肺成纤维细胞分离

【摘要】目的：建立一套可靠的鼠肺细胞分离、纯化和培养技术,用于体外研究间质性肺病的发病机制及治疗方法。方法：采用胰酶消化出生后2 d SD大鼠肺组织块及SD大鼠肺泡灌洗液, 经差时贴壁法, 分离、纯化红皮鼠肺成纤维细胞(lung fibroblast, LF)和SD大鼠肺泡巨噬细胞（pulmonary alveolar macrophage,AM）, 并进行原代培养。用波形蛋白(Vimentin)、CD14细胞免疫荧光染色、蛋白质印迹和电镜对所分离的细胞进行鉴定。结果：所得细胞产量大、纯度高。细胞免疫荧光染色LF细胞波形蛋白染色阳性而CD14染色阴性；AM细胞则相反。扫描电镜观察可见肺成纤维细胞有微绒毛，细胞间连接成网状，蛋白质印迹结果显示波形蛋白表达。结论：该方法是一种可靠的红皮鼠肺成纤维细胞及大鼠肺巨噬细胞的分离纯化培养技术, 可用于间质性肺病（interstitial lung disease, ILD）的发病机制及治疗方法的体外研究。

【关键词】大鼠; 肺成纤维细胞; 巨噬细胞; 原代细胞培养

［基金项目］江苏省高校自然科学研究计划项目（03KJD320076）;镇江市社会发展科技计划项目（SH2004043）

Isolation and purification and primary culture of lung cells from rats

Y AN Yu-lan, LIU Yang, BU Xue-feng, ZHANG Zhi-jian, ZHENG Jin-xu

(Department of Respiratory Medicine, the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212002; School of Medicine，Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212013,China)

［Abstract］Objective: To develope a reliable method for isolation, purification and primary culture of lung fibroblast(LF) and pulmonary alveolar macrophage(AM) from rat for studies on pathogenesis and treatment of interstitial lung disease in vitro. Methods：The lung tissue of 2 days old immature rats was digested with trypsin.LFs and AMs were isolated and purified, then cultured. The nature of the cultures was identified by CD14 staining, vimentin staining, electron micrography and Western blot. Results：Excellent yields of highly purified, culturable AMs and LFs could be obtained from adult rats and 2 day babyish rat lungs,respectively. The expression of CD14 in AMs was positive and that of vimentin negative by immunofluorescence chemistry. Those, however, in LFs were just opposite. Ramified stracture between purified LFs were observed by ultrastructural examination under electron micrography.Vimentin in purified LFs was revealed by Western blot. Conclusion：This technique might be a reliable method for isolation and purification and primary culture of pulmonary alveolar macrophages and lung fibroblasts from rat lung and could be used for the study of interstitial lung disease

［Key words］lung fibroblasts; immature rat; pulmonary alveolar macrophage; primary cell culture

原代培养又称初代培养, 是自供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。原代培养的细胞来源于刚刚离体的组织和细胞, 其生物学特性未发生很大变化, 仍具有二倍体遗传特征, 最接近和反映体内生长特性, 对研究细胞的生长、分化、代谢及其生理、病理变化的机制具

有极其重要的价值, 还适宜行药物干预、细胞分化等实验研究。但原代培养的组织由多种细胞成分组成, 分离、纯化技术难度大, 培养条件相对要求高。红皮鼠即出生后2～3 d鼠，肺组织主要由肺上皮细胞和肺成纤维细胞(lung fibro blast,LF) 组成；肺泡灌洗液主要为肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage,AM)，因此红皮鼠肺成纤维细胞及成鼠肺泡巨噬细胞的分离、纯化和原代培养对体外研究间质性肺部疾病至关重要。本研究参照姜明等［1 ］的方法, 成功地分离、纯化并培养出了鼠肺泡巨噬细胞和肺成纤维细胞。

1 材料与方法

1.1 材料

新生2 d SD 红皮鼠;DMEM培养液(低糖型, Gibco，美国), 胎牛血清(Gibco，美国), 胰蛋白酶（Gibco，美国); 培养瓶、24孔培养板及圆玻片(购于Nuclon公司)。

1.2 方法

1.2.1 培养液的配制配制DMEM，再加入终浓度100 ml/L 胎牛血清(FCS) 和100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素；用PBS 配制成0.1%胰蛋白酶, 再加入终浓度0.02%EDTA, 过滤除菌。

1.2.2 取材将新生2 d 的SD红皮鼠,用75%乙醇浸泡消毒5 min, 窒息处死，剪开胸腔,取出肺组织浸泡于PBS中备用;SD大鼠(250 g)腹腔内注射3%戊巴比妥0.2～0.3 ml /100g 麻醉，气管切开，置入直径2 mm的塑料管，用4 ℃生理盐水5 ml进行灌洗，每次抽洗3次，共6次灌洗，1 500 r/min 4 ℃离心10 min，弃上清，沉淀置10%FCS DMEM培养液中。

1.2.3 原代培养将取出的肺组织用PBS冲洗以洗去血液。用组织剪去除其表面的胸膜, 修剪其周边，PBS轻轻混悬，待组织块自然沉降后吸弃上清, 重复3～4 次至上清清亮,后剪成1mm×1mm×1mm 大小的组织块, 用0.1%胰酶(37℃预温)将组织块洗1遍, 按照每只幼鼠1ml加入0.1%胰酶, 37℃消化15～20 min, 大部分组织块被消化为细胞悬液, 加入与消化液等量的含10%FCS 的DMEM终止消化, 用吸管充分吹打均匀,1 500 r/min离心5 min, 弃除上清,较均匀地接种在50 ml玻璃培养瓶上,轻轻地加入上述DMEM培养液约0.5 ml, 在37 ℃含5% CO2培养箱培养过夜后, 次日加入2 ml培养液继续培养；将上述SD大鼠的肺泡灌洗液沉淀接种在50 ml玻璃培养瓶中,采用差时贴壁法，即先在37℃含5% CO2培养箱培养2.5～3 h,PBS洗涤未贴壁细胞，加37℃2.5 g/L 胰蛋白酶消化10 min，调整细胞浓度为(1.5～2.0)×106/ml, 然后移入带圆玻片24孔培养板上继续培养。

1.2.4 传代培养成纤维细胞的原代细胞培养5～7 d 后,细胞汇合成单层。用PBS洗2遍后加2.5 g/L37℃胰蛋白酶消化2 min。可见细胞连接松弛,此时加入等体积的含血清培养液终止消化,吸管轻轻吹打使细胞脱落并混匀。1 000 r/min, 离心6 min。弃上清,加入2 ml新的培养液,轻轻吹打混匀,显微镜下计数,以(2～3)×107/L 接种到25 ml塑料瓶中,37℃,5%CO2孵箱培养,每3～4天换液1次，如细胞纯度不够，可采用差时贴壁法，LF 贴壁速度快, 仅需20 min 左右,首先吸附在瓶壁上, 经过2～3 次贴壁选择后, 贴附的是纯的LF, 然后将第3代在带圆玻片的24孔培养板上进行培养，复孔3个。