高通量、低成本SNP、突变或甲基化检测方法—HRM 技术应用

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高通量基因测序技术在肿瘤研究中的应用研究

高通量基因测序技术在肿瘤研究中的应用研究在现代医学研究中，基因测序技术作为一项重要工具，为人类对肿瘤发生、发展以及治疗的研究提供了强大的支持。

特别是高通量基因测序技术的出现，为科学家们提供了更高质量的测序数据，加速了肿瘤研究的进展。

本文将要探讨高通量基因测序技术在肿瘤研究中的应用，并对其带来的影响进行评估。

一、高通量基因测序技术简介高通量基因测序技术，也称为次代测序技术（Next-Generation Sequencing，NGS），相对于传统测序技术具有更高的测序速度、更低的成本以及更高的测序深度等优势。

通过高通量基因测序技术，科学家们可以在较短的时间内获得大规模的基因序列数据，从而更全面地了解肿瘤的遗传特征和突变情况。

二、高通量基因测序技术在肿瘤分型中的应用通过高通量基因测序技术，可以对肿瘤样本中的基因组进行全面的测序分析，从而确定肿瘤的分型。

肿瘤的分型在临床治疗中具有重要的意义，可以帮助医生选择最佳的治疗方案，提高患者的生存率。

高通量基因测序技术可以检测出肿瘤样本中各种类型的突变，从而确定肿瘤的具体类型，并进行进一步的分析和研究。

三、高通量基因测序技术在肿瘤突变检测中的应用肿瘤突变是肿瘤发生和发展的重要原因之一。

通过高通量基因测序技术，可以高效地检测出肿瘤样本中的各种突变。

首先，科学家们可以通过测序技术获取肿瘤样本中的突变情况；其次，利用基因数据库和生物信息学工具进行数据分析，筛选出与肿瘤相关的突变位点，并进一步探究其在肿瘤发生和发展中的作用。

四、高通量基因测序技术在肿瘤治疗中的应用在肿瘤治疗中，个体化治疗是一种越来越受欢迎的治疗模式。

通过高通量基因测序技术，可以对肿瘤样本进行全基因组测序，分析肿瘤关键致病基因的变异情况，为患者制定个体化治疗方案提供有力支持。

此外，利用高通量基因测序技术还可以监测肿瘤治疗的疗效，指导治疗的调整，并对肿瘤耐药机制进行研究。

五、高通量基因测序技术在肿瘤研究中的挑战与展望尽管高通量基因测序技术在肿瘤研究中有着广泛的应用前景，但仍然面临一些挑战。

SNP技术及发展和应用

谢
谢！
基本步骤

第1步：1个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入酶混合物（包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、Luciferase 和Apyrase）和底物混合物（包括APS和 Luciferin）。
• 第2步：向反应体系中加入1种dNTP, 如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA 聚合酶的作用下，添加到测序引物的3‘末端，同时释放出一个分子的焦磷（PPi）。

HRM的主要原理是根据DNA序列的长度，GC 含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度达到对单个碱基差异的区分序列比对---引物设计--- DNA提取---荧光染料（EvaGreen 或LC green）PCR ---结果分析。
• 第3步：在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP;在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。
• 第4步：反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。
SNP与耐药性

随着抗生素的广泛应用，耐药现象普遍发生，院内感染发生率高，这为临床抗感染治疗带来了极大的困惑，比如结核菌耐药现象、由于细菌产生超广谱p．内酰胺酶(EsBLs)而对第三代 p内酰胺类抗生素的耐药现象。通过SNP方法，可筛选到耐药基因，然后进行针对性的用药，并由此开发出相应的新药，这对于提高疗效和控制其耐药性的发展有重要意义。
焦磷酸测序法 (Pyrosequencinq )

