多拷贝重组HBsAg质粒的构建及在毕赤酵母中的高效表达

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毕赤酵母表达知识归纳

毕赤酵母表达知识归纳1a.配制500×BIOTIN stock solution（0.02％）有这么3种方案：1、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶；2、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；3、水浴加热，温度不能高于50度。

D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。

在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。

天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。

b.有几个比较迷惑的问题请教大家：(很典型的小问题）1、制感受态细胞，OD多少比较好？pyrimidine 战友的方法：取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP管中。

说明书还有一些文献是说在1.3左右效率高，再高了效率会很低2、关于高效转化法，文献说用(LiAc)，而invitrogen的说明书说转化毕赤酵母用(LiAc)没用，要用LiCl。

Lithium acetate does not work with Pichia pastoris. Use only lithium chloride.3、YNB到底能高温灭么？有的说能有的说不能。

过滤灭菌的怎么操作？我是把滤器装好膜绑到瓶口用纱布盖上，报纸包上，瓶盖放烧杯里单灭。

然后把配好的溶液用注射器一点点推进去。

4、葡萄糖为什么在YPD里一起灭颜色很深，单灭则不会。

该115度还是121度灭？网上搜了下，都有人用！5、电转化参数用400欧还是200欧？有的用400，有的还专门说不是用400。

都是从园里看到的！电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆（不是400）6、电转后，在MD平板上长的应该就是整合了目的基因的重组子了吧？如果不想筛高拷贝的，是否PCR验证一下即可？网友的回答：ynb最好不灭菌，我是0.22um过滤处理的。

invitrogen手册上可以灭菌的。

多拷贝水蛭素基因在毕赤酵母中的分泌型表达

凝血酶
ＣｏｓｒｃｉｎＯｌ—ＣｏｙＳｅｒｔｒｐｅｓｏｃｏｎｒｄｎｎｔｕｔｆＭｕｔｏａｉｐｃｅｏｙＥｘｒｓｉｎＶｅｔｒｄＨｉｉａｕ
ＥｐｅｓｏｃｉａｔｒｘｒｓｉｎｉＰｉｈａＰｓｏｉｎｓ
Ｔｅ — ａｏ－ｈｒｄｎｇｎａｍｐｉｅｏｐＩ９ｉｄｎｂＣｎｕ — ｌｎｄｉｔＡＯ８５Ｔｅｍｕｔｃｐｃｍ— ｈｆｃｒｉｉｅｅｗｓａ／ｄｆｍＰＣ－ｂｒｉｙＰＲａｄｓｂｃｏｅｏＰｕｉｆｒｕｎ．ｈｌ — ｏｙｒｏ１ｉｅ
ｌ２ｌ
ＴａｊｄＪｅ００ｏ３ｏ２ｉｉＭｅ，Ｆｂ２１，Ｖｌ８Ｎｎｎ
多拷贝水蛭素基因在毕赤酵母中的分泌型表达
马精彩
摘要
曹晓娜Байду номын сангаас
熊蔚俐
李敬华
左爱军
孙
蓓
梁东春
目的：通过多拷贝克隆技术实现水蛭素（ｉｄｎ基因在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达。Ｈｒｉ）ｕ方法：利用基
Ｈｒｄｎｗｓｕｃｓｕｌｃｎｔｃｅｎａａａｌｏｃｔｇｅｏｂｎｎｉｄｎｅｃｎｌ，ｈｃａｃｎｒｅ — ｉｉ）ａｓｃｅｓｌｏｓｔａｄｗｓｐｂｅｆｅｒｉｃｍｉｔｒｉｉｔｗｉｈｓｏｆｍｄｒｕｆｙｕｒｄｃｓｅｎｒａｈｕｉｆｅｙｗｉｅ
因重组技术，ｐＩ９Ｈｒｄｎ中扩增 —ａｏ— ｒｄｎ插入到载体ｐＯ１从ＰＣ一ｉｉｕｆｃｒＨｉｉｕＡ８５中，并构建ｐＯ１一仅Ｈｒｄ）多拷贝Ａ８５（一ｉｉｕｎ

重组山羊FSH基因在毕赤酵母中的高效表达

ａＩＸｏ、Ｘａ，ｃＲ、Ｎｔ、Ｓｃ，ｈｌｂＩ
广泛应用。利用基因工程可获得纯度较高的且不高保真聚合酶ＰｒｂＳＴＤＡｏｙｅａｅｙｏｅｔＭＮＰ１ｍｒｓ，
ＤＡｉａｉｎｉＶｒ．，ＭｎＢＳＰａｍｄＮＬｇｔｏＫｔｅ２０ｉｉＥＴｌｓｉＰｒｆｃｔｏｉＶｔ２０Ｄ２００Ｄ１０，ｕｉｉａｉｎＫｔｅ．，Ｌ０，Ｌ５００
ＡａｏｅＧｌＮｕｉｉａｉｎｉＶｔ．购ｇｒｓｅＤＡＰｒｆｃｔｏＫｔｅ２０
ａａａＮ片段快速纯化回收试剂盒ＹＢＮ巴斯德毕赤酵母表达系统是被广泛应用的真白ＴＫＲ公司。ＤＡ核表达系统，具有较强的乙醇氧化酶启动子，可有购自北京博大泰克生物基因技术有限公司，一抗
．４表达产物的Ｓ — ＡＡ２ＤＳＰＧ分析￣Ｗｅｅｎｂｏｓｒ－ｌｔｔ１．．引物合成根据毕赤酵母载体ｐＩｇ【１．．１２１ＰＣＡｏ多克隆位点处酶切位点的特点以及ＦＨ，ＳＤ基因检测
放射免疫法测定表达上清，表达量为２．５ｍｌｍ，显著高于本实验室在细胞中的表达。０５Ｕ／Ｌ１
关键词：山羊；ＦＨ因；毕赤酵母表达载体；表达Ｓ基
中图分类号：￥２．８６３文献标识码：Ａ文章编号：１０ — ７９（０５０１— ４０５２３２１）０ — ０２０１

毕赤酵母表达经验总结

毕赤酵母表达经验总结甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。

虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。

不少人在操作中会遇到这样那样的问题，生物通编者特地收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。

其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。

甲基酵母部分优点与其他真核表达系统比较与原核表达系统比较1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达优点-+2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，可以达到每升数克表达产物的水平++++3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系统简单，非常适合大规模工业化生产。

+++=4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化。

=+5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源，生产成本低+++++ 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多EasySelect Pichia Expression System产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题全面产品报告及心得体会：巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。

毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以增加表达，并且在表达后α-factor 可以自动被切除。

植物GSTZ基因在毕赤酵母中的高效分泌表达

麦胚芽无细胞及酿酒酵母系统中的表达特性．由于大肠杆菌表达系统缺少糖基化修饰过程，麦胚芽无细小
胞蛋白合成系统的实验成本高、表达量低，酿酒酵母表达系统属于非整合非分泌型表达系统，因此不合适或难以大规模地表达ＧＳ．赤酵母系统为整合分泌型表达系统，达高效且稳定，ＴＺ毕表且具糖基化修饰特性而使目的蛋白免受蛋白酶攻击的特点，是近年来极具潜力的真核表达系统．文以毕赤酵母为表达系本
Ｖｏ１４１Ｎ＿．Ｏ１Ｆｅ２０ｂ．０８
文章编号：０６ — ９２２０）１０３ — ５４５７４（０８０ — ０９０
植物ＧＴＳＺ基因在毕赤酵母中的高效分泌表达
王维兰，梅，李陈喜文，黄晓燕，贾向陈德富东，
ＧＳＴＺ具有顺丁烯二酰乙酰乙酸异构酶（ＭＡＡＩＥＣ５２１活性，，．．．．）ＭＡＡＩ生物体内的苯丙氨酸、是酪氨酸代谢的关键酶，化顺丁烯二酰乙酰乙酸盐异构为延胡索酰乙酰乙酸盐］ＧＴ催．ＳＺ对自来水氯处理过程中产生的对啮齿动物具有致癌毒性的二氯乙酸（ｃ及其类似卤代物有较强的脱卤活性，ＤＡ）在水净化方面具有很高的应用价值．］在克隆拟南芥和甘蓝型油菜 “ ２ ” “ Ｃ ” Ｓ陕Ｂ和垦１ＧＴＺ基因的基础上，前文分析了其在大肠杆菌、小
统，分析了３种植物ＧＴＺ基因表达特性，Ｓ以期为大规模高效表达ＧＳＺ研究奠定基础．Ｔ

