犬骨骼肌成肌细胞体外分离纯化及培养方法改良探索

犬骨骼肌成肌细胞体外分离、纯化及培

养方法改良探索

（作者：_________ 单位：__________ 邮编：____________ ）

作者：苏冠华,刘启云，卢永昕，米少华，孙雨霏，刘晓明，帅欣欣

【摘要】目的：探讨犬骨骼肌成肌细胞（SkMS体外分离、纯

化及培养方法的改良并研究其生物学特性。方法：采用机械分离结合H 型胶原酶、中性蛋白酶双酶一步消化法分离犬骨骼肌成肌细胞，经差速贴壁法纯化后，在骨骼肌细胞生长培养基（SKGM中进行原代和传代培养，免疫细胞化学染色鉴定。结果：改良后的培养方法适于获取犬骨骼肌成肌细胞，SKGM培养基适于犬骨骼肌成肌细胞的体外培养。SkMs在细胞密集或低血清分化培养基作用下可融合成肌管。结蛋白（desmin）单克隆抗体（mAb细胞化学染色鉴定SkMs呈阳性，纯度在90%以上。结论：通过改良后的双酶一步消化法获得的SkMs 在合适的培养条件下能够增殖、分化并保持其生物学特性，为其在

基因治疗和组织工程中的应用奠定了基础。

【关键词】犬；骨骼肌成肌细胞；细胞培养；生物学特性

1961年，Mauro等首次在蛙骨骼肌中发现了具有自我更新和分化形成肌纤维能力的肌卫星细胞(muscle satellite cells )。从骨骼

肌中分离获得的肌卫星细胞在体外分离培养时被统称为骨骼肌成肌

细胞(skeletal myoblasts, SkMs)。来源于骨骼肌的成肌细胞具有取

材方便、免疫源性低、植入后容易与宿主的肌纤维融合、体外培养条件下较易被携带外源基因的病毒转染、转染外源基因的成肌细

胞可释放重组蛋白到局部或体循环中等优点[1]。因此，成肌细胞被广泛应用于基因治疗和组织工程方面的实验研究。本研究以获取基因

治疗载体SkMs为目的，探讨建立简便、经济的成肌细胞分离、纯化及培养方法。

1材料和方法

1.1材料

实验犬由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。中性蛋白酶购自美国Roche公司，H型胶原酶、结蛋白(desmin)单克隆抗体(mAb 购自美国Sigma公司；SKBM培养基和SKGM Bullet Kit 购自美国Lonza公司；亲和素拟生物素拟过氧化物复合物法

(avid in拟biotin complex, ABC )免疫组化试剂盒购自美国Vector 公司,DAB显色试剂盒购自武汉博士德公司；胰蛋白酶、DMEM M199培养基购自美国Hyclone公司；胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS ,小牛血清购自美国Gibco公司。

1.2方法

1.2.1 SkMs的原代培养

完全生长培养基70SKGM各成分按以下比例SKGM DMEM FBS= 70 : 25 : 5配制。无菌全麻下自5〜8 kg左右杂种犬股四头肌取3〜5 g 肌肉，将其移入盛有PBS勺90 mm培养皿中剔除筋膜、脂肪、肌

腱和血管组织后剪为碎糜状，将组织块移入盛有约30 mL的4 g/L中性蛋白酶和1 g/L H型胶原酶混合消化酶溶液的100 mL玻璃瓶中，37C恒温摇床60 r/min, 1 h 。然后吸取9 mL上清液经孔径75卩m 的不锈钢网筛（200 目）过滤到10 mL玻璃离心管中，再加入1 mLFBS 中和，1 000 r/min, 离心5 min,弃上清。力口70SKGM培养基重悬细胞沉淀，种入明胶预包被的培养瓶。再加入双酶溶液重复消化上述剩余的组织块，反复3〜4次。计数、台盼蓝染色确认细胞成活率。2 d 后换液，以后每2〜3 d换液1次，在倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况。

1.2.2 SkMs的传代培养及纯化

倒置显微镜下观察细胞生长情况，当细胞生长到培养瓶面积的

70%〜80%寸,以2.5 g/L胰蛋白酶+ 0.2 g/L EDTA混合溶液消化，中止消化后离心，重悬细胞后将细胞悬液接种另一培养瓶，静置于培养箱内约8〜10 min后取出，轻轻晃动培养瓶，动员未贴壁的细胞，吸出培养液接种另一培养瓶，反复差速3次。最后按1 : 2或1 : 3比例进行传代，每2〜3 d换液1次。4 g/L台盼蓝染色确认细胞成活率。

1.2.3 SkMs细胞生长曲线测定

取处于对数生长期的细胞，用上述EDTA胰酶溶液消化后制成

单细胞悬液，细胞计数后以5X 103细胞/孔接种于24孔板，共

接种8组，每组3孔，每天取一组细胞进行计数，计算平均

值，连续8 d,绘成细胞生长曲线。未计数孔细胞每2〜3 d换液

1次。

124 SkMs的诱导分化

取培养至第2〜3代的细胞，消化后以1X105细胞/孔接种于放有盖玻片的6孔培养板中，加入生长培养基进行培养，待细胞分裂、增殖至70%〜80%匚合后，加入分化培养基（含200 mL/L FBS的M199 培养基）继续培养，倒置显微镜下观察细胞生长及分化情况。

1.2.5 SkMs的免疫细胞化学染色

将细胞接种于有盖玻片的6孔板，待长至培养面积的80%取盖玻片。40 g/L多聚甲醛固定后，以ABC法行免疫化学染色，以鼠抗desmin mAb为一抗，DAB显色。

1.2.6差速贴壁组与非差速贴壁组纯化所得细胞desmin阳性数

比较

取等量的第2代细胞悬液种于25 cm2培养瓶，差速贴壁纯化组与非差速贴壁组各2瓶，制作细胞爬片行desmin免疫化学染色。每组取4片，每片随机取5个视野进行采样，以Olympus BX50显微摄像系统进行阳性细胞计数，所得数据以x 2检验进行统计学处理。

2结果

2.1 SkMs体外培养的生物学特点

经酶消化分离出的成肌细胞为圆形小亮点，悬浮于培养液中。有活力的细胞能够在48 h内完全贴壁，变扁并向四周伸展而成为一梭形或纺锤形细胞，有折光性（图1A）。约3~4 d后进入对数生长期（图1B）, 6〜7 d后因接触抑制生长速度减慢。细胞增多后逐渐按一定方向呈有序排列。

2.2骨骼肌成肌细胞体外培养的鉴定

221多核肌管形成

在体外培养的成肌细胞当细胞密集或改变培养基中的血清浓度时，可清楚地观察到长轴方向胞质融合后形成多核肌管（图2）。

2.2.2 desmi n细胞免疫化学染色

差速纯化后培养的成肌细胞经desmin进行免疫化学染色（DAB 显色），成肌细胞胞质呈阳性反应，细胞核外周及胞质呈棕黄色，表明培养的细胞为成肌细胞（图3）。多核肌管呈强阳性。

2.3成肌细胞生长活性测定和生长曲线的绘制

原代细胞进行台盼兰染色，结果发现97%以上的细胞均不着色，表明本实验方法培养的细胞存活率高。细胞连续计数所绘制的成肌细胞生长曲线显示：细胞在培养的3〜5 d增殖达高峰，5〜7 d后基本达生长平台期。

2.4成肌细胞的差速纯化

将差速贴壁组与非差速贴壁组纯化所得细胞进行desmin免疫化学染色，发现两组阳性细胞数有显著差异，经计算得x 2值为5.47, P0.05为具有统计学意义。