平和变化。
这种方法可以帮助研究者发现小胶质细胞在不同发育阶段、疾病状态或受到不同刺激时的基因表达差异，进而揭示小胶质细胞在神经系统功能和疾病中的作用。
四、原位杂交原位杂交是研究小胶质细胞基因表达和分布的重要方法之一。
通过标记适当的探针，可以检测和定位小胶质细胞中具体基因的mRNA。
这种方法可以帮助研究者确定小胶质细胞中不同基因的表达模式和分布情况，进一步了解小胶质细胞的功能和相互作用。
五、功能性研究为了研究小胶质细胞的功能和影响，研究者还可以使用多种功能性实验方法。
例如，通过细胞钙成像技术可以监测小胶质细胞中的钙离子浓度变化，从而研究其对于神经信号传导的调控作用。
此外，还可以利用细胞电生理技术记录小胶质细胞的膜电位变化，以及使用基因敲除或过表达等方法研究小胶质细胞中特定基因的功能。
小胶质细胞原代培养
小胶质细胞原代培养时间：15天试剂：出生后1-2天的新生C57BL/6小鼠（斯莱克）9只DF12培养基（GIBCO，C11330）90ml胎牛血清（FBS）(10%) （GIBCO，10099）5ml解剖液50ml1 x胰蛋白酶(0.25%)（Gibco，25200-072）10ml10mg/ml DNA酶70ul75%酒精200ml器材：酒精棉球1杯（20个）装有75%酒精的敞口容器1个原代解剖器械盒（2把中号镊子，1把中号剪刀，1把眼科弯镊，1把眼科直镊，1把眼科剪，2把显微镊，1把显微剪）洗净消毒后小瓶3个（带盖子）小平皿4个（带盖子）解剖镜+冷光源消毒后卫生纸12张1ml移液器1把+枪头1盒10ml玻璃离心管3个T75大培养瓶3个消毒后吸管3根紫外消毒白大褂1件试剂配制：中和胰蛋白酶用的完全培养基：DF12 45ml和FBS 5ml混合而成。
步骤：1、取出生后1-2天的新生C57BL/6小鼠9只，泡在酒精中消毒后取出大脑，置于放有解剖液的小平皿中，在解剖镜下剥离血管膜关键：注意无菌操作；剥离血管膜要完全2、将剥离完血管膜的大脑放入预置有1ml解剖液的青霉素小瓶中，用显微剪剪碎（<1mm3）关键：剪碎效果较用枪头吹吸好，要剪得尽量碎3、加入两滴DNA酶和1ml胰酶（胰酶终浓度为0.125%），于37℃孵箱中孵育15分钟关键：每5分钟可略微晃动一下以助于消化4、取出小瓶，将液体倒入离心管中，加5ml完全培养基，离心（1000rpm*5分钟），取出离心管，吸出上清，再加入5ml无血清培养基，吹打后静置沉降20分钟，将上清用吸管吸出，加入T 75大培养瓶中，放入孵箱中培养，3小时后换液。
关键：静置沉降后吸取上清液时吸取中层（最上层和最下层均不要），避免杂质吸入培养瓶中5、每7天换一次液，培养14天后取出，在摇床中培养6小时（200rpm ，37o C），取上清加入离心管中离心（400g*8分钟），弃上清，加入4ml无血清培养基轻轻吹打重悬，均匀滴加于24孔培养板的中央4个孔中，于孵箱中培养半小时使小胶质细胞贴壁，取出，吸出上清，再每个孔加1ml培养基，即得较纯净的小胶质细胞。
小胶质细胞人补体攻膜复合物亚溶破模型制作及功能鉴定
小胶质细胞人补体攻膜复合物亚溶破模型制作及功能鉴定【摘要】目的：体外建立小鼠小胶质细胞补体攻膜复合物亚溶破模型，并进行功能鉴定, 探讨补体攻膜复合物( sublytic membrane attack complex, sMAC ) 对中枢神经系统小胶质细胞的亚溶破刺激效应.方法: 分离培养新生小鼠大脑皮层小胶质细胞, 用酵母多糖激活急性期患者血清制备补体优球蛋白 C56，以新鲜正常人血清( NHS ) 作为 C7～C9 来源，体外组装小鼠小胶质细胞 sMAC 亚溶破模型，CCK8 比色实验确定 sMAC 亚溶破剂量，激光共聚焦显微镜 ( LSCM )鉴定 sMAC 沉积.脱落细胞计数及台盼蓝拒染法分别判定细胞黏附力变化及脱落细胞活力. ELISA 法测定 sMAC 对小胶质细胞 NO 和 TNFα分泌量的影响. 结果：确定C56 1∶480，NHS 1∶20 为小胶质细胞亚溶破补体量；LSCM显示sMAC 沉积于小胶质细胞表面； sMAC 刺激小胶质细胞后与对照组相比细胞脱落增加 ( )，而活力正常. 刺激后 12 h NO 及 TNFα分泌量比对照组显着增加 (P )，不同时相观察sMAC 刺激后小胶质细胞 TNFα分泌量均显着高于失活 sMAC (). 结论：sMAC刺激小胶质细胞后分泌 NO 及 TNFα增多，并且可降低小胶质细胞黏附力而不影响细胞活力，推测 sMAC 对小胶质细胞具有炎性刺激效应.【关键词】 C56；补体攻膜复合物；小神经胶质细胞；显微镜检查，共焦；细胞活力; 一氧化氮；肿瘤坏死因子0引言补体系统是机体防御外侵的天然免疫屏障,由30余种血清蛋白组成，具有级联酶促和自我调节反应，可通过经典或旁路途径激活，形成膜攻击复合物产生杀伤效应. 对MAC 的早期研究仅局限于对红细胞的溶破，后期研究显示，非致死量的 MAC结合到有核细胞可刺激细胞发生多种病理、生理变化，如产生氧自由基、细胞因子，诱导膜蛋白表达等，在多种疾病的发生和发展中发挥作用，该效应被称为补体攻膜复合物的亚溶破刺激效应［1］. 迄今，sMAC 对内皮细胞、淋巴细胞、肾小球细胞等多种有核细胞的刺激效应已有报道［2］，而对中枢神经系统中小胶质细胞的亚刺激效应至今报道甚少. 