HRM

Applied Biosystems7500荧光定量PCR新应用HRM(高分辨率溶解曲线)的高通量基因突变扫描Enid M.ZhaoApplications Specialistcnmcbsupport@Contents●HRM应用的3个特点:●与常规SYBR Green溶解曲线功能相比,HRM的特点:原理熔解曲线7500Software v2.0●New look for the7500and7500Fast Systems with new,moreuser-friendly v2.0software andHRM*capability●Improvements to existing SDSv1.4workflows●Additional features includinggene expression study package ●Versatile interfaces to suitexperienced customers and new users*HRM–High Resolution Melting饱和性染料例如LC Green®Spectra vsSYBR®Green化学:纯荧光谱FAM dye Saturating Dye1 ROX dye SYBR Green dye2.仪器:HRM在溶解曲线阶段要求高捕获率Regular Dissociation High Resolution Dissociation Capture rate~0.2-0.5°C Capture rate~0.1-0.02°C3.HRM数据分析–荧光标准化和生成等位基因特定曲线的温度变化数据工作原理?杂合子样本融解曲线读取高分辨率溶解曲线标准溶解曲线●每个孔扩增产物有一个Tm值HRM图形HRM的发展特点和优势应用应用应用HRM on7500fastHRM on7500fast简便的操作流程简便的操作流程简便的操作流程简便的操作流程简便的操作流程简便的操作流程简便的操作流程简便的操作流程简便的操作流程7500fast HRM应用举例7500fast HRM应用举例Thanks for your attention cnmcbsupport@ 。

HRM技术

最新SNP检测方法！无与伦比！！SNP, 无与伦比, 检测高通量、低成本SNP、突变或甲基化检测方法——HRM技术应用HRM介绍高分辨熔解曲线分析（high-resolution melting analysis，HR）技术是近年国外兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。

基于高效稳健的PCR 技术，HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、HLA配型等的分析。

因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM 技术受到普遍关注。

HRM原理HRM的主要原理是根据DNA序列的长度，GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度达到对单个碱基差异的区分。

随着高精度PCR仪（LightCycler® 480和Rotor-Gene 6000）和饱和染料（LC Green、Eva Green等）的出现，HRM技术的普及使用成为可能。

HRM应用1.SNP（单核苷酸多态性）的筛查。

2.基因突变扫描，包括缺失、重复、点突变。

3.新突变的筛查。

4.甲基化的筛查。

5.遗传育种中特定突变的筛查、未知突变的发现。

6.HLA基因组配型、等位基因频率分析、物种鉴定、品种鉴定、甲基化研究。

7.法医学鉴定、亲子鉴定。

8.动植物品质相关多态性位点的研究等。

植物抗逆性，突变与性状关联性研究。

HRM特点高通量：1次可同时检测10-384样本，适合大样本、多SNP、多突变位点及多位点甲基化的扫描。

高敏度：肿瘤研究中低突变率样品基因突变检测，最低检测到0.1%的突变样品基因突变，即检测到1000个正常细胞中1个突变细胞，适用于手术和其它微量组织中突变检测。

检测灵敏性远高于“PCR+测序”的25%，即100个正常细胞中至少有25个突变细胞，测序仅适用手术组织。

HRM 技术优势与应用范围

HRM技术比较与适用领域目前突变/SNP的研究手段大致有三大类：1、以荧光共振能量传递为基础的检测方法，简单的说就是以定量PCR为基础的，比如我们很熟悉的Taqman探针法，以及经常提到的分子信标（Molecular beacon）和FRET（HybProbe），应用这一类方法时需要我们对突变位点或是多态性位点的背景很清楚，针对特定的突变位点或多态性位点设计并合成序列/位点特异性探针。

2、以分子杂交技术为基础的检测方法，如寡核苷酸连接分析（OLA）和动态等位基因特异性杂交（DASH），这几种方法也均涉及到序列特异性探针，合成荧光标记探针的费用昂贵，一般每个荧光标记探针价格为2000－3000人民币之间。

3、是基于PCR技术与其它方法相结合的检测方法，如变性-高效液相色谱（DHPLC）、SSCP（单链构象多态性）、DGGE（变性梯度凝胶电泳），这几种方法在PCR扩增的基础上对产物过柱分析，或电泳分析，无需合成序列特异性探针；第三类方法中还包括测序、Pyrosequencing和Ecotilling等技术。

此外还有芯片等技术可用于SNP分析。

第一类方法中最常用的技术为Taqman探针法，用于对特定位点SNP的检测，其显著特点是速度快，通量大。

第二类方法由于方法的可操作性及其它一些原因，一直没有得到普遍的应用。

第三类方法的显著特点是不受位点的局限，可对已知和未知突变/SNP 进行操作，但DHPLC仪器昂贵，使用成本高，SSCP和DGGE通量相对较小、操作繁琐、成本高、速度慢；测序是所有突变/SNP检测的金标准，但测序的成本相当可观；Pyrosequencing技术的突出优势在于Pooling，特别适用于大规模的等位基因频率分析，但需要特殊的仪器，硬件成本高；Ecotilling是一种在目标区段内筛查SNP的高通量、低成本的方法，但由于需要合成特定的红外引物，所以在样本量少、研究区段多的情况下就无法体现其优势。