重组人表皮生长因子在毕赤酵母X33中的构建、表达和纯化

重组人表皮生长因子在毕赤酵母X33中的构建、表达和纯化高云鹏;赵雨;王新宇;白雪媛;王佳雯【摘要】在毕赤酵母X33中表达人表皮生长因子并纯化,对表皮生长因子(EGF)进行密码子优化,构建pPICZa A-EGF真核表达质粒,转化X33感受态细胞;利用抗性筛选以及PCR鉴定阳性菌株.经过甲醇诱导和镍柱纯化,聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白分泌表达情况.成功构建了表达pPICZa A-EGF真核表达质粒,转入X33中获得阳性菌株,成功诱导蛋白分泌表达并纯化.在毕赤酵母X33中成功表达人表皮生长因子,纯化后纯度为80％,收率为5.8 mg/L.【期刊名称】《科学技术与工程》【年(卷),期】2018(018)017【总页数】4页(P141-144)【关键词】表皮生长因子;毕赤酵母;蛋白表达;纯化【作者】高云鹏;赵雨;王新宇;白雪媛;王佳雯【作者单位】长春中医药大学中医药与生物工程研究开发中心,长春130117;长春中医药大学中医药与生物工程研究开发中心,长春130117;长春中医药大学中医药与生物工程研究开发中心,长春130117;长春中医药大学中医药与生物工程研究开发中心,长春130117;长春中医药大学中医药与生物工程研究开发中心,长春130117【正文语种】中文【中图分类】Q786表皮生长因子(EGF)首次从成熟小鼠的颌下腺中分离出来[1]。

而人的肾脏、十二指肠、胰腺、肝脏以及乳腺中都发现了人表皮生长因子(hEGF)存在[2, 3]。

hEGF是包含有53个氨基酸残基，具有三个二硫键的6.2 kDa大小的多肽。

EGF能够与表皮生长因子受体(EGFR)结合并使其激活，活化后的EGFR由单体转化为二聚体并发生自磷酸化，进一步激活下游包括MAPK/Akt和JNK在内的一系列通路，诱导细胞增殖[4]。

hEGF刺激皮肤、角膜、肺、器官以及胃肠道表皮细胞的增殖和分化。

hEGF同时能够促进角质细胞的生长和迁移，提高成纤维细胞和胚胎细胞的增殖[4,5]。

毕赤酵母实验操作手册

毕赤酵母表达实验手册大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。

然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。

大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。

另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。

包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。

与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。

因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。

大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。

但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。

近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、繁殖快、易于工业化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵体变性、复性等等间题［ 1］。

与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，人们对酿酒酵母（ Saccharomyces.Cerevisiae ）分子遗传学方面的认识最早，酿酒酵母也最先作为外源基因表达的酵母宿主． 1981 年酿酒酵母表达了第一个外源基因一干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达。

毕赤酵母蛋白表达系统研究进展

1 P． pastoris 表达系统的特点
P． pastoris 是甲醇营养型酵母中的一种，可以在含有甲醇的培养基上快速生长。与其他蛋白表达系
收稿日期： 2010-11-02 基金项目：福建省科技厅资助项目（ 2009N0032），福建省教育厅资助项目（ JA08041）作者简介：杨梅，女，博士，教授，研究方向：生物化学与分子生物学； E-mail： myang@ fjnu． edu． cn
3 外源蛋白的表达及其影响因素
目前，毕赤酵母蛋白表达系统在国内外应用都很广泛，已成功表达许多外源蛋白。但由于毕赤酵母本身仅分泌少量蛋白，因此外源蛋白占培养基中总蛋白的绝大多数。有些外源蛋白的表达量可达到 g / L 以上水平，如 Hao 等［27］成功表达的重组人复合 α-干扰素（ cIFN）的表达量达到 1． 24 g / L； Huang 等［28］表达的截短的 1，3-1，4-β-D-葡聚糖酶的表达量为 3 g /L。虽然许多外源蛋白都可以在毕赤酵母中高效表达，但仍然有些蛋白表达量相对较低或不表达，在同一表达系统中表达不同的外源蛋白，其表达量千差万别，外源蛋白的表达受多方面因素的影响。 3． 1 外源基因自身的内在特性
母属（ Candida）和汉逊酵母属（ Hansenula）等。毕赤酵母（ P． pastoris）作为甲醇酵母的一种，是单细胞低等真核生物，已发展成为广泛应用的表达宿主。与其他表达系统相比，毕赤酵母具有不可比拟的优势，其既有原核生物繁殖快、易于培养、培养基廉价和试验过程简单可行等特点，又具有强有力的启动子，还可以对外源蛋白进行加工折叠和翻译后修饰，具备了典型的真核生物表达体系的特点。毕赤酵母表达系统已发展成为一个较为理想的蛋白表达系统，被国内外广泛应用于生产外源蛋白。目前，已有 500 多种外源蛋白在该表达系统中获得表达［4］。

毕赤酵母表达操作手册(精译版)

毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。

不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。

它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。

同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。

这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。

与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。

例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。

毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。

甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。

为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。

由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。

而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。

两种醇氧化酶蛋白：毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。

细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。

甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。

AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。

AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。

表达：AOX1基因的表达在转录水平受调控。

重组表达载体ppic9k-hepcidin的构建及其在毕赤酵母中的表达和鉴定

北京化工大学硕士学位论文重组表达载体pPIC9K-Hepcidin的构建及其在毕赤酵母中的表达和鉴定姓名：***申请学位级别：硕士专业：环境工程指导教师：***20050615北京化工大学硕士学位论文子。

与以往在植物１９］、昆虫类Ｉｌｏｌ、和软件动物㈣发现的抗菌多肽一样，人类Ｈｅｐｃｉｄｉｎ也具有广泛的抗菌、抗真菌、抗原生动物的作用。

图１＿１Ｈ印ｃｉｄｉｎ的结构示意图Ｈｅｐｃｉｄｉｎ基因位于人的第１９号染色体上，而小鼠则位于第７号染色体上。

ＨｅＤｃｉｄｉｎ基因由三个外显予和两个内含子组成，转录后的ｍＲＮＡ长约为Ｏ．４ｋｂ。

其中第三个外显子编码了Ｈｅｐｃｉｄｍ的氨基酸序列。

人、大鼠和小鼠Ｈｅｐｃｉｄｉｎ的基因结构极为相似，在Ｈ印ｃｉｄｉｎ基因上游，均与ｕｓＦ２（ｕｐｓｔｒｅ锄ｓｔｉｎａｍａｔｏ巧ｆ．ａｃｃｏｒ２）基因紧密相连。

两个基因中间只有１．２４ｋｂ的间隔，在这一部位存在着ｍ盯３Ｂ，Ｃ／ＥＢ邓，和ＮＦ—ＫＢ等潜在转录调节子以及１ｗｒＡ起始结合位点。

ＮｏｒｍｅｍＢｌｏｎｉｎｇ的分析结果显示，Ｈｅｐｃｉｄｉｎ的基因在肝脏特异表达，心脏、脊髓、肺表达很少，前列腺、军丸、卵巢、小肠、结肠、肾脏和膀胱几乎没有表达［６一。