我们以原代小鼠小胶质细胞为靶细胞, 提取人血清补体优球蛋白,体外组装小胶质细胞sMAC 亚溶破模型，并检测其炎性反应, 初步探讨 sMAC 对小胶质细胞的亚刺激效应.1材料和方法材料SPF级近交系 Balb/c 小鼠 ( 1~2 d ) 购自第三军医大学实验动物中心. 激光共聚焦显微镜 TCS NT 购于德国Leica仪器公司. 小鼠抗人MAC新抗原单克隆抗体AE11，小鼠抗人 CD3 单克隆抗体UCHT1，CCK8试剂盒 (Dojindo日本)，NO 检测试剂盒，TNFα检测试剂盒 (BD美国 )，急性期患者血清取自西南医院检验科；正常人血清取自10人以上义务献血员.方法小鼠小胶质细胞培养体外培养小鼠小胶质细胞,免疫组化鉴定小胶质细胞纯度，95%方满足实验要求.补体优球蛋白C56 的提取及活性鉴定急性期患者血清与 4 g/L 酵母多糖，mmol/L Mg2+37℃作用1 h后离心，取血清用微量补体反应性溶血法鉴定补体C56活性，收集活性样品用mol/L PB (pH ) 透析，所得优球蛋白沉淀溶于含 100 g/L甘油的mol/L PBS (pH ) 中，即为功能纯C56制品.比色实验确定sMAC亚溶破剂量将小胶质细胞以2×108 /(L・孔)接种于96孔培养板，漂洗后，每孔中加入含1 mmol/L EDTA 无血清IMDM 养基100 μL,不同释度功能纯C56 10 μL，37℃ 孵育 15 min，再加入1∶20 NHS，37℃ 孵育1 h组装 sMAC. 每孔中加入10 μL CCK8试剂，37 ℃ 30 min，于 450 nm 波长处测定A值.鉴定sMAC小胶质细胞上的沉积将2×104 小胶质细胞接种于自制盖玻片小室，生长至80%融合，漂洗，加入亚溶破剂量C56，37℃ 15 min；再加入EDTANHS，冰上孵育60 min于细胞表面组装sMAC. 固定并封闭，加入小鼠抗人1∶10 sMAC单克隆抗体，同时设立小鼠抗人CD3 IgG 同型对照和不加一抗阴性对照，4 ℃过夜；FITC 标记的羊抗小鼠二抗，4 ℃ 1 h，漂洗后磷酸甘油封片，4 ℃避光保存，48 h 内用LSCM观察.刺激小胶质细胞后脱落细胞计数及细胞存活率细胞分为未刺激，sMAC，同浓度C56，1∶20 EDTANHS，失活sMAC共5组. 将C56与NHS于37℃提前混合孵育30 min，使sMAC 失活. 各组细胞37℃孵育 24 h，收集温育液，离心，加少量培养液重悬，以计数板计算脱落细胞数，同时以台盼蓝拒染法，计算细胞存活率.对小胶质细胞NO和TNFα合成的影响细胞分组同前，37℃孵育12 h，收集上清，离心后检测各组NO与TNFα分泌量.统计学处理：应用SPSS 软件处理，所有数据用x±s表示，组间采用t检验和方差分析，为统计学上有显着差异.2结果亚溶破模型的建立以人血清补体C56与。
星形胶质细胞和小胶质细胞培养
星形胶质细胞和小胶质细胞培养文件编码（GHTU-UITID-GGBKT-POIU-WUUI-8968）胶质细胞原代培养及纯化2.1原代胶质细胞培养培养箱中6h以上，使用1）于细胞培养前1d，用0.05%PLL(orPLO)包被培养瓶，置5%CO2前用HBSS液冲洗3次，备用；2）1d内的新生C57小鼠4只，置入75%乙醇中消毒后断头处死，75%乙醇中漂洗一次，迅速转移至预冷的HBSS（可加入双抗）中，弯镊从鼻部固定住头部，迅速剪开皮肤，换剪刀，从正中线剪开颅骨，弯镊向两边剥去颅骨，去小脑，将脑组织置于含预冷的HBSS的60mm培养皿中；3）解剖显微镜下仔细剥离皮层表面脑膜和血管后置于含预冷的HBSS的60mm小皿中，用HBSS洗3次，留少量刚好盖过组织，用眼科弯剪剪碎组织（越碎越好），加入0.25%胰酶2mL，于37℃水浴中消化7min，消化过程中摇晃离心管数次，使消化均匀；4）加入含有血清DMEM/F12完全培养基10mL(1:1)终止消化；5）使用玻璃滴管或1mL枪头吹打（可将其头部略剪一部分，以扩大口径），若一次取的动物只数多，由于液体过多，可使用5mL枪头进行吹打，但因其吹打力度较大，操作时要尽量轻且吹打次数不宜过多；6）吹打过程采用分步吹打法，每吹打15~20下，静置1~2min，吸取上清，以避免已消化出的单细胞被过多吹打，该过程重复3次；7）200目筛网过滤至50mL离心管中，去除残余的组织块；8）1000r/min×5min，弃上清；9）调整细胞数为1～2×106/mL,接种到25cm2培养瓶中,每瓶5mL；10）接种24h后换以新鲜完全培养基，以除去悬浮死亡的细胞及碎片；11）细胞每3d更换培养液，培养10～12d左右细胞基本铺满瓶壁，进行纯化分离。
分离根据胶质细胞间贴附性不同进行，将培养瓶放入恒温振荡器中，37℃180rpm振荡5h，上层疏松贴壁的为小胶质细胞；底层即是纯度较高的星形胶质细胞，收集小胶质细胞，离心重悬，接种于35mm圆皿中；星形胶质细胞用0.25%胰酶消化按1：2传代，待长满后用于实验。
小鼠原代星形胶质、神经元和小胶质细胞培养方法
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原代神经小胶质细胞培养方法的初探