高分辨率熔解曲线技术常用的仪器和荧光染料

高分辨率熔解曲线技术常用的仪器和荧光染料郭心灵;尤崇革【摘要】高分辨率熔解曲线技术(HRM)是近年来发展迅速的一项用于基因突变扫描与检测的新技术.由于具备快速、简便、价廉、高通量和闭管均相检测等优点,HRM已被广泛地应用于突变基因的扫描、基因分型、遗传配型以及法医学鉴定等领域,并受到越来越多的关注且发展迅速.本文就该技术常规应用时的相关仪器与荧光染料的发展及应用进行分析总结.【期刊名称】《分子诊断与治疗杂志》【年(卷),期】2012(004)001【总页数】4页(P50-53)【关键词】高分辨率熔解曲线技术;聚合酶链反应;荧光染料;PCR仪【作者】郭心灵;尤崇革【作者单位】兰州大学第二医院中心实验室,甘肃,兰州730030;兰州大学第二医院中心实验室,甘肃,兰州730030【正文语种】中文高分辨率熔解曲线技术（high resolution melting，HRM）是美国Utah大学Wittwer实验室在2003年首次提出的基于新型饱和荧光染料LC Green的发明而进行基因突变检测的新技术[1]。

其基本原理就是利用与荧光染料结合的双链DNA 在温度升高的过程中会发生减色效应的物理性质，通过检测双链DNA在熔解过程中释放的染料荧光信号所形成的特征熔解曲线，进行PCR产物中核苷酸差异的鉴别。

该技术的应用不仅需要饱和荧光染料，而且更需要能进行高分辨检测的定量PCR仪。

近年来用于HRM技术的仪器和染料都在不断更新，朝着操作简便化、试剂专业化的方向发展，在常规检测、疾病诊断、实验室研究、前沿问题研究等方面发挥着重要作用[2,3]。

目前HRM技术可用于基因突变扫描、遗传配型、细菌分型和多重基因分型等领域[4,5]。

本文就HRM技术的常规开展所需要的相关仪器与荧光染料进行综述。

1 HRM仪器常规定量PCR仪由于温控不够灵敏、分辨率不够高及其熔解曲线无法区分熔解温度上差异很小的序列（如单核苷酸多态性、单碱基插入/缺失等），所以不能用于HRM分析。

qPCR之HRM技术原理及应用

qPCR之HRM技术原理和应用黄宝福HRM•High resolution melting curve高分辨率熔解曲线•HRM的主要原理是根据DNA序列的长度、GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。

•高通量一次可同时检测多个样本•高灵敏度HRM可以检测SNP•重复性好PCR产物无需后续处理，实现闭管操作，避免交叉污染•操作简便只需设计PCR引物，进行PCR反应，无需特异性探针和荧光标记，不受突变碱基位点与类型限制•成本低相比传统SNP/突变分析法和定量探针法，简化了操作时间和步骤，降低了使用成本•适用范围广可用于各种领域和不同标本•其它只检测PCR样品中的荧光强度变化，不消耗任何PCR样品，无污染，PCR产物可以用于下游分析，非常适合于测序前的SNP预扫描筛查•基因的突变扫描检测杂合子SNP区段/碱基缺失前后重复杂合子缺失•HLA基因组配型器官移植HLA配型同胞之间HLA基因型确定•等位基因频率分析SNP频率分析•物种、品种鉴定微生物品种物种快速鉴定动植物品种鉴定•甲基化研究甲基化位点筛查，甲基化程度分析•法医学鉴定法医学SNP、DIP鉴定基因突变-HRM检测•基因突变是指由于DNA碱基对的置换、增添或缺失而引起的基因结构的变化•基因突变是普遍存在的，是生物变异的主要原因，是生物进化的主要因素•但大多数基因突变对生物体是有害的如绝大多数人类遗传病（人的色盲、糖尿病、白化病等）都是突变性状，是由基因突变造成基因突变-传统检测技术•荧光共振能量传递为基础的检测方法Taqman探针分子信标(Molecular Beacon)FRET（Hybprobe)•分子杂交寡核苷酸连接分析（OLA）动态等位基因特异杂交（DASH）•PCR技术与其它方法结合变性-高效液相色谱（DHPLC）测序芯片基因突变-HRM检测原理•在一定温度范围内将PCR扩增产物进行变性并实时检测荧光信号,荧光值随温度变化即熔解曲线•每一段DNA都有其独特序列，因而也有其独特的熔解曲线形状，如同DNA指纹图谱一样，具有很高的特异性、稳定性和重复性•KRAS基因（K-ras,p21）检测是目前医生了解大肠癌患者癌基因状况最直接、最有效的方法，通过检测不仅可以深入了解癌基因的情况，更重要的是筛选出针对抗表皮生长因子受体靶向药物治疗有效的大肠癌患者，帮助医生选择对肿瘤病人最有效的治疗方法KRASEmma Borràs et al., BMC Cancer 2011, 11:406•MYH基因相关性息肉病(MAP)归属于家族性腺瘤性息肉病(FAP),是一种与MYH基因突变有关的常染色体隐性遗传病。