ＨｅｐｃｉｄｉＩｌ作为一种抗菌多肽，损伤、感染和炎症刺激可强烈引起该基因表达的增加【１２，１３］。

高铁饲料饲喂的小鼠，Ｈｅｐｃｉｄｉｌｌ基因表达也显着增加【１２】。

但ＨｅｐｃｉｄｉｎｍＲＮＡ没有铁反应组件（ＩＲＥ），所以Ｈ印ｃｉｄｉｎⅡ皿ＮＡ随铁状态而改变的机理目前尚不十分清楚垆Ｊ。

北京化工大学硕士学位论文白的作用下被氧化为三价铁，与转铁蛋白结合后在血浆中被运输到其它组织加以利用【５】（图１．２）。

图１．２ＰｒｏｐｏｓｅｄｓｔｅｐｓｉｎＨｅｐｃｉｄｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｉｍｎｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ．（上）Ｉｎｃｒｅａｓｅｄｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｏｆｎ铀５ｆ咖ｉＩｌ＿ｂｏ恤ｄｉｒｏｎｂｙＴ矗也（ｏｒｅＸｐｏｓｕｆｅｔｏ１ｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈ撕ｄｅ）ｌｅａｄｓｔｏ（２）ｕｐｔａｋｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｐｒｏｄｕｃ廿０ｎａｎｄｓｅｃｒｅｔｉｏｎｏｆＨｅｐｃｉｄｉｎ，ｗｈｉｃｈ（兰）ｉｎｔｅｒａｃｔｓｗｉｔｈｔｈｅＢ２Ｍ椰Ｅ．Ｔ侬１ｒｅ劬ｌｔｉｏｎｂｙＲＥｍａｃｒｏｐ｝ｌａｇｅｄｕｏｄｅ删ｃｒｙｐｔｃｅｌＩｓ．（生）ｃｏｍｐｌｅｘａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｓｉｒｏｎｕｐｔａｌ（ｅｏｒＣ叮ｐｔｃｅｌｌｓｄｉ丘色ｒｅｎｔｉａｔｅｉｒｌｔｏｄａｕｇｔｌ々ｅｒｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅｓｐｒｏＦ咖ｍｅｄｔｏｈａｖｅｄｅｃｒｅａｓｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｉｒｏｎｎ狮ｓｐｏｒｔｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｌｅａｄｊｎｇｔｏ（量）ｄｅｃｒｅａＳｅｄｄｉｅ协ｒｙｉｒｏｎａｂｓｏｒｐ廿ｏｎ，１．３铁代谢调节除了月经，人体没有排出体内铁的生理机制。

有机磷水解酶基因多拷贝表达载体的构建

有机磷水解酶基因多拷贝表达载体的构建及其在酵母中的表达13试点班2013221107110058 卓琴摘要：目的：构建OPH2 的多拷贝表达载体，筛选获得高表达的菌株，并对表达的产物进行初步的酶学性质研究。

方法：利用overlapping方法合成OPH2基因，用生物砖的方法构建多拷贝，将构建完成的基因连接到pHBM905BDM表达载体上,将该载体通过化学转化法转入毕赤酵母工程菌中，摇瓶发酵，筛选表达菌株，并对表达产物进行鉴定和酶学性质研究。

结果：成功构建了OPH2毕赤酵母表达载体，并获得OPH2的多拷贝表达菌株，通过鉴定获得目的表达产物。

结论：通过毕赤酵母表达系统，成功构建了高表达、高活性的OPH2重组菌株，使得OPH2工业化生产和应用有着良好的前景。

关键词：载体构建；基因表达；毕赤酵母；多拷贝Construction of Recombinant Plasmid with Multi-copy Expression Cassette for High Expression oforganophosphorushydrolase in Pichia pastorisAbstract: Objective: To construct recombinant plasmid with multi-copy expression cassette of OPH2 and to obtain strain with high expression. Research on the characterization of expression product. Methods: The Gene of OPH2 was synthesised by over lapping and muti-copy was constructed by bio-brick. The recombinant plasmid was transform in Pichia pastoris .The clones were picked up and screened in shaking culture. Results: The vector pHBM905BDM-oph2 was constructed and high expression strain was screened. Conclusion: By pichia expression system, successfully built a high expression, highly active OPH2 recombinant strains, makes OPH2 industrialized production and application has a good prospect.Key words: Recombinant Plasmid; Pichia pastoris; Protein Expression;multi-copy0 引言有机磷农药具有高效、杀虫广泛等特点,对农业发展和人类粮食供给做出了巨大的贡献。