原代神经小胶质细胞培养方法的初探廖婷;袁雪;荣曦;刘红【摘要】目的:建立一种简单有效的小胶质细胞原代培养和纯化方法.方法:取出生24h的SD大鼠的脑皮层组织,胰酶消化成单个细胞、培养,待细胞长满培养瓶后,用力拍打培养瓶3min,离心并收集沉淀,加入新培养基再培养,采用免疫荧光法鉴定其纯度.结果:共聚焦显微镜鉴定小胶质细胞纯度达到96.85％.结论:拍击法提纯小胶质细胞的培养方法产量多,纯度高,为小胶质细胞在神经退行性疾病相关研究提供了基础.%Objective:To establish a simple and efficient method for the separation and purification of primary microglia.Methods:The cerebral cortex tissues were collected from one-day-old neonatal SD rats,and cells were obtained through trypsin digestion.The single cell suspension was then cultured.After the cells were confluent on the bottom of the culture flask,the culture flask was vigorously tapped for 3min,then centrifuged and the precipitate was collected and cultured again.The purity was identified by immunofluorescence. Results:The purity of microglia was96.85％.Conclusion:Vigorously tapping the culture flask could achieve high yield and high purity of microglia,and it provided the foundation for the study of microglia in neurodegenerative diseases.【期刊名称】《广西医科大学学报》【年(卷),期】2019(036)004【总页数】4页(P650-653)【关键词】小胶质细胞;原代培养;纯化方法;神经退行性疾病【作者】廖婷;袁雪;荣曦;刘红【作者单位】广西医科大学第一附属医院老年内分泌科,南宁 530021;广西医科大学第一附属医院老年内分泌科,南宁 530021;广西医科大学第一附属医院老年内分泌科,南宁 530021;广西医科大学第一附属医院老年内分泌科,南宁 530021【正文语种】中文【中图分类】R741小胶质细胞在中枢神经系统的损伤及疾病转归过程中起着重要作用[1]。
小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案
小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案小鼠星形胶质细胞（astrocytes）是中枢神经系统中一种重要的胶质细胞，主要起支持和维护神经元生存、供能以及调节神经元活动等功能。
原代培养和分离纯化小鼠星形胶质细胞是研究其生物学特性和相关疾病发生机制的重要实验方法。
以下是一种常用的小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案。
实验材料和仪器：1.小鼠（新生仔小鼠）2.离心管、培养皿、显微镜3.无菌生理盐水、套管、吸头4. DMEM/F12培养基、FBS、胰蛋白酶、DNase I5.离心机、试管摇床、显微镜、离心管架6.显微针、细胞计数板、加热振荡器实验步骤：1.小鼠的准备：a.使用新生仔小鼠，从母鼠的子宫中取出。
b.将小鼠头部朝下放在无菌生理盐水中，用套管轻轻吸出小鼠颅内的脑组织。
c.将脑组织转移到含有DMEM/F12培养基的离心管中，并用离心管摇床低速振荡15-20分钟使细胞均匀分散。
2.细胞分离：a.将离心管架放在显微镜下，用显微针将脑组织均匀挫碎。
b.将脑组织转移到含有DMEM/F12培养基的培养皿中。
c. 添加0.25%胰蛋白酶和10 U/ml DNase I，37°C孵育30分钟。
d.轻轻吸入含有酶切的脑组织，并用吸头轻轻洗涤脑组织，收集上清液。
e.将上清液通过0.22μm的滤网过滤，除去大颗粒的细胞。
3.细胞培养：a. 将滤过后的细胞悬液计数，计算细胞密度并将其稀释至10^6细胞/ml。
b.取DMEM/F12培养基，添加10%FBS，将稀释后的细胞悬液转移到培养皿中。
c.在培养皿中加入5%CO2，37°C孵育。
d.每两天更换一次培养基，直到细胞至80%～90%的密度。
4.纯化小鼠星形胶质细胞：a.将培养皿中的细胞收集到离心管中，进行离心。
b.用无菌生理盐水洗涤细胞，去除不附着的细胞和残留的培养基。
c.将洗涤后的细胞用DMEM/F12培养基重新悬浮，计数并计算细胞密度。
d.用磁层细胞分选仪，通过细胞表面标记的抗体对细胞进行阳性选择，分离纯化小鼠星形胶质细胞。
LPS诱导小胶质细胞活化模型的建立及评价黄欢