HRM的应用

高分辨率熔解曲线（HRM ）的应用1.引言高分辨率熔解曲线分析技术（High Resolution Melting ，HRM ），是由美国犹他大学病理学部Carl Wittwer 实验室与美国Idaho 公司于2003年共同合作开发出来的一项新技术，并于2006成功生产出世界上第一台商品化的HRM 仪器HR-1[1,2] ，美国Idaho 公司独家拥有该HRM 专利，专利号： 2005-02333335 (Nucleic and Melting Analysis with Saturation Dyes) 和 2006-0019253, (Amplicon Melting Analysis with Saturation dyes)。

HRM 技术因其速度快，操作简便，高通量，灵敏性、特异性高，对样品无污染等优点而被迅速的应用在生命科学、医学、农学、畜牧业等领域的研究工作中。

2.HRM 的原理及操作流程2.1 HRM 的原理HRM 技术的基本原理主要是基于核酸分子物理性质的不同开发出来的。

不同核酸分子GC 含量，GC 分布等是不同的，因此双链 DNA 分子在加热变性时会有自己熔解曲线的形状和位置。

HRM 技术的原理就是根据核酸分子熔解温度和熔解形状的不同来区分样品。

在PCR 反应时引入饱和的荧光染料LC Green ，荧光染料在PCR 扩增的过程中被嵌入到DNA 双链中。

当嵌有染料的DNA 分子解链的时候，仪器对荧光信号进行采集，绘制出DNA 分子的熔解曲线。

DNA 分子的熔解曲线与DNA 分子的GC 含量，GC 分布，片段长度等性质有关，不同的样品由于碱基作用力的不同呈现出不同的熔解曲线形状及熔解温度(Tm 值)[3]。

图1 LightScanner 突变检测原理Tube 1Tube 2Tube 3Wild type Homozygote Heterozygote以二倍体细胞为例，当纯合子样品通过PCR扩增，经过变性复性后，仍然是纯合子，如图1（Tube1和Tube2）。

