小胶质细胞培养及鉴定

2．1小胶质细胞的原代细胞培养

2．1．1混合胶质细胞培养自中山大学北校区动物中心购买刚出生1天内的SD乳鼠，用75％酒精消毒后固定四肢，剪开皮肤、颅骨，取出脑组织放入PBS液中洗涤一次，分离脑干取出，脑膜及血管尽量剥离，将组织放入盛有DMEM／F12无血清培养基的培养皿中，移至离心管中剪碎，加入浓度为0．125％的胰蛋白酶，37。C水浴箱中消化15分钟，血清终止消化，待组织沉淀后收集上液，余下组织可通过反复吹打进行再次消化，经过709m细胞滤网过滤，收集滤液，1500r ／min离心5分钟，去上清，加入完全培养基悬浮细胞后进行细胞计数，以1*106接种至预先用多聚．L．赖氨酸铺被的75cm2培养瓶中。24d'时后稍微轻摇下未贴壁及贴壁不稳的细胞碎片，全量更换培养基，随后4天／次换液，约至10天左右可见明显的细胞分层，上层为半贴壁，呈圆形，透光性较好，主要为小胶质细胞及少量的少突胶质细胞，下层细胞主要为星形胶质细胞、神经元。

第一章原代小胶质细胞的培养、纯化及鉴定

2．1．2小胶质细胞分离及纯化：机械振摇法：将铺满胶质细胞／神经元的培养瓶置于摇床振摇，180r／min，15rain，将培养基吸出，并用PBS冲洗1遍，收集脱落的细胞，1500r／s 5min离心，去除上清液，加入完全培养基，吹打混匀，计数，(34+39+30+33)／4×104／ml，以3×105／孔的浓度将细胞种入6#L板(已放置盖玻片)，37。C 5％C02温箱培养15．30分钟，更换培养基，即去除延迟贴壁的少突胶质细胞，贴壁细胞即为纯化的小胶质细胞。分离后的底层混

合细胞继续加入15％FBSDMEM／F12培养基，4．5天后可以再次收获小胶质细胞。

2．1．3免疫荧光鉴定步骤

1)小胶质细胞接种第2—3天后，待细胞在盖玻片上伸出伪足时，自培养箱中取出。

2)用预温的PBS洗3次，每次5分钟

3)4％多聚甲醛室温固定20分钟左右

4)PBS洗3次，每次5分钟

5) 5％BSA室温封闭30分钟

6)加抗Iba抗体(用1％BSA稀释)放在湿盒里，4V过夜

7)PBS洗3次，每次5分钟

8)DIIFITC．山羊抗小鼠IgG(用1％BSA稀释)避光孵育1小时

9)PBS洗3次，每次5分钟

10)DIIDAPI(用1％BSA稀释)避光孵育5分钟

11)1xPBS洗3次，每次5分钟

12)95％甘油封片