LPS 诱导小胶质细胞活化模型的建立及评价黄欢1，武汪洋1，吴阳洋1，陈寒青2，尹艳艳1(1．安徽医科大学基础医学院药理学教研室，安徽合肥230032;2．合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽合肥230009)摘要：目的探讨不同浓度脂多糖（Lipopolysaccharides ，LPS ）对小胶质细胞活化作用，建立小胶质细胞活化的模型。
方法不同浓度LPS （0．01，0．1，1，10，100mg ·L －1）刺激原代纯化的小胶质细胞及BV2细胞株，采用MTT 法检测细胞活力；采用细胞免疫化学法观察细胞形态变化。
结果LPS （1mg ·L －1）可以明显激活原代小胶质细胞，但不影响细胞活力，OX-42染色显示小胶质细胞胞体变大，轴突变短变多，形似“阿米巴状”；LPS （10mg ·L －1）可以激活BV2细胞，且不降低细胞活力，镜下观察发现BV2细胞胞体明显增大。
结论采用LPS （1mg ·L －1）刺激原代小胶质细胞，LPS （10mg ·L －1）刺激BV2细胞株，可以建立稳定的小胶质细胞活化模型。
关键词：脂多糖；小胶质细胞；活化；模型Establishment and evaluation of LPS stimulation on microglia activationHUANG Huan ，WU Wang-yang ，WU Yang-yang ，et al（Dept of Pharmacology ，School of Medical Science ，Anhui Medical University ，Hefei 230032，China ）Abstract ：ObjectiveTo explore the effect of different concentrations of LPS on microglia activation ，and to establish the model of micro-glia activation．MethodsPrimary cultured microglia and BV2microglia cells were stimulated with different concentrations of LPS（0．01，0．1，1，10，100mg ·L －1）．The cytotoxicity of LPS was measured by MTT assay ，morphological changes of microglia were ob-served by immunocytochemical method．ResultsLPS （1mg ·L －1）could significantly activated primary cultured microglia but did notaffect cell viability．According to the OX-42staining pictures ，after activated by LPS ，the cell bodies relatively increased with multiple slender prominences like amebocytes．LPS （10mg ·L －1）could activate the BV2microglia ，but did not affect cell viability．Conclusion LPS （1mg ·L －1）stimulation of primary cultured microglia and LPS （10mg ·L －1）stimulation of the BV2microglia can create a stable model of microglia activation．Key words ：LPS ；microglia ；activation ；model基金项目：国家自然科学基金（No 31171650）作者简介：黄欢，女，硕士研究生通信作者：尹艳艳，女，教授，硕士生导师，研究方向：神经免疫药理学，E-mail ：yinyanyan5678@126．com陈寒青，男，副教授，硕士生导师，研究方向：功能性食品与开发，E-mail ：hangchen@yahoo．com．cn 研究表明帕金森患者脑部有T 淋巴细胞和活化的小胶质细胞的存在，证实帕金森病（Parkinson＇s Disease ，PD ）发病机制与外周炎症有关［1］。
免疫磁珠分选两步法纯化原代小胶质细胞
， ｉｉ Ｚ Ｎ ｕ，Ｘ ｕ —ｕｎ ｅｉ ｎｔｕｅ ｏ ｅｍ ｃ ｎｅ ａｉ ｌ ｄ ａ Ｕ ｉ ｒｔ， ｅｉｇ ｕＬ— ， Ｅ Ｇ Ｈ ｉ Ｕ Ｑ ｎｙ ａ ．Ｂ ｉ ｇＩｓ ｔ ｒＮ ｕ ｓｉ ｃ ，Ｃ ｐ ａ Ｍｅｉ ｌ ｎｖ ｓｙ Ｂ ｒｎ ｌ ｊ ｎ ｉ ｔｆ ｅ ｔ ｃ ｅｉ Ｃｎｅ ｏ ｅｒｌ ｅｅｅ ｔ ｎａ ｄＲｐ ｉｎ ， ｅ ａｏａｏ ｆｒ ｅｒｄｇｎｒｔｅ ｉ ａｅ ｏ ｔｅ ｎｓｙｏ ｅｔ ｒｆＮ ｕａ Ｒｇｎｒ ｉ ｎ ｅａｒ ｇ Ｋ ｙＬ ｂｒｔｒ ｏ Ｎ ｕｏｅｅｅａｉ ｓ ｓ ｈ ｉｒ ｆ ａｏ ｉ ｙ ｖＤ ｅ ｓ ｆ Ｍｉ ｔ
【 ｅ ｏｄ 】 Ｍｉ ｏｌ ； ｇｅ ｃａｔ ａｅ ｅ ｏ ｉｇ Ｋ ｙｗ ｒ ｓ ｃ ｇ ａ Ｍａｎｔ ｃｖｔ ｃｌ ｓｒｎ ｒ ｉ ｉ ｉ ｄ ｌ ｔ