hrm高分辨率溶解曲线

hrm高分辨率溶解曲线
HRM高分辨率溶解曲线是一种用于分析DNA序列变异的技术。

它通过在PCR反应中加入特异性引物和荧光染料，对PCR产物进行实时监测，从而获得高分辨率的溶解曲线。

HRM高分辨率溶解曲线具有高灵敏度、高分辨率和高通量等优点，可以用于检测DNA序列的变异、基因多态性、SNP等。

它不仅可以用于科研领域，还可以应用于临床诊断、生物信息学等领域。

HRM高分辨率溶解曲线的原理是利用PCR产物在变性过程中，双链DNA会逐渐解离成单链DNA，这个过程伴随着温度升高。

当温度升高到一定程度时，引物和模板之间的结合力会减弱，导致引物和模板之间的解离。

这个过程可以通过实时监测PCR产物的荧光信号变化来获得溶解曲线。

HRM高分辨率溶解曲线的应用非常广泛，例如在遗传疾病诊断、基因多态性分析、SNP筛查等领域都有应用。

在遗传疾病诊断中，HRM高分辨率溶解曲线可以用于检测基因突变或缺失，帮助医生更准确地诊断疾病。

在基因多态性分析中，HRM高分辨率溶解曲线可以用于研究不同人群或种群之间的基因变异情况。

在SNP筛查中，HRM高分辨率溶解曲线可以用于快速检测大量的SNP位点，帮助研究人员更全面地了解基因变异情况。

总之，HRM高分辨率溶解曲线是一种非常有用的技术，可以用于分析DNA序列变
异、基因多态性、SNP等。

它的应用非常广泛，可以为科研、临床诊断、生物信息学等领域提供有力的支持。

生物信息学中的高通量基因测序数据分析与挖掘技术研究

生物信息学中的高通量基因测序数据分析与挖掘技术研究随着基因测序技术的发展，大规模的高通量基因测序数据正在迅速增加。

这些海量数据提供了一个宝贵的资源，可以用于了解生物的基因组结构、功能和演化等方面的信息。

为了从这些数据中获取有效的信息，生物信息学中的高通量基因测序数据分析和挖掘技术起到了关键的作用。

高通量基因测序技术是一种高效、高通量的测序方法，可以在较短的时间内获得大量的DNA或RNA序列信息。

这种技术的出现大大加速了生物学研究的进展，也为生物信息学研究提供了大量的数据。

高通量基因测序数据分析的主要目标是从原始的测序数据中提取出有用的信息，包括基因组的组装、基因功能注释、SNP(Single Nucleotide Polymorphism)的检测等。

基于高通量测序技术的数据，研究人员可以更好地理解生物体的基因组结构和功能。

高通量基因测序数据分析的第一步是质量控制。

由于测序过程中存在一定的误差，需要对测序数据进行质量评估和处理。

常用的质量控制方法包括去除低质量的测序数据、去除测序接头和引物等。

在数据质量控制后，研究人员可以进行下一步的数据分析。

第二步是基因组的组装。

基因组组装是将测序数据拼接成较长的连续序列，以还原生物的基因组结构。

对于无参考基因组的组装，采用de novo序列组装方法，通过对大量的短读长序列进行拼接，得到较长的序列。

对于已有参考基因组的组装，采用基于参考序列的对齐方法，通过将测序数据与参考序列进行比对，填充空缺以获得更完整的序列。

基因组组装的主要挑战是解决序列重复和大规模基因组的组装难题。

第三步是基因功能注释。

基因功能注释是将基因组序列和基因之间的功能关联进行分析和注释的过程。

常见的功能注释包括基因的功能类型、基因的表达水平和调控因子等。

通过对测序数据进行基因功能注释，可以帮助研究人员理解基因的功能和相互关系。

第四步是SNP(Single Nucleotide Polymorphism)的检测。

hrm高分辨率溶解曲线

hrm高分辨率溶解曲线高分辨率溶解曲线（High-resolution Melting，简称HRM）是一种基于PCR技术的高灵敏度、快速检测和基因分型等应用的新兴方法。

它通过对PCR产物进行高温梯度退火，利用DNA序列中的单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，简称SNP）或突变等，可以对不同的DNA样本进行鉴别和分类。

HRM技术的原理是利用DNA双链在高温梯度环境下的失配特性。

在PCR反应中，经过一定的循环扩增过程，得到目标序列的大量复制品。

然后，通过控制扩增产物的温度、缓慢升温，逐渐增加其中的失配碱基数目，最终使DNA双链断裂解离。

同时，加入一种特定的DNA染料（例如SYBR Green），该染料能够与双链DNA结合并发光。

当溶解曲线进行扫描时，溶解温度越高，样品中的双链DNA越容易解离，染料释放的荧光信号越强。

而当双链DNA中存在SNP或突变时，会引起其中某一个区域的碱基配对发生改变，导致产物的熔解曲线发生改变。

根据熔解曲线的形状、峰型、峰面积等特征，可以判断样品中的SNP型态或突变类型，并进行分类鉴别。

HRM技术具有多个优点。

首先，HRM技术不需要引入特异性的探针或标记物，减少了实验操作的复杂性和成本。

其次，HRM技术具有高度灵敏性和准确性，能够鉴别并区分出少量变异的DNA样品，并且对于SNP的鉴定准确度高。

此外，HRM技术具有高通量、快速、操作简单等特点，适用于大规模基因分型和突变检测等实验。

HRM技术在药物研发、医学诊断和遗传学研究等领域有着广泛的应用。

例如，在药物研发中，可以通过HRM技术对候选靶点进行筛选，评估药物的安全性和有效性。

在医学诊断中，HRM技术可以应用于肿瘤的分型和突变检测，早期发现和预测疾病的风险。

在遗传学研究中，HRM技术可以用于亲子鉴定、人群遗传学调查和基因组学研究等方面。

尽管HRM技术具有许多优点和应用前景，但也存在一些局限性。

高通量、低成本SNP、突变或甲基化检测方法—HRM 技术应用

HRM 介绍HRM 技术是high-resolution melting analysis 即高分辨熔解曲线分析技术，是近年国外兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。