人源EC-SOD在毕赤酵母中的构建与表达

人源EC-SOD在毕赤酵母中的构建与表达林士森;刘玮洁;林靖颖;杨楠楠;刘树滔【摘要】A highly expression strain was constructed by genetic engineering technology.Furthermore,EC-SOD derived from Pichia showed a high activity.EC-SOD was exported into the 25 mL culture medium with an antioxidative activity of 508 U · mg-1;5 L culture medium with an antioxidativeactivity of 909 U · mg-1.The supernatant was concentrated and purified by DEAE rsin.And the purified EC-SOD show the antioxidative activity of 1 700 U · mg-1.Finally the recombined protein show the activity of enzyme has been identified through NBT analysis.%利用基因工程技术构建表达载体并电转化至毕赤酵母中,成功实现人源EC-SOD在毕赤酵母X33中的表达.重组蛋白经盐酸羟胺法测得25 mL摇瓶发酵液上清酶活为508 U·mg-1,5L发酵液上清酶活为909U·mg-1.发酵液上清用硫酸铵沉降后,使用DEAE弱阴离子交换树脂初步分离纯化出较纯的EC-SOD,测得比活为1 700 U·mg-1,并进行氯化硝基四氮唑蓝(NBT)活性定性染色.结果表明,毕赤酵母成功胞外表达具有一定活性的SOD蛋白.【期刊名称】《福州大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(046)002【总页数】5页(P281-285)【关键词】人源EC-SOD;毕赤酵母;构建;表达;NBT染色【作者】林士森;刘玮洁;林靖颖;杨楠楠;刘树滔【作者单位】福州大学生物工程研究所,福建福州 350002;福州大学生物工程研究所,福建福州 350002;福州大学生物工程研究所,福建福州 350002;福州大学生物工程研究所,福建福州 350002;福州大学生物工程研究所,福建福州 350002【正文语种】中文【中图分类】Q7860 引言胞外超氧化物歧化酶(extracellular superoxide dismutase， EC-SOD)是一类含Cu、 Zn原子的SOD酶类, 可高效催化超氧阴离子自由基歧化为H2O2与O2, 能够清除体内多余的氧自由基[1]，在组织损伤修复、口腔癌、肺损伤等方面的治疗有明显效果[2-4]，具有较高潜在价值. 但EC-SOD在生物体内的含量远低于其它SOD同工酶，目前主要从动物主动脉和肺部中提取，提取工艺繁琐且最终获取量较低，不利于工业化生产应用[5-6]. 工业生产中为了解决产量少的问题，通常利用基因工程技术构建高效表达菌株，便于制备大量EC-SOD投入于生产应用. 但在许多表达系统中，如细菌表达系统，存在无法对真核蛋白进行正确的加工处理、表达蛋白常以包涵体形式存在等一系列问题[7-8]；在哺乳动物系统中，其表达重组蛋白结构与天然蛋白高度相似但表达量较低[9]. 因此采用甲醇营养型毕赤酵母表达体系，表达的目的蛋白能够分泌至胞外，有利于工业上的分离纯化，其表达的蛋白能够形成二硫键、糖基化修饰等高级结构，且表达量高，与天然蛋白相似，为人源EC-SOD的获取提供了极大的便利[10].目前已有构建EC-SOD表达菌株的少量报道，在酵母表达系统的研究中[11]，其发酵液通过超滤浓缩后， EC-SOD表达量也仅有0.45 mg·mL-1，酶活力为760 U·mg-1，可见其构建的表达菌株并不能满足工业化需求，并且N端存在多余氨基酸(谷氨酸、苯丙氨酸)，使重组蛋白与天然EC-SOD的N端结构存在一定差异. 本研究在前人基础上，致力于改善酶活较低， N端非天然产物等问题，以人源EC-SOD基因为出发点，对比毕赤酵母最适密码子并对其修改，以期显著提高毕赤酵母的表达水平，且与天然EC-SOD结构更加相似. 研究利用基因工程技术构建EC-SOD毕赤酵母表达菌株，并对其表达的EC-SOD进行性质分析与酶活力测定.1 材料与方法1.1 菌株与质粒pUC57由上海生工公司合成；扩增菌株JM109、表达菌株Pichia pastoris X33及表达载体pPICZαA购自美国Invitrogen公司.1.2 主要药品与试剂DNA marker DL5000、 DL2000，限制性内切酶EcoR I、 Sac I、 Xho I、 Sal I、PCR mix等购自日本Takara公司； UNIQ-10柱离心式质粒小量抽提试剂盒、琼脂糖胶回收试剂盒、 Protein Molecular Weight Marker等购自上海生工生物工程公司、美国Thermo Fish公司；酵母提取物及胰蛋白胨等为美国Sigma公司产品； DEAE离子交换树脂为日本TOSOH公司产品；其余试剂药品均为分析纯.1.3 实验方法1.3.1 表达载体的构建由上海生工公司合成的含有人源EC-SOD密码子优化后基因(687 bp)的pUC57质粒，质粒设计中在基因前后加入XhoⅠ(上游)和EcoRⅠ(下游)两个酶切位点，同时引入2个碱性氨基酸Lys 和Arg以实现目的蛋白的胞外分泌. 最终确定引物上游为CTCGAGAAAAGATGGACTGGTGA及下游引物为GAATTCTTAAGCAGCCTTACATTCAG.将pPICZαA质粒用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切切开，并从pUC57质粒上使用相同切下含有目的片段的序列(使用EcoRⅠ和SalⅠ酶切后序列大于目的基因序列，但由于在设计基因序列中尾端含有终止密码子，所以多余序列不影响表达)连接至pPICZαA载体上，筛选重组质粒pPICZαA-EC-SOD，转E. coli.(JM109)，筛选表达菌株JM109-EC-SOD提取质粒经EcoRⅠ与XhoⅠ双酶切并PCR验证筛选出目的菌株，进一步使用SacⅠ线性化重组质粒进入毕赤酵母X33，提取酵母基因组DNA经验证筛出目的菌株.1.3.2 毕赤酵母的诱导与表达目的蛋白的实验参考Invitrogen公司毕赤酵母表达手册说明书. 重组菌株Pichia.(X33) 置于YPD 培养基中，30 ℃摇培24 h后，按1%的接种量转接至不含葡萄糖的YP培养基中培养，待OD600 = 3.0～5.0开始诱导(诱导前取样)，按1%(体积分数)的诱导剂量添加甲醇，每隔24 h补加甲醇至终体积分数为1%并取样1 mL测酶活，在诱导第6天和第7天后酶活趋于稳定，无明显增加，因此只需诱导5 d.1.3.3 EC-SOD初步分离纯化由于目的蛋白理论等电点为6.4左右，在pH值为8的条件下，能使杂蛋白吸附到DEAE弱阴离子交换树脂上，目的蛋白不能被吸附，从而起到分离的作用. 因此将发酵液离心后，取上清3 L进行硫酸铵沉淀，用30 mL pH值为8的缓冲液溶解沉淀，并用截留相对分子质量为3 500 u隔夜透析. 使用柱体积30 cm× φ1 cm的层析柱，以1 mL·min-1流速上样5 mL样品，收集穿透峰并用OD280检测及酶活测定，验证其中含有重组蛋白EC-SOD.1.3.4 EC-SOD活性定性检测对发酵液12 000 r·min-1离心10 min，收集上清， SDS-PAGE 观察分析. 上清液与初步分离纯化样品采用盐酸羟胺法测定SOD酶活力[12]， NBT活性电泳染色[13].2 结果分析2.1 表达载体的构建与验证以pPICZαA质粒为真核表达载体，构建EC-SOD基因毕赤酵母表达质粒，经EcoRⅠ，XhoⅠ双酶切(见图1)及PCR验证(见图2). 箭号处为目的基因，且重组质粒经测序检验含有目的基因，这些结果均表明目的片段已成功连接至表达载体上.随后将重组质粒使用SacⅠ线性化后，电转化至毕赤酵母X33中，在Zeocin抗性平板挑取单菌落培养并提取酵母基因组DNA，进行PCR验证(见图3).图1 重组质粒PCR产物Fig.1 PCR identification of the recombinant图2 重组质粒双酶切Fig.2 Enzyme digestion identification of the recombinant图3 酵母基因组PCR验证电泳图Fig.3 PCR identification of the chromosome of Pichia pastoris2.2 rcEC-SOD诱导与表达及活力鉴定25 mL培养基在100 mL三角瓶中培养并诱导5 d，收集每日菌液离心取上清，进行SDS-PAGE分析(见图4)，并使用盐酸羟胺法测定SOD酶活. 结果表明，最终活力为178 U·mL-1，比活为508 U·mg-1，酶活随诱导天数增加而升高(见图5).图4为毕赤酵母X33重组菌株表达产物的SDS-PAGE电泳图. 电泳结果显示，在相对分子质量为17与40 ku处，诱导前未表达EC-SOD，诱导后出现EC-SOD 的蛋白条带(见图4上下箭头部分)，且蛋白质条带伴随着诱导时间的增加而逐渐加深.图4 毕赤酵母EC-SOD-X33发酵液上清电泳图Fig.4 SDS-PAGE analysis ofthe supernatant from Pichia pastoris图5 毕赤酵母诱导过程中酶活变化趋势图Fig.5 Activity change trend of EC-SOD during the induction of Pichia pastoris for 5 days2.3 rcEC-SOD初步分离纯化发酵液上清经过硫酸铵沉淀，透析后使用DEAE弱阴离子交换树脂进行初步分离纯化，在pH=8.0时上样收集穿透峰，用1 mol·L-1 NaCl溶液洗脱杂蛋白. 纯化结果如图6所示，箭头处为穿透峰，经酶活测定穿透峰中含有大量EC-SOD，洗脱峰中未检测到酶活性，说明其中不含有EC-SOD. 收集穿透峰进行SDS-PAGE，结果如图7所示，穿透样品在17与40 ku处出现EC-SOD的蛋白条带，进一步证实EC-SOD富集在穿透峰.图6 EC-SOD-X33 DEAE弱阴离子交换树脂初步分离Fig.6 Purification of EC-SOD in DEAE resin图7 EC-SOD-X33 DEAE弱阴离子交换树脂初步分离Fig.7 Preliminary preparation with DEAE resin2.4 rcEC-SOD活性电泳染色为进一步验证纯化后蛋白活性，进行氯化硝基四氮唑蓝(NBT)法活性定性检测. 取发酵液上清与过DEAE弱阴离子树脂初步分离纯化液进行Native-Page凝胶电泳后，利用NBT法对PAGE胶进行活性定性检测. 结果如图8、 9所示，在没有EC-SOD的位置为蓝紫色背景，发白位置出现清晰透明的SOD活性染色条带，证实纯化的蛋白具有SOD酶活性.图8 发酵上清液NBT活性染色Fig.8 Supernatant in native-page and stain with NBT图9 初步分离纯化蛋白活性染色Fig.9 Preliminary preparation in native-page and stain with NBT3 讨论实验在毕赤酵母表达系统中，成功构建重组pPICZαA质粒，并在Pichia pastoris中成功胞外分泌表达，分泌出的EC-SOD蛋白具有活性高、易分离纯化、与天然蛋白相似的特点.在毕赤酵母构建EC-SOD表达菌株的相关研究中，已经有学者做过相关实验[11]，将发酵液浓缩后进行性质分析，浓缩后比活约为760 U·mg-1，该实验采用ELISA法定量出EC-SOD的蛋白含量，所以比活相当于纯化后的蛋白比活. 但该研究未对EC-SOD基因进行密码子优化， N端存在多余的氨基酸(谷氨酸、苯丙氨酸)，因此表达量与结构特性等方面有待提高.本研究在前人研究的基础上加以改进，首先对天然EC-SOD的基因序列进行密码子优化，从理论上能够提高酵母的表达水平，并删去N端信号肽，直接连接毕赤酵母中的KEX2水解酶. 其次在序列设计中，实验设计的蛋白序列与天然的EC-SOD一致，拥有极其相似的生理活性. 经酶活与蛋白量测定，在25 mL摇瓶上清液的比活约为508 U·mg-1， EC-SOD蛋白表达量为0.19 mg·mL-1， 5 L发酵罐中比活约909 U·mg-1，经DEAE初步纯化后，比活约为1 700 U·mg-1. 因此，本实验中发酵上清液(未浓缩)的蛋白表达量和酶活都与前人实验中浓缩后的结果相近，甚至更好. 由于实验设计的EC-SOD的N端序列与天然一致，因此在比活力上得到显著提升. 通过NBT染色实验，进一步验证重组菌株表达出具有活性的EC-SOD蛋白.在实验的最终发酵产物中，发现可能视为单体(17 ku)与二聚体(40 ku)的重组蛋白同时存在，也可能是杂蛋白形式存在，但并未对其作出验证，需通过后续实验进一步分析. 通过文献查阅得知，天然的EC-SOD主要是以四亚基形式存在，亚基之间是靠疏水作用结合[14-15]，因此在SDS-PAGE仅能打断分子间的二硫键. 相关研究也表明重组表达的EC-SOD具有单体与二聚体结构共存的现象，并且在Cu/Zn SOD中也存在类似单体与二聚体共存的情况[16]，由此可推断EC-SOD在溶液中可能存在多聚体结构.参考文献：[1] TIBELL L, AASA R, MARKLUND S L. 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Purification and characterization of extracellular superoxide dismutase in mouse lung[J]. Biochem Biophys Res Commun. 2000, 275(2): 542-548.[7] SON Y J, BAE J Y, CHONG S H, et al. Expression, high cell density cultureand purification of recombinant EC-SOD in Escherichia coli[J]. Appl Biochem Biotechnol, 2010, 162(6): 1585-1598.[8] 朱希强, 袁勤生. 重组人EC-SOD包涵体的稀释复性及重折叠后蛋白的纯化[J]. 中国生物制品学杂志, 2005, 18(3): 252-255.[9] KIM S, KIM H Y, KIM J H, et al. Enhancement of potency and stability of human extracellular superoxide dismutase[J]. BMB Rep, 2015, 48(2): 91-96.[10] CEREGHION G P L, CEREGHINO J L, LLGEN C, et al. Production of recombinant proteins in fermenter cultures of yeast Pichia pastoris[J]. Current Opinion in Biotechnology, 2002, 13(4): 329-332.[11] CHEN H L, YEN C C, TSAI T C, et al. Production and characterization of human extracellular superoxide dismutase in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[J]. Agricultural and Food Chemistry, 2006, 54(21): 8041-8047.[12] ZHANG C, BRUINS M E, YANG Z Q, et al. A new formula to calculate activity of superoxide dismutase in indirect assays[J]. Analytical Biochemistry, 2016, 503: 65-67.[13] 罗广华, 王爱国. 植物SOD的凝胶电泳及活性的显示[J]. 植物生理学通讯, 1983(6): 44-45.[14] PETERSEN S V, OURY T D, VALNICKOVA Z, et al. The dual nature of human extracellular superoxide dismutase: one sequence and two structures[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2003, 100(24): 13875-13880.[15] OURY T D, CRAPO J D, VALNICKOVA Z, et al. Human extracellular superoxide dismutase is a tetramer composed of two disulphide-linkeddimers: a simplified, high-yield purification of extracellular superoxide dismutase[J]. Biochemical Journal, 1996, 317(Pt 1): 51-57.[16] 杨志强, 张晨, 敖伟, 等. 毕赤酵母表达重组人源Cu/Zn SOD的分离纯化与稳定性表征[J]. 中国食品学报, 2011, 11(5): 108-113.。