小 胶 质 细胞 是 中枢 神 经 系统 中 的 免疫 效 应 细 ａｔ ａｅ ｅ ｏｔ ｇ ＭＡ Ｓ 两 步 法 ， 得 较 高 纯 度 ｃ ｖｔ ｃｌ ｓｒｎ ， Ｃ ） ｉ ｄ ｌ ｉ 获 胞 。虽 然 仅 占 全 脑 神 经 胶 质 细 胞 总 数 的 ５ ～ ％ 并 能够尽 可 能反映其 在体情 况 的原代 小胶 质细胞 。 ２ ０％ ＿ 但 是 ， 胶质 细胞参 与 中枢神 经 系统 的众 多 １ 小 材料 与方法 生 理活 动 ， 与许 多疾病 的发生 发展 密切 相关 【 ， 并 ２ 特 ］
孙珊 珊 王蓓蓓 鞠 莉 莉 曾辉 徐群渊
【 要】 目的 神经 系统感染研究需获得纯度高 、 摘 细胞生物学状态 接近体 内的小胶质细胞 。既 往分离纯化方法不能满足研究需要 ， 需建立新的高效纯化方法。方 法 获得小 鼠全脑单细胞 悬液后 ，
应用磁珠分选 阳选 法 ， 过两 步分 选获 得小 胶 质细胞 。用 流式 细胞仪 检 测小 胶质 细胞 的纯度 ， 经 瑞 氏． 姬姆萨染色观察细胞形态 ， 采用 ７Ａ Ｄ染色鉴定分选后细胞的活性 。结果 －Ａ １ ３ ） 。该方法所获得的小胶质 细胞 活性良好 ， ．５ ％ 形态正常。结论
三种原代小胶质细胞纯化培养方法的对比及分析
维普资讯
ｎ Ｘ ２ａ ｔｏ ｉ ａｄＯ ４ ｎｉ ｄｅ．Ｒｅｕｔ ｉ ｐ ｒｉｃｔｎｑａ ｔ ａｄｑａ ｔｙｏ ｒｇ ａ ｅ ｓ ｅｅａｑ ｉ ｄｉ ａ ｅ ｒ ｐ ， ｂ ｓ ｓｌ Ｈ 曲 ｕｉｆ ａｏ ｕｌｙｎ ｕ ｉ ｍｉ ｌ ｌ ｒ ｃ ｕ ｅ ｌｔ ｒ ｇ ｕ ｓ ｓ ｔ ｉ ｉ ｉ ｎ ｔｆ ｏ ｉｃ ｗ ｒ ｎ ｌｈ ｅ ｏ
小胶质原代细胞培养过程中， 利多卡因分离纯化法及低浓度胰酶消化法均可有效提高培养产量及纯度， 以利多卡
因分原代培养 ； ； 纯化 鉴定 ［ 中图分类号］ Ｒ ３ ３８ ［ 文献标识码 ］ Ａ ［ 文章编 号］ １０ － ６ （０８ １－ ０ － ０２ ６ Ｘ ２０ ）７０ ４０ ２ ０ ３
ｌｔ ｎ ｄ ｎ ｉ ａｉ ｅ ｓ ｙ，ｄ ｃｅ ｃ ｅ ｔ ｆ ｇ ｌｆ ｔａｉｎ ｆ ｑ ｅ ｃ ｄ ｎ ｔ ｔ ｎ ｄ ｐ ｖ ｔ ｎ ｗ ｒ ｐ ｌ ｄ Ｉ ｈ ａｅ ｕ ｆ ａｉｎ ｏ ｔ ｅ ｒ ａ ｅ ｏ ｃ ｎ ｒ ｕ ａ ｌ ｔ ｒ ｕ ｎ ｙ ａ ｕ ｒ ｉ ｅ ｒ ａ ｉ ｅ ｅ ａ ｐ ｉ ． ｎ ｔ ｅ ｌｔ ｒ ｐ ｒ ｃ ｔ ｆ ｉ ｉｒ ｏ ｅ ｎ ｉ ｏ ｉ ｏ ｅ ｉ ｉ ｏ
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小鼠小胶质细胞原代培养方法！
6、0.4%台盼蓝溶液的配制 台盼蓝 4 g PBS 少许（研磨） PBS 定容至 100ml，滤纸过滤，室温保存。
7、4%多聚甲醛的配制： 多聚甲醛 4 g PBS 溶液 100ml 加热至 60，边滴加 1mol/L NaOH 边搅拌，至液体澄清。
2、小鼠小胶质细胞的混合培养
（1） 75%（体积分数）酒精消毒新生 24h 内的清洁级小鼠，在无菌条件下断头，剪开头皮及颅骨，取出脑组织，置于盛冷的pH7.2,无 钙、镁的D-Hank's液的平皿中（下置冰袋）。
（2） 无菌剥离脑组织，除去小脑、海马、大脑髓质,分离大脑皮层，仔细剥离脑膜及血管。 （3）用虹膜剪将组织剪切成 1mm3左右的组织块，0.125%胰蛋白酶消化，37作用 20min，期间振摇 2～3 次。 （4）弃去上清液，加入完全接种液终止消化，漂洗两次。巴斯德吸管轻轻吹打至肉眼观察无明显的脑组织团块，静置 2min。 （5）悬液收集于新的离心管，离心（1000r/min，10 min，4），弃去上清液。加入完全培养液重悬，200 目不锈钢网过滤。根据实验需要 接种于若干个25cm细胞培养瓶或培养皿中。 （6）置 37、5%CO2培养箱培养24h后更换一次培养基，以后每3d换一次液，并在镜下观察细胞的生长和存活情况。
（3）离心管配平,1000r/min, 离心5min, 弃上清；加定量完全培养再次吹打成细胞悬液,接种于预先包被的置有盖玻片的24孔培养板,置于 CO2恒温细胞培养箱(37度)培养。
生长24h后吸掉培养液,以去除未贴壁的少突胶质细胞,加完全培养液继续培养。
原代小胶质细胞提取
原代小胶质细胞提取一、背景介绍小胶质细胞是中枢神经系统的重要成分，其主要功能是支持和调节神经元的活动。
在疾病的发生和发展过程中，小胶质细胞也扮演着重要的角色。
因此，对小胶质细胞的研究具有重要意义。
二、提取方法1. 原代培养法原代培养法是目前最常用的小胶质细胞提取方法之一。
具体步骤如下：（1）将新鲜脑组织切成小块并去除血管、脑膜等组织。
（2）将组织块置于含有消化酶（如0.25% 胰蛋白酶）和DNA 酶的消化液中，在37℃下消化4~5次。
（3）将消化后的混合物通过筛网过滤，得到单个小胶质细胞。
（4）将单个小胶质细胞接种到含有营养物质的培养基中进行培养。
2. 富集法富集法是另一种常用的小胶质细胞提取方法。
具体步骤如下：（1）将新鲜脑组织切成小块并去除血管、脑膜等组织。
（2）将组织块置于含有分离液（如70% 葡萄糖、0.9% NaCl 等）的离心管中，在低速离心下沉淀。