基于高效稳健的PCR 技术，HRM 不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR 结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、HLA 配型等的分析。

因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM 技术受到普遍关注。

HRM 原理HRM 的主要原理是根据DNA 序列的长度，GC 含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度达到对单个碱基差异的区分。

随着高精度PCR 仪（LightCycler® 480 和Rotor-Gene 6000 ）和饱和染料（LC Green 、Eva Green 等）的出现，HRM 技术的普及使用成为可能。

HRM 应用• SNP（单核苷酸多态性）的筛查。

•基因突变扫描，包括缺失、重复、点突变。

•新突变的筛查。

•甲基化的筛查。

•遗传育种中特定突变的筛查、未知突变的发现。

• HLA 基因组配型、等位基因频率分析、物种鉴定、品种鉴定、甲基化研究。

•法医学鉴定、亲子鉴定。

•动植物品质相关多态性位点的研究等。

植物抗逆性，突变与性状关联性研究。

HRM 特点•高通量：1 次可同时检测10-384 样本，适合大样本、多SNP、多突变位点及多位点甲基化的扫描。

•高敏度：肿瘤研究中低突变率样品基因突变检测，最低检测到0.1%的突变样品基因突变，即检测到1000 个正常细胞中1 个突变细胞，适用于手术和其它微量组织中突变检测。

检测灵敏性远高于“PCR+测序”的25% ，即100 个正常细胞中至少有25 个突变细胞，测序仅适用手术组织。

•特异性好：PCR 产物无需后续处理，特异性高达100% 。

Bar-HRM技术在人参和西洋参药材鉴定中的应用研究

Bar-HRM技术在人参和西洋参药材鉴定中的应用研究王志科;鲁放;熊超;孙伟;薛建平【摘要】目的:采用高分辨率熔解曲线技术(HRM),应用ITS2序列对人参和西洋参药材进行快速鉴别,为规范市场药材管理提供一个新的分子检测手段.方法:收集人参、西洋参以及购买人参商品粉末药材,提取DNA,选择ITS2作为鉴别序列.在HRM-PCR条件下,建立人参和西洋参的标准高分辨熔解曲线、熔解曲线模型并确定Tm 值;应用该方法检测市场随机收集的10份人参商品.结果:通过比较分析,人参和西洋参能够很好的区分开,10份人参商品粉末的高分辨熔解曲线、熔解曲线的峰形和Tm值均与人参相吻合,初步说明这10份人参商品都含有人参.进而将其PCR产物测序,以验证该结果.结论:Bar-HRM方法可简单、快速、高通量化和可视化的实现人参商品粉末药材的快速检测.【期刊名称】《世界科学技术-中医药现代化》【年(卷),期】2016(018)002【总页数】5页(P191-195)【关键词】高分辨熔解曲线;ITS2;人参;西洋参;分子鉴定;快速检测【作者】王志科;鲁放;熊超;孙伟;薛建平【作者单位】淮北师范大学生命科学学院淮北235000;中国中医科学院中药研究所北京100700;淮北师范大学生命科学学院淮北235000;中国中医科学院中药研究所北京100700;中国中医科学院中药研究所北京100700;中国中医科学院中药研究所北京100700;淮北师范大学生命科学学院淮北235000【正文语种】中文【中图分类】R282.5人参（Panax ginseng C. A. Meyer）和西洋参（P. quinquefolium Linn）均为五加科人参属植物的干燥根[1,2]，皆系名贵药材，因补虚疗效显著，临床应用日趋广泛。