毕赤酵母组成型高效表达启动子的筛选鉴定

毕赤酵母组成型高效表达启动子的筛选鉴定石义超;王凤忠;江均平;朱利泉【摘要】为获得高产量、高活性的葡萄糖氧化酶(GOD)酵母表达菌株,优化了GOD的T132S/T56V双突变编码序列,将之克隆到表达载体pGAPk上得到表达载体pGAPk-h2-GOD,以pGAP启动GOD基因的表达.将pGAPk-h2-GOD上的pGAP启动子替换为pGCW14和pAOX1,并对pGCW14启动子进行改造,得到3种pGCW14的改造体,最终得到包括pGAPk-h2-GOD在内的6种不同启动子的重组表达载体.将这6种载体转化毕赤酵母GS115,建立了一种简便高效的筛选方法初步筛选出GOD重组菌株,再对筛选到的转化子进行发酵培养,测定发酵上清液的GOD酶活力,以此来比较各种启动子启动效率的强弱.结果显示:pGCW14的启动效率是pGAP的3～5倍,改造后的启动子pGCW14+ G20A/C-467T(0.767)和pGCW14-UA(0.689)的启动效率较原始的pGCW14(0.574)都有明显的提高,尤其pGCW14+ G20A/C-467T启动效率最高,比原始pGCW14提高了32.5％左右.与诱导型启动子pAOX1 (1.187)相比,pGCW14+ G20A/C-467T(1.109)的启动效率仅比其低6.6％左右.结论:改造后的启动子可望在毕赤酵母组成型高效表达的研究应用中具有一定的前景.【期刊名称】《食品工业科技》【年(卷),期】2018(039)013【总页数】7页(P110-116)【关键词】葡萄糖氧化酶;巴氏毕赤酵母;启动子pGCW14;组成型表达【作者】石义超;王凤忠;江均平;朱利泉【作者单位】西南大学农学与生物科技学院,重庆400715;中国农业科学院农产品加工研究所,北京100193;中国农业科学院农产品加工研究所,北京100193;西南大学农学与生物科技学院,重庆400715【正文语种】中文【中图分类】TS201.3随着基因工程技术和蛋白异源表达的飞速发展,越来越多的表达系统被建立并得到广泛应用。