（3）将上清液转移至新的离心管中，在高速离心下沉淀小胶质细胞。
（4）将沉淀的小胶质细胞接种到含有营养物质的培养基中进行培养。
三、注意事项1. 提取过程要在无菌条件下进行，避免污染。
2. 提取前应先对动物进行麻醉和处死处理，避免动物痛苦。
3. 消化酶和DNA 酶的浓度应根据实验需要进行调整，以保证消化效果。
4. 培养基的配方应根据实验需要进行调整，以保证小胶质细胞正常生长和发育。
四、总结小胶质细胞是中枢神经系统的重要成分，对其研究具有重要意义。
原代培养法和富集法是目前最常用的小胶质细胞提取方法，提取过程要在无菌条件下进行，避免污染。
消化酶和DNA 酶的浓度应根据实验需要进行调整，以保证消化效果。
培养基的配方应根据实验需要进行调整，以保证小胶质细胞正常生长和发育。
小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案
小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案小鼠星形胶质细胞是中枢神经系统中的一类胶质细胞，具有重要的生理功能。
进行小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验是研究其功能和机制的关键步骤之一、下面是一份关于小鼠星形胶质细胞的原代培养及分离纯化实验方案。
实验步骤：1.小鼠主星形胶质细胞原代培养（1）准备培养基：将DMEM/F12培养基配制好，添加10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素（P/S）和20ng/mL生长因子（如EGF和bFGF），混匀即可。
将培养基过滤灭菌。
（2）小鼠灭菌和解剖：选取3-5天龄的小鼠，进行表面消毒处理，解剖小鼠颅脑组织。
（3）组织分离：将解剖得到的小鼠颅脑组织放入培养皿中，使用去髓针将组织剪碎，加入2mL预先配制好的DMEM/F12培养基。
（4）消化组织：使用0.25%胰酶溶液和0.05%胆汁酸溶液进行组织消化，将组织置于37°C的恒温槽中，用胶性吸管轻轻吹泡，约30分钟后停止消化。
（5）细胞分离：用离心机将细胞分离，将上清液收集到新的离心管中，用DMEM/F12培养基进行稀释后离心。
（6）细胞计数：用显微镜观察细胞形态，进行细胞计数。
（7）细胞培养：将细胞悬浮液转移到预先涂有胶原的培养皿中，加入预先配制好的培养基，放入培养箱中，37°C、5%CO2培养。
2.小鼠星形胶质细胞分离纯化（1）胶质细胞去除：在培养2-3周后，使用轻轻摇晃的方法将胶质细胞除去，以保留星形胶质细胞。
（2）非星形胶质细胞去除：使用超声波分离方法对星形胶质细胞进行提纯，将细胞悬浮液转移到离心管中，使用超声波技术使星形胶质细胞聚集起来，再次离心。
（3）细胞计数和分装：用显微镜观察细胞形态，进行细胞计数并分装到新的培养皿中。
（4）鉴定纯化程度：使用免疫细胞化学方法，如免疫荧光染色，检测特定星形胶质细胞标志物的表达水平，以确定纯化程度。
（5）细胞培养：将纯化后的星形胶质细胞继续培养，并进一步进行功能和机制的研究。
胶质细胞实验报告
一、实验目的本实验旨在观察胶质细胞的形态、分布及其在神经系统中的作用。
通过实验，了解胶质细胞的基本特征，探讨其在神经保护和修复中的作用。
二、实验原理胶质细胞是神经系统的重要组成部分，主要包括星形胶质细胞、少突胶质细胞和室管膜细胞等。
它们在神经元周围形成支持和保护作用，参与神经递质的代谢、免疫调节、神经元修复和再生等过程。
三、实验材料1. 实验动物：成年大鼠2. 实验试剂：Hoechst33342染色液、DAPI染色液、神经丝蛋白抗体、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体、兔抗鼠二抗、FITC标记抗体、DAB显色剂、甲醇、磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）等。
3. 实验仪器：光学显微镜、荧光显微镜、生物显微镜、细胞培养箱、移液器、载玻片、盖玻片、培养皿等。
四、实验方法1. 细胞培养：取成年大鼠脑组织，剪碎后加入胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液。
将细胞悬液接种于培养皿中，置于细胞培养箱中培养。
2. Hoechst33342染色：将培养的胶质细胞用Hoechst33342染色液染色，在荧光显微镜下观察细胞核形态。
3. DAPI染色：将培养的胶质细胞用DAPI染色液染色，在荧光显微镜下观察细胞核形态。
4. 免疫荧光染色：将培养的胶质细胞用神经丝蛋白抗体和GFAP抗体进行免疫荧光染色，观察胶质细胞的形态和分布。
5. DAB显色：将培养的胶质细胞用DAB显色剂进行显色，观察胶质细胞的分布和数量。
五、实验结果1. Hoechst33342染色结果显示，胶质细胞呈多边形，细胞核呈圆形或椭圆形，染色质分布均匀。
2. DAPI染色结果显示，胶质细胞呈多边形，细胞核呈圆形或椭圆形，染色质分布均匀。
3. 免疫荧光染色结果显示，胶质细胞呈多边形，细胞核呈圆形或椭圆形，细胞质中有明显的神经丝蛋白和GFAP表达。