人参大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津、安神；西洋参补气养精、清热生津[3]。

二者的性状非常相似，市售粉末商品存在混伪[4]；并且在粉末状态下，用传统的形态、分类学鉴定方法，很难将其性状区分开[5]。

结核分枝杆菌耐异烟肼突变基因及分子检测方法研究进展

结核分枝杆菌耐异烟肼突变基因及分子检测方法研究进展李芊璘;冯福民;戴二黑【摘要】结核病是一种慢性感染性疾病.我国作为结核病的高负担国家,其高发率已成为严峻的公共卫生问题.异烟肼作为治疗结核病的重要一线药物之一,由于其治疗管理不规范等原因导致临床患者耐药日益严重.目前已知异烟肼最主要的耐药机制是基因突变,如何准确有效地检出耐药基因,是控制结核病的关键.本文从分子角度分别阐述了异烟肼常见耐药基因katG、inhA、ndh、ahpC、oxyR,以及罕见突变基因kasA、sigI、furA、mabA、iniABC、efpA,并针对其检测方法作了概述.%Tuberculosis is a chronic infection caused by Mycobacterium tuberculosis. The high financial burden and high incidence rate of tuberculosis have become a critical public health problem in China. Isoniazid, as one of the important first-line drugs in the treatment of clinical patients, drug resistance is becoming increasingly serious because of the lack of standard treatment. At present, the main mechanism of isoniazid resistance is known as gene mutation. How to detect drug resistance gene effectively and accurately is the key to control tuberculosis. In this article, we analyzed the frequent genes (katG, inhA, ndh, ahpC and oxyR) and novel genes (kasA, sigI, furA, mabA, iniABC and efpA) from the perspective of molecular biology, and summarized their diagnostic methods.【期刊名称】《天津医药》【年(卷),期】2017(045)012【总页数】4页(P1341-1344)【关键词】分枝杆菌,结核;异烟肼;耐药基因;分子检测;综述【作者】李芊璘;冯福民;戴二黑【作者单位】华北理工大学公共卫生学院 063210;华北理工大学公共卫生学院063210;华北理工大学附属石家庄市第五医院【正文语种】中文【中图分类】R378.91+1结核病（TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的一种具有潜在致命性的慢性传染病，其中以肺结核最为常见。

HRM应用实验设计及结果分析

随Taq酶
Invitrogene, NEB等
SYTO 9
(Invitrogen)
EvaGreen
(Biotium)
LC Green
(Idaho Technology)
试剂的处理与保存条件
Reagent Taq DNA polymerase 10X PCR Buffer 50 mM MgCl2 100 mM dATP Solution Storage Temp. –20oC –20oC 18–24oC –20oC Storage State Not Critical Not Critical Not Critical Not Critical
荧光定量PCR应用
——高分辨率溶解曲线（HRM）
CMK Robert Wang 2011-11-07
内容

一、背景介绍二、实验设计三、反应体系四、结果分析
一、背景介绍
HRM分析技术

高分辨率熔解（High Resolution Melting，HRM）分析技术是基于核酸的物理性质，通过饱和的插入染料监控DNA熔解曲线变化而进行分析的一种技术。
HRM应用

1. 突变发现/筛查/扫描 2. SNP 基因分型/等位基因区分 3. 物种鉴定 4. 表观遗传学/DNA甲基化 5. 微卫星分析
二、实验设计
HRM的本质
成功的HRM分析的先决条件

分析小片段DNA 分析纯度单一的产物

使用足够的PCR的模板
检查扩增曲线是否异常
所需的试剂与耗材

试剂
热启动Taq Platinum® Taq DNA polymerase

hrm高分辨率溶解曲线

hrm高分辨率溶解曲线高分辨率溶解曲线（High-resolution melting curve）是一种广泛应用于基因分型、突变检测和SNP分析等领域的检测技术。