毕赤酵母高效表达策略概述

-毕赤酵母高效表达策略概述1.基因的内在特性主要包括mRNA 5’端非翻译区(5’2 U TR)、基因的A +T 组成和密码子的使用频率3 个方面。

由于巴斯德毕赤酵母中乙醇氧化酶的表达量极高(占胞内可溶蛋白的30% 以上) 因此为了有高的蛋白表达量,维持外源基因mRNA 5’-U TR。

尽可能和AOXlmRNA 5’-U TR 相似是必需的, 最好是保持两者一致。

A + T 含量高的基因在巴斯德毕赤酵母中表达时偶尔会造成转录提前终止,这是因为A T 丰富区可能存在转录提前终止信号。

因此对A T 含量丰富的基因最好是重新设计序列, 使其A + T 含量在30%~55% 范围内。

巴斯德毕赤酵母也有特殊的密码子偏好趋向。

(赵翔,霍克克,李育阳. 毕赤酵母的密码子用法分析[J ] . 生物工程学报,2000 ,16(3) :308 - 311.)外源蛋白自身的理化特点也影响其表达和分泌。

外源蛋白的加工修饰都会影响蛋白的表达量。

2.选择强启动子启动子在转录水平上调控基因的表达最常用的启动子是AOXI 启动子。

PGAG(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子) 是最近在巴斯德毕赤酵母中克隆到的一个组成型启动子,在它的控制下β- LabZ 基因表达率比甲醇诱导下的PAOX驱动的产量更高,由于该组成型启动子不需要甲醇诱导,发酵工艺应该更简单,同时其产量更高,所以成为代替PAOX1 最有潜力的启动子。

通过分离选择恢复利用甲醇能力的自发突变体, 从AOX1 基因缺陷菌株中分离M ut+ 的自发突变体,从中筛选提高表达量的突变体。

(戴秀玉, 王恂, 周坚1毕赤氏酵母PAOX2 突变化序列分析〔J 〕1微生物学报, 1999, 39 (6) :559~5611)3.增加外源基因整合拷贝数(1)Invitrogen 公司最新发展的质粒pPIC9K上带有G418 的抗性基因,可以通过转化子对G418抗性水平快速筛选高拷贝转化子(配合电激法转化的效果更好)。

一种基于重组汉逊酵母细胞技术高效培养、表达乙肝表面抗原的方法

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810537430.5(22)申请日 2018.05.30(71)申请人艾美汉信疫苗（大连）有限公司地址 116000 辽宁省大连市金州新区湾达路35-4号1-3层中国（辽宁）自由贸易试验区(72)发明人李贵兴　张平　陈新亭　李纯厚　姜晓娟　刘立斌　(74)专利代理机构大连东方专利代理有限责任公司 21212代理人赵淑梅　李馨(51)Int.Cl.C12N 1/19(2006.01)C12N 15/81(2006.01)C12P 21/02(2006.01)C07K 14/02(2006.01)C12R 1/78(2006.01)(54)发明名称一种基于重组汉逊酵母细胞技术高效培养、表达乙肝表面抗原的方法(57)摘要本发明涉及一种基于重组汉逊酵母细胞技术高效培养、表达乙肝表面抗原的方法，属于医药生物工程技术领域。

本发明所述方法包括一级种子培养步骤、二级种子培养步骤、三级种子培养步骤、发酵培养步骤。

本发明中重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母)细胞扩增、培养表达后的细胞密度比现有基因重组乙肝疫苗细胞扩增、培养表达的细胞密度更高，HBsAg表达量更高，且HBsAg颗粒结构完整，细胞颗粒大小均一。

权利要求书2页说明书5页附图5页CN 108715815 A 2018.10.30C N 108715815A1.一种基于重组汉逊酵母细胞技术高效培养、表达乙肝表面抗原的方法，其特征在于：所述方法包括一级种子培养步骤、二级种子培养步骤、三级种子培养步骤、发酵培养步骤；所述发酵培养步骤为：取25L三级种子培养物接种于100-150L发酵培养基中，28-32℃培养88-95h；所述发酵培养基，按重量份，由下述组份组成：生长期的搅拌速度由200rpm增加至500rpm，pH值为4.85-5.25，空气流量由100L/min增加至300L/min，溶氧不低于10％；补料期保持生长期的发酵条件不变，当溶氧升至最大值时，加入8-10L甘油，反复6-8次；诱导期的搅拌速度由500rpm降低至450rpm，pH值为5.35-5.75，空气流量由150L/min降低至20L/min，溶氧为60-90％，并且，在加入最后一次甘油后溶氧升至最大值时，开始先流加体积比为1：4-6的甘油甲醇混合液25-30L，再流加甲醇70-80L，流加的速度为10-40mL/ min。