4. DAB显色结果显示，胶质细胞呈多边形，细胞核呈圆形或椭圆形，细胞质中有明显的神经丝蛋白和GFAP表达。
六、实验讨论1. Hoechst33342和DAPI染色结果显示，胶质细胞呈多边形，细胞核呈圆形或椭圆形，染色质分布均匀，说明胶质细胞具有典型的细胞核形态。
大鼠皮层小胶质细胞氧糖剥夺模型的制备
24中外医疗 CH IN A F OR EI G N ME DI C AL T R EA TM EN T基 础 医 学短暂的轻度缺血即可导致中枢神经系统损伤,小胶质细胞是中枢神经系统内免疫感受和效应细胞[1],对保护脑组织有重要作用。
本实验采用体外氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation,OGD)模型来模拟脑损伤过程,为研究缺血过程中小胶质细胞的脑保护作用提供了可靠、实用的方法。
1 材料与方法1.1 实验动物出生1～2d Wistar大鼠。
购自吉林大学中心实验室。
1.2 实验方法1.2.1 大鼠皮层小胶质细胞原代培养和鉴定 采用酶消化法结合机械分离法进行培养[2]。
应用倒置显微镜观察不同时期细胞形态及生长情况。
在培养第8天用OX42免疫细胞化学染色进行鉴定。
1.2.2 制备小胶质细胞O G D 模型及评价 (1)缺氧D -Hank’s液的制备及缺氧罐的制作。
方法同前期研究[3]。
(2)小胶质细胞O G D 模型的建立及L D H 漏出率测定。
用缺氧D -H a n k ’s 液洗涤并孵育培养至第8天的小胶质细胞,在缺氧罐中37℃培养;取缺氧时间为30、60、120、180m i n 再复氧24h 的细胞检测L D H 漏出率,方法按说明书进行。
1.3 统计学分析结果以(x -±s )表示,采用方差分析,SPSS 15.0软件。
2 结果2.1 小胶质细胞原代培养及鉴定小胶质细胞在培养第8天分化成熟,OX42阳性细胞百分比为(97.33±2.15)%。
2.2 小胶质细胞OGD模型制备及评价血气分析仪测量缺氧D-Hank’s液氧浓度＜1%,抽成真空及通入缺氧气体后缺氧罐内氧含量为(1±0.1)%,二氧化碳浓度为(5±0.1)%。
小胶质细胞L D H 漏出率随缺氧时间延长逐渐增加,OGD60min之后与30min比较LDH漏出率有统计学差异,见表1。
小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案
小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案经过相关文献阅读，参考了众多对于小胶质细胞培养方案,对比了不同方案的利弊优缺，整合了相对符合本实验室条件和实验要求的方法，如有其他变更方案,以修改后为准。
1. 实验材料与试剂剪刀、小镊子、小毛刷、DMEM/F12培养液、胎牛血清、马血清、0。
25％，0.05％胰蛋白酶、PBS液、青霉素、链霉素、培养皿离心管、50 mL 细胞培养瓶、CO恒2温细胞培养箱、倒置相差显微镜、细胞板、荧光标记二抗、0。
4％ Trypan Blue 染色液、抗小鼠OX42单克隆抗体和新生SD小鼠等试剂配比：(1) DMEM 10:10：1DMEM, 10％FBS, 10％Horse Serum，1% Penicillin/Streptomycin （P/S) (2) DMEM 5：5:1DMEM，5% FBS, 5% of Horse Serum, 1％P/S (3) SERUM FREE MEDIUM + GROWTH FACTORS（DMEM/F12无血清培养基+生长因子)25μg/ml转铁蛋白，10nM生物素，30 nM亚硒酸钠，1μg/ml putrescine（腐胺），5μg/m l胰岛素，20 nM hydrocortisone（氢化可的松）,20 nMprogesterone（孕激素），1％P / S+生长因子(5ng/ ml的血小板衍生生长因子PDGF—AA和5ng / ml碱性成纤维细胞生长因子bFGF)胰蛋白酶/ EDTA溶液0。
05％胰蛋白酶+0.02％EDTA在W / O内Ca2+ / Mg2 +的HBSSDMEM/F12 containing 25 μg/ml transferrin，10 nM biotin，30 nM sodium selenite，1 μg/ml putrescine, 5 μg/ml insulin, 20 nM hydrocortisone, 20 nM progesterone，1％P/S + Growth Factors （5 ng/ml PDGF—AA and 5 ng/ml bFGF） Trypsin/EDTA solution 0.05% Trypsin + 0，02％EDTA in HBSS w/o Ca2+/Mg2+Laminar flow hood Dissecting magnifying glass Water bath at37ºC Humidified tissue culture incubator (37ºC， 5% CO2） Sterilized microdissecting instruments: large dissecting scissors， mouse-teeth forceps, curved forceps and fine Dumont forceps Orbital Shaker （Boeco OS20) Tabletop centrifuge 50 ml plastic conical tubes (Sarstedt，62.547。