其基本原理是利用荧光染料与DNA双链结合，随着温度的升高，DNA双链会逐渐解旋，导致荧光强度的变化。

通过检测荧光信号的变化，可以获得一条关于温度的曲线，称为溶解曲线。

高分辨率溶解曲线分析的优势在于其高灵敏度和高分辨率。

它可以快速、准确地检测出不同DNA序列之间的差异，甚至能够区分相似度达到99.99%的DNA序列。

这使得高分辨率溶解曲线成为一种非常重要的基因分型和突变检测技术。

高分辨率溶解曲线的操作相对简单，通常包括以下几个步骤：1.样品准备：从生物样本中提取DNA，并进行纯化和扩增，以获得足够的DNA量。

2. PCR扩增：选择适当的引物，进行PCR反应，扩增目标DNA片段。

3.荧光染料加入：在PCR反应结束时，将荧光染料加入PCR体系中。

荧光染料可以与双链DNA结合，从而产生荧光信号。

4.温度梯度扫描：利用PCR仪器进行温度梯度扫描。

通过逐渐升高温度，将DNA片段逐渐解旋，并观察荧光信号的变化。

5.数据分析：通过对荧光信号进行分析，可以得到一条溶解曲线。

根据曲线的形状和荧光峰值的位置，可以判断样品中的DNA序列。

高分辨率溶解曲线的分析可以被广泛应用于许多领域，例如基因分型、突变检测、SNP分析等。

在基因分型中，通过对多个基因位点的高分辨率溶解曲线进行分析，可以确定个体的基因型。

在突变检测中，溶解曲线的形状和荧光峰值的位置可以指示是否存在DNA序列的突变。

而SNP分析则是通过溶解曲线的变化来检测单核苷酸多态性。

除了上述应用之外，高分辨率溶解曲线还可以被用于测定DNA的荧光特性和结构特点。

通过观察溶解曲线的形状和荧光峰值的位置，可以获得DNA的熔解温度、熔解曲线宽度等信息，进而了解DNA序列的稳定性和结构特点。

总之，高分辨率溶解曲线是一种重要的基因分型和突变检测技术。

高分辨率熔解曲线分析:一种新的用于遗传病基因突变筛查的技术

高分辨率熔解曲线分析：一种新的用于遗传病基因突变筛查的技术李东至【摘要】@@ 目前,DNA碱基变异如突变或单核苷酸多态性(single nucleotide polymorplaism,SNP)的检测方法有2种:一是针对特定的位点合成序列特异性探针,如Taqman探针法、位点特异寡核苷酸分析、反向斑点杂交及基因芯片等,用于检测已知突变;二是以核酸的物理性质为基础的检测方法,如变性一高效液相层析、单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、温度梯度凝胶电泳及构象敏感凝胶电泳等,此类方法可用作突变筛查,但无法明确突变性质.【期刊名称】《中国产前诊断杂志（电子版）》【年(卷),期】2011(003)002【总页数】3页(P1-3)【作者】李东至【作者单位】广州市妇女儿童医疗中心,产前诊断中心,广东,广州,510623【正文语种】中文目前，DNA碱基变异如突变或单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）的检测方法有2种：一是针对特定的位点合成序列特异性探针，如Taqman探针法、位点特异寡核苷酸分析、反向斑点杂交及基因芯片等，用于检测已知突变；二是以核酸的物理性质为基础的检测方法，如变性-高效液相层析、单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、温度梯度凝胶电泳及构象敏感凝胶电泳等，此类方法可用作突变筛查，但无法明确突变性质。

这2种方法在应用上有其局限性，如成本高、操作繁琐、耗时、以及相对低通量。

DNA测序是突变／SNP检测的金标准，但不适于大规模突变筛查和流行病学研究。

2002年犹他大学和爱德华科技公司合作开发出突变／SNP检测分析的一项新技术—高分辨率熔解曲线分析（high resolution melting，HRM）［1］。

这种技术不受突变碱基位点与类型的限制，可同时对扩增片段进行未知突变扫描和已知突变的基因分型。

因其操作简便、快速、高通量、低成本和真正实现了闭管操作而受到普遍的关注，成为近年来兴起的一种高通量突变扫描和基因分型技术。

各种药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术优缺点及适用性比较

各种药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术优缺点及适用性比较方法优点缺点适用性AS-PCR灵敏度高，适于对肿瘤组织中突变比例较低的体细胞突变进行检测。

通量低对小样本、低突变比例的体细胞突变进行检测。

实时荧光PCR通量较高，操作简单，仪器设备易普及。

探针较昂贵对相同位点、大样本标本进行检测，可用于mRNA表达检测。

焦磷酸测序高通量，高灵敏度，可以检测插入/缺失突变和未知突变。

等位基因含量的比例可用于室内质控。

需要特殊仪器设备。

适合于较大样本、突变比例高于5％的各种类型SNP检测、甲基化位点的确定。

HRM成本低，灵敏度高，闭管操作，降低污染风险。

需要特殊仪器设备，条件摸索过程较为困难适合有该类机器的实验室开展各种类型SNP分型研究；可用于已知甲基化位点的检测。

Sanger法测序直接获取序列，分型的金标准，通量低，不能检测突变比例小于各种SNP的检测，未知突变的筛查以及验证其可发现未知突变。

20％的SNP。

他分型的结果。

PCR-RFLP无需特殊的仪器设备，成本较低，实验过程简单，可操作性强。

通量低，只适用于部分SNP分型适用于无条件够买贵重仪器设备的实验室开展小样本的分型检测。

基因芯片法通量高灵活度低，成本高，需要特殊的仪器设备。

适用于具备芯片检测能力的实验室对已知固定位点、大样本标本进行检测。

原位杂交（ISH）在细胞核原位对基因的异常进行检测成本高，通量低，时间较长。

适于对基因扩增和缺失异常进行检测。