结合利用pGAPZαA和pPICZαA构建目的蛋白的多拷贝载体并在毕赤酵母中表达

结合利用pGAPZαA和pPICZαA构建目的蛋白的多拷贝载体并在毕赤酵母中表达冯菲;王雪妍;陈晓飞;宁萌;周伏忠;刁文涛【摘要】Vectors pGAPZαA and pPICZαA were utilized to construct the multi-copies expression plasmid that can be linearized to maintain the transformation rate at a high level and have a higher yield of interesting protein than the single-copy plasmid.The gene of the interesting protein was originally constructed in the constitutiveexpression vectorpGAPZαA,then the expression cassette is digested out with the isocaudamers Bgl Ⅱ and BamH Ⅰ and co nstructed in the methanol inducible expression vector pPICZαA at BamH Ⅰ site.The multi-copies expression plasmid was constructed after several times repeating.The LZ8 which is a fungal immunomodulatory protein from Lingzhi is used as an example.Its multi-c opies expression plasmid pPICZαA-[GAPZαA-LZ8] 4 is constructed after repeating 4 times.Then the plasmid is linearized at the unique Sac Ⅰ site of pPICZαA and transformed in GS115.The yield of LZ8 expressed in the clones is transformed with pPICZαA-[GAPZαA-LZ8]4 reaches 2 or 3 times of that in the clones which is transformed with pGAPZαA-LZ8.We find the linearizable multi-copies expression plasmid bases on combination utilization of pGAPZαA and pPICZαA can express the interesting protein in GS115 at a higher level than the single-copy plasmid.%结合利用载体pGAPZαA和pPICZαA构建目的蛋白的可线性化多拷贝表达载体,并转化毕赤酵母表达目的蛋白.首先将目的蛋白基因构建到组成型表达载体pGAPZαA中,然后依据载体自身特性,用同尾酶Bgl Ⅱ和BamH Ⅰ切取其表达盒并连接到甲醇诱导型载体pPICZαA中的BamH Ⅰ位点处,经多次重复后获得目的蛋白多拷贝表达载体,线性化后电转化毕赤酵母表达目的蛋白.灵芝免疫调节蛋白LZ8是一个已成功在毕赤酵母中表达的蛋白,作为检验该方法的样本其基因被首先构建到载体pGAPZαA中得到质粒pGAPZαA-LZ8,切取其表达盒构建到载体pPICZαA中,经过4次重复得到了多拷贝表达载体pPICZαA-[GAPZαA-LZ8]4,然后利用pPICZαA特有的限制性内切酶位点SacⅠ进行线性化,最终电转化到毕赤酵母GS115中进行组成型表达蛋白LZ8,其表达量达到pGAPZαA-LZ8转化菌株表达量的2～3倍.经检验,结合利用载体pGAPZαA和pPICZαA可以构建目的蛋白的多拷贝表达载体,并且可以对载体进行线性化而不影响转化酵母时的转化效率.【期刊名称】《河南科学》【年(卷),期】2017(035)001【总页数】5页(P83-87)【关键词】pGAPZαA;pPICZαA;多拷贝;毕赤酵母【作者】冯菲;王雪妍;陈晓飞;宁萌;周伏忠;刁文涛【作者单位】河南省科学院生物研究所有限责任公司,郑州450008;河南省微生物工程重点实验室,郑州450008;河南省科学院生物研究所有限责任公司,郑州450008;河南省微生物工程重点实验室,郑州450008;河南省科学院生物研究所有限责任公司,郑州450008;河南省微生物工程重点实验室,郑州450008;河南省科学院生物研究所有限责任公司,郑州450008;河南省微生物工程重点实验室,郑州450008【正文语种】中文【中图分类】Q785酵母作为单细胞的真核生物，既具有与原核细胞生物相当的生长速度，又具有真核生物对蛋白质翻译后修饰的能力，在表达一些需要翻译后修饰的蛋白时具有常用的大肠杆菌表大系统无可比拟的优势，而相对于昆虫细胞和哺乳动物细胞这些高等真核细胞而言，其操作简单、成本低廉，所以在蛋白质表达方面酵母表达系统得到广泛的应用与发展［1-2］.酿酒酵母作为最早开发的酵母表达宿主，成功表达了包括干扰素、重组疫苗、胰岛素和降钙素在内的多种真核蛋白［3-5］.但是酿酒酵母存在难以高密度发酵、缺乏强有力启动子以及分泌效率低等缺点，所以毕赤酵母表达系统就应运而生［6-7］.毕赤酵母不仅具有醇氧化酶（AOX）和三磷酸甘油醛（GAP）等强启动子［8-10］，而且易于进行高密度发酵而更高效地表达外源蛋白，胞外分泌表达的鼠明胶蛋白产量可达14.8 g/L［11］.在毕赤酵母中，外源基因可以整合重组到其基因组中而不易丢失［12］，此外毕赤酵母还具有自身胞外蛋白少，分泌表达的外源蛋白糖基化程度低等优点［13-14］.因而毕赤酵母表达系统得到了越来越广泛的研究与应用.由于毕赤酵母中没有稳定的天然载体，其表达载体一般是能够在大肠杆菌中复制扩增的穿梭载体，不含有酵母复制起点，只能重组到酵母基因组中进行外源基因表达［10］.由Invitrogen公司开发的诱导型表达载体pPICZ/pPICZα系列与组成型表达载体pGAPZ/pGAPZα系列分别含有甲醇诱导型醇氧化酶（AOX）启动子和组成型表达的三磷酸甘油醛（GAP）启动子，载体中均含有博莱霉素（zeocin）抗性基因，用于细菌及酵母转化筛选，被用于在毕赤酵母中分泌或胞内表达目的蛋白［15-19］，这两个系列的载体均可利用BglⅡ和BamHⅠ这一对同尾酶构建外源基因多拷贝质粒，从而获得外源蛋白表达量更高的多拷贝转化子，但是由于质粒的线性化位点包含在启动子中，在多拷贝质粒构建时也同时引进了多个线性化酶切位点而使得在酵母转化时无法对质粒进行线性化而大大降低转化效率（参见Invitrogen pPICZ/pPICZα系列载体说明书）.本试验利用pPICZ/pPICZα载体与pGAPZ/pGAPZα载体有不同线性化酶切位点这一特点，结合使用实验室已有的载体pGAPZαA和pPICZαA构建灵芝真菌免疫调节蛋白LZ8这一已经成功在毕赤酵母中表达的蛋白的多拷贝质粒［20］，并将其线性化质粒转化到毕赤酵母GS115中进行多拷贝表达.1.1 材料质粒与菌株：pGAPZαA、pPICZαA、大肠杆菌Top10、酵母菌GS115.主要试剂：博莱霉素（zeocin）、Tris、盐酸、甘氨酸、十二烷基磺酸钠（SDS）、SDS聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖、冰醋酸、EDTA、酵母基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒等.培养基：低盐LB培养基（5%NaCl，用于质粒构建）、YPD培养基（用于酵母培养）.酶：EcoRⅠ、XbaⅠ、BglⅡ、BamHⅠ、AvrⅡ和SacⅠ等DNA限制性内切酶，碱性磷酸酶（CIAP）、T4 DNA连接酶等.1.2 实验方法1.2.1 质粒构建首先参考《分子克隆实验指南》一书将目的基因LZ8构建到载体pGAPZαA中，得到质粒pGAPZαA-LZ8.然后根据质粒pGAPZαA和pPICZαA适合构建多拷贝的特点，将质粒pGAPZαA-LZ8中的表达盒用BglⅡ和BamHⅠ这一对同尾酶切出，然后构建到经BamHⅠ酶切并经碱性磷酸酶CIAP脱磷的载体pPICZαA中.在提取质粒后用BglⅡ和BamHⅠ进行双酶切，然后根据酶切结果判断连接方向是否正确，经n次重复后可构建含有n个LZ8表达盒拷贝的质粒pPICZαA-［GAPZαA-LZ8］n.1.2.2 酵母转化参考Invitrogen公司的质粒pGAPZαA说明书中线性化质粒酵母电转化方法.1.2.3 蛋白表达量计算取待测发酵液上清，加入上样缓冲液，100℃加热5 min，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，经考马斯亮蓝染色后，用BIORAD凝胶成像仪成像，并统计目的蛋白条带灰度值作为计算蛋白表达量的依据.2.1 多拷贝质粒构建首先利用EcoRⅠ和XbaⅠ两个限制性内切酶位点将灵芝免疫调节蛋白LZ8的基因构建到载体pGAPZαA中得到质粒pGAPZαA-LZ8，如图1（a）所示.然后再利用BglⅡ和BamHⅠ两个限制性内切酶位点将质粒pGAPZαA-LZ8中包括启动子GAP、目的基因LZ8和终止子AOX1 TT在内的整个表达盒构建到载体pPICZαA 中，共构建进4个拷贝，得到质粒pPICZαA-［GAPZαA-LZ8］4，如图1（b）所示.2.2 酵母转化与蛋白表达量比较利用电转化法将经限制性内切酶AvrⅡ线性化的质粒pGAPZαA-LZ8和pGAPZαA（阴性对照）以及经限制性内切酶SacⅠ线性化后的质粒pPICZαA-［GAPZαA-LZ8］4分别转化到酵母GS115中.随机挑取5个pGAPZαA-LZ8转化菌株，3个pGAPZαA转化菌株和5个pPICZαA-［GAPZαA-LZ8］4转化菌株，提取酵母基因组后，用PCR的方法检测基因LZ8，结果如图2所示.由图可见，质粒pGAPZαA-LZ8和pPICZαA-［GAPZαA-LZ8］4都成功转化进GS115中.挑取以上转化后的酵母分别接种到YPD中培养过夜，测量OD600值，然后用新鲜的YPD培养基将其均稀释至OD600值为0.1，继续培养过夜，次日将菌液离心收集上清液，取等量上清进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测LZ8的表达，结果如图3所示，可见质粒pPICZαA-［GAPZαA-LZ8］4在GS115中成功重组并分泌表达了目的蛋白LZ8，其表达量达到pGAPZαA-LZ8转化菌株表达量的2～3倍.本文中用到的由Invitrogen公司开发的组成型表达载体pGAPZαA和诱导型表达载体pPICZαA都可以用来构建多拷贝表达载体，而且其进行多拷贝质粒构建的方法相同.由于转化前质粒的线性化要通过存在于启动子上的DNA限制性内切酶的酶切位点来实现，所以，如果应用单一一种载体进行多拷贝质粒构建的话，质粒就无法线性化，多拷贝质粒的转化效率就会降低.利用这两种载体线性化酶切位点不同这一特性，将连有目的基因的载体pGAPZαA中的表达盒多次构建到载体pPICZαA中，最终通过载体pPICZαA的启动子AOX上的限制性内切酶位点SacⅠ进行线性化，转入酵母后，质粒通过启动子AOX与酵母基因组重组，而由载体pGAPZαA上的组成型启动子GAP启动目的基因来表达，这样即实现了目的基因的多拷贝化，又可以对转化前多拷贝质粒进行线性化而保证转化效率.利用灵芝免疫调节蛋白LZ8进行验证，虽然可能由于营养及转录、翻译等原件的限制原因，含有4个表达盒的多拷贝质粒pPICZαA-［GAPZαA-LZ8］4转化的酵母表达的蛋白LZ8的量相对于单拷贝质粒pGAPZαA-LZ8没有达到4倍，但也有了非常明显的提升，说明这种方法确实可行，而且理论上将两个载体对调使用也应该能够获得甲醇诱导表达的多拷贝转化子.结合利用载体pGAPZαA和pPICZαA可以构建目的蛋白的多拷贝表达载体，得到的多拷贝表达载体可以被线性化而不影响转化酵母时的转化效率，其转化子中目的蛋白的表达量普遍高于单拷贝转化子.【相关文献】［1］ 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影响工程菌株目的基因表达的因素_沈宝明