大鼠脊髓小胶质细胞体外纯化培养方法的建立
大鼠脊髓小胶质细胞体外纯化培养方法的建立陈雪;张婷;李彩红;王伟;骆翔;喻志源【摘要】Objective: To establish a simple and highly efficient primary culture method for microglia from rat spinal cord. Methods: Mixed glial cells were obtained from the spinal cord of newborn SD rats. On day 3, the culture medium was changed until the cultured microgila became fused on day 10. The microglia were purified using shocking methods (37 ℃, 180 rpm, 1~2 h) with different adhesion time (20~40 min). The isolated and purified microglia were identified with Iba1 and CD11b after 24 h. Results: The rat spinal cord microglia were successfully isolated and purified. The cultured microglia presented round or fusiform, highly refractive morpholo-gy. Iba1 and CD11b fluorescence tests showed that the purity of microglia was more than 95%. Conclusion:Using nutrition deprivation, Shock and different adhesion time methods, a primary spinal cord microglia culture method with high yield and purity was established, providing a useful tool for studying rat spinal cord microglia in vitro.%目的：建立一种简易高效的大鼠脊髓小胶质细胞原代培养方法。
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2．1小胶质细胞的原代细胞培养
2．1．1混合胶质细胞培养自中山大学北校区动物中心购买刚出生1天内的SD乳鼠，用75％酒精消毒后固定四肢，剪开皮肤、颅骨，取出脑组织放入PBS液中洗涤一次，分离脑干取出，脑膜及血管尽量剥离，将组织放入盛有DMEM／F12无血清培养基的培养皿中，移至离心管中剪碎，加入浓度为0．125％的胰蛋白酶，37。
C水浴箱中消化15分钟，血清终止消化，待组织沉淀后收集上液，余下组织可通过反复吹打进行再次消化，经过709m细胞滤网过滤，收集滤液，1500r ／min离心5分钟，去上清，加入完全培养基悬浮细胞后进行细胞计数，以1*106接种至预先用多聚．L．赖氨酸铺被的75cm2培养瓶中。
24d'时后稍微轻摇下未贴壁及贴壁不稳的细胞碎片，全量更换培养基，随后4天／次换液，约至10天左右可见明显的细胞分层，上层为半贴壁，呈圆形，透光性较好，主要为小胶质细胞及少量的少突胶质细胞，下层细胞主要为星形胶质细胞、神经元。
第一章原代小胶质细胞的培养、纯化及鉴定
2．1．2小胶质细胞分离及纯化：机械振摇法：将铺满胶质细胞／神经元的培养瓶置于摇床振摇，180r／min，15rain，将培养基吸出，并用PBS冲洗1遍，收集脱落的细胞，1500r／s 5min离心，去除上清液，加入完全培养基，吹打混匀，计数，(34+39+30+33)／4×104／ml，以3×105／孔的浓度将细胞种入6#L板(已放置盖玻片)，37。
C 5％C02温箱培养15．30分钟，更换培养基，即去除延迟贴壁的少突胶质细胞，贴壁细胞即为纯化的小胶质细胞。
分离后的底层混
合细胞继续加入15％FBSDMEM／F12培养基，4．5天后可以再次收获小胶质细胞。
2．1．3免疫荧光鉴定步骤
1)小胶质细胞接种第2—3天后，待细胞在盖玻片上伸出伪足时，自培养箱中取出。
2)用预温的PBS洗3次，每次5分钟
3)4％多聚甲醛室温固定20分钟左右
4)PBS洗3次，每次5分钟
5) 5％BSA室温封闭30分钟
6)加抗Iba抗体(用1％BSA稀释)放在湿盒里，4V过夜
7)PBS洗3次，每次5分钟
8)DIIFITC．山羊抗小鼠IgG(用1％BSA稀释)避光孵育1小时
9)PBS洗3次，每次5分钟
10)DIIDAPI(用1％BSA稀释)避光孵育5分钟
11)1xPBS洗3次，每次5分钟
12)95％甘油封片。