#综述与专论#生物技术通报BI OTEC HNOLOG Y BULLETI N2010年第3期影响工程菌株目的基因表达的因素沈宝明1,2谭新球2谭周进3 刘勇2(1湖南农业大学生物安全科技学院,长沙410128;2湖南省农业科学院植物保护研究所,长沙410125;3湖南中医药大学基础医学院,长沙410208)摘要: 目的基因在细胞中的表达研究,在理论和应用上都具有重要的意义。

只有弄清影响目的基因表达的因素,才能使目的基因高效表达。

主要讨论目的基因本身、表达载体、宿主细胞、培养条件、诱导剂等因素对目的基因更加高效的表达的影响。

关键词: 工程菌目的基因高效表达影响因素TheM ai n I m pact Fact ors of Target Genes Expressi on i n Host CellsShen Bao m i ng 1,2T a n X i nqi u 2T an Zhouji n3L i u Y ong2(1School of Biology Science and T echnology,H unan Agr i cultural Universit y,Changsha 410128;2Instit ute of PlantP ro tection ,H unan A c ade my of Agric ult ural Science ,Chan gsha 410125;3Sc hoo l of Precli nicalM e d ici ne ,TC M Universit y of H unan ,Chan gsha 410208)Abstrac:t M any com plex i n fluenci ng fac t o rs w ere pa i d g row ing e m phasis on mak i ng targe t genes h i gh -l eve l expressi on i n hostce lls i n the procedure o f g ene express i on .M a i n l y i nfl uence factors i nclud i ng ta rget genes ,expressi on vecto rs ,host ce lls ,culture cond-i ti ons ,and i nducers w ere d i scussed i n deta il in th i s paper .T o hand le t he m effi c i entl y is useful and necessary to hav e targe t genes express as anti c i pated in theory and i n practiceK ey words : Eng i neering bacter i a T arget genes H i gh -l eve l expressionInfl uenc i ng facto rs收稿日期:2009-11-26基金项目:湖南省农业科学院科技创新项目作者简介:沈宝明,男,硕士研究生,主要研究方向为微生物生物技术;E-m ai:l baobao8759@163.co m 通讯作者:谭周进,E-m ai:l tanzh ji n @s ohu.co m;刘勇,E-m ai:l haoasli u@163.co m基因工程是生物工程的一个重要分支,它和细胞工程、酶工程、发酵工程共同组成了生物工程。

rhKD／APPvar毕赤酵母分泌表达质粒的构建及其重组蛋白的表达和纯化

rhKD／APPvar毕赤酵母分泌表达质粒的构建及其重组蛋白的表达和纯化王心童;王虹蛟;王强;孟威宏;颜炜群;任立群【摘要】目的：构建高效分泌表达重组人淀粉样蛋白前体 Kunitz 型蛋白酶抑制剂结构域变异体（rhKD／APPvar）的毕氏酵母工程菌，建立适合大规模发酵、纯化rhKD／APPvar的工艺。

方法：利用已构建的 rhKD／APP表达质粒，在其活性中心两侧设计2个酶切位点（ApaⅠ和SacⅡ），实现人 KD／APP 活性中心 RAM 与BPTI活性中心KAR的替换，构建 rhKD／APPvar表达质粒。

将重组质粒转化到酵母菌 X-33中，优化 rhKD／APPvar表达最佳 pH值，使 rhKD／APPvar获得高效表达。

利用阳离子交换树脂和超滤除盐对重组蛋白进行纯化。

结果：酶切鉴定和测序分析显示成功构建了KD／APPvar-pPICZαC重组质粒。

经电转化成功地将重组质粒转化至酵母菌 X-33中。

SDS-PAGE分析，甲醇诱导表达后在相对分子质量约6700处出现蛋白条带，pH 6.0、甲醇诱导120 h蛋白表达水平最高，经纯化获得纯度达95％的重组蛋白。

结论：成功构建 KD／APPvar-pPICZαC重组质粒，经毕赤酵母表达和纯化获得了 rhKD／APPvar蛋白。

%Objective To construct the engineering bacteria expressing the recombinant human Kunitz protease inhibitor domain of amyloid protein precursor variant (rhKD/APPvar)in Pichia pastoris,and to establish the methods suitable for large-scale fermentation and purification of rhKD/APPvar.Methods The rhKD/APPvar expression vector was constructed based on therhKD/APPvar-pPICZαexpression vector. Two restriction enzyme loci (ApaⅠ and SacⅡ)were added to two flanks of K D/APP and human KD/APP activity center RAM was replaced by the active site of BPTI KAR.After therhKD/APPvar-pPICZαexpression vector was transformed into Pichiapastoris,optimized expression and purification of rhKD/APPvar was performed.The rhKD/APPvar was purified with cation exchange chromatography and desalting.Results The results of digestion identification and DNA sequencing analysis demonstrated that the recombinant plasmid rhKD/APPvar-pPICZα wassuccessfully constructed and transfected into pastoris X-33. The SDS-PAGE analysis results indicated that rhKD/APPvar expressed after the induction of methanol and the relative molecular weight was 6 700.After a series of experiments the optimal expression conditions of rhKD/APPvar were obtained as follows:the optimal pH was 6.0 and the optimal induction time point was about the 5 th day for the strain.After purified the purity of rhKD/APPvar was about 95%.Conclusion KD/APPvar-pPICZ is successfully constructed;after expression in Pichia pastoris and purification,therhKD/APPvar protein is obtained.【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2014(000)003【总页数】5页(P529-533)【关键词】毕赤酵母菌;重组KD/APP变异体;牛胰蛋白酶抑制剂;淀粉样蛋白前体【作者】王心童;王虹蛟;王强;孟威宏;颜炜群;任立群【作者单位】吉林大学中日联谊医院神经内科，吉林长春 130033;解放军第461 医院内科，吉林长春 130021;解放军第461 医院内科，吉林长春 130021;沈阳军区总医院心血管内科，辽宁沈阳110015;吉林大学再生医学科学研究所再生医学系，吉林长春130021;吉林大学再生医学科学研究所再生医学系，吉林长春130021【正文语种】中文【中图分类】Q78牛胰蛋白酶抑制剂（bovine pancreatic trypsin inhibitor，BPTI）是Kunitz家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂，已用于急、慢性肝损伤的研究［1－6］。