尹 明----胎牛成纤维细胞的分离培养

给体细胞克隆牛和转基因克隆牛研究提供形态良 好、已知性别、核型正常的供体细胞，本研究分离培 养了胎牛成纤维细胞，应用ＰＣＲ技术鉴别了胎牛成 纤维细胞的性别，并对其生长、细胞遗传相关特性进 行了鉴定。
１材料和方法
１．１ 材料 １．１．１主要仪器设备：ＣＯ：培养箱（ＢＩＮＤＥＲ）、超 低温冰箱（ＳＡＮＹＯ）、ＰＣＲ仪（Ｂｉｏｍｅｔｒｏ）、凝胶成像 仪（ＢｉｏＲａｄ）、高速台式离心机（Ｂｅｃｋｍａｎ）、倒置相差 显微镜（Ｎｉｋｏｎ）等。 １．１．２活体材料：胎牛取自本地屠宰场。 １．１．３ 主要试剂及耗材：ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基为 Ｇｉｂｃｏ产品；标准胎牛血清为ＴＢＤ产品；无机盐类及 Ｄ．ＰＢＳ为日本和光公司试剂；基因组ＤＮＡ提取试剂 盒、ＰＣＲ试剂盒为天为时代公司产品；其余试剂为 国产分析纯。 １．２研究方法 １．２．１组织块培养法从胎牛耳部分离培养成纤维 细胞：带有子宫的胎牛放入３７。Ｃ灭菌生理盐水中带 回实验室，立即用无菌的手术剪剪开子宫，剥除胎膜
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实验动物科学
２７卷
２．３不同传代次数的细胞生长曲线的测定 从绘制的细胞生长曲线（见图３）可以看出，传
代培养至不同代数的细胞生长趋势基本一致，即细 胞生长滞留期为０—２ ｄ，对数生长期为３～５ ｄ，６ ｄ
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图３胎牛成纤维细胞不同传代次数的 细胞生长曲线图
ＤＮＡ（阴性对照）和成纤维细胞２、５扩增后只有一 条分子量为４３７ ｂｐ特异性内参条带。因此可以确 定，分离培养的成纤维细胞１、３、４为雄性，而２、５为 雌性。
图２ ｐＣＲ法鉴定胎牛成纤维细胞性别 Ｍ．ＰＣＲ分子量标准；Ｐ．阳性对照（黑白花公牛血ＤＩｑＡ）； Ｎ．阴性对照（黑白花母牛血ＤＮＡ）；１—５．分离培养的来自于 五个不同的胎牛的成纤维细胞（从左到右依次为１—５）．
２．２ ＰＣＲ法鉴定培养的胎牛成纤维细胞的性别 常规的染色体法是鉴别细胞系的常规方法，但
操作繁琐，需要较为熟练的操作者才能完成，相比常 规的染色体法，ＰＣＲ法鉴别细胞系的性别具有操作 简便，结果可靠的优点，因此本文采用了ＰＣＲ法对 分离培养的细胞系进行了性别鉴定。根据牛Ｙ染 色体上命名为ｓ４的一段特有的重复序列Ⅲ１设计了 相应的引物，同时以牛细胞角蛋白５基因序列为模 板设计了一对引物作为内部参照，在同一个ＰＣＲ反 应中加入等量混合的两种不同的引物，ＰＣＲ反应条 件为：９４℃变性３０ ｓ，６０℃复性４０ ８，７２℃延伸ｌ ｍｉｎ， 得到了较为理想的结果。同时，利用已知性别的黑 白花牛血ＤＮＡ做对照，建立起了一个良好可靠、相 对稳定的性别鉴定方法。ＰＣＲ扩增产物的凝胶电 泳分析结果（见图２），雄性的牛血ＤＮＡ（阳性对照） 和分离培养的成纤维细胞１、３、４扩增后出现分子量 为４３７ ｂｐ和５８２ ｂｐ的电泳条带，它们分别是特异性 内参条带和特异性ｓ４重复序列条带，而雌性的牛血
后进入平台期。但随着体外培养传代次数的增加， 细胞的生长趋于缓慢。 ２．４染色体分析
分别取传代培养至第５代、第１５代以及第２５ 代的胎牛成纤维细胞制备中期相染色体，从中选择 分散良好、轮廓清晰的分裂相进行核型分析。结果 （见图４）表明：除了性染色体为亚中部着丝粒外，其 余的均为端部着丝粒，具有正常牛染色体的典型特 征；染色体倍性分析结果（见表２）表明：体外培养的 胎牛成纤维细胞在传代培养的过程中，染色体的倍 性没有发生明显的变化，二倍体的比例在７９．５％一 ８９．５％之间，细胞各代间差异不显著。这一结果说 明体外长期传代培养的胎牛成纤维细胞的染色体能 够正常复制和分裂。
成纤维细胞分离培养的方法有胰蛋白酶消化法 和组织块培养法两种旧２’２…。胰蛋白酶消化法一般 是将组织块用胰蛋白酶消化处理，解离出单细胞进 行培养。由于酶的消化作用与温度、组织块大小、酶 浓度等因素有关，消化时间过长或酶浓度过大都会 使细胞受损而影响生长，而消化时间过短或酶浓度 过低则达不到分散细胞的目的，而且用此法获得的 细胞参差不齐，有些样品消化后细胞很少，以至不能 很好传代。相对而言，组织块培养法具有获得的成 纤维细胞纯度高、量大、操作简便易行的优点。为了
２ 结果
２．１ 组织块培养法分离培养胎牛成纤维细胞的形 态学观察
组织块接种培养２ ｄ后，部分组织块边缘已开 始游离出少量成纤维细胞（见图１－８）；接种４ ｄ后， 多数组织块周围都有较多的成纤维细胞生长（见图 １一ｂ）；接种５ ｄ后，组织块周围的成纤维细胞数量明 显增多且生长旺盛（见图１一ｃ）；接种７ ｄ后，各个组 织块周围的细胞汇合，密密的铺满瓶底（见 图１．ｄ）。
从液氮罐中取出冻存管，投入３７℃水浴中 １—２ ｒａｉｎ，使其完全融化。用５ ｍＬ经３７℃预热的培 养液重悬细胞，２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｒａｉｎ收集细胞，加 入５ ｍＬ生长培养液重悬细胞，将其接种于６ ｃｍ细 胞培养皿中，于３７９０、５％ＣＯ，、饱和湿度条件下培 养，生长至约７０％一８０％汇合后，传代扩大培养。 １．２．４细胞生长曲线的测定：将培养至第５代、第 １５代和２５代的胎牛成纤维细胞以２ Ｘ １０４细胞／ｍＬ 的密度接种于１２孑Ｌ板中，每孔加入０．５ ｍＬ培养液， 于３７℃、５％ＣＯ：、饱和湿度的培养箱中培养。每天 同一时间用胰蛋白酶消化３孔细胞，血球计数板分 别计数后，求平均值。连续进行８ ｄ。以培养时间为 横坐标，三孔细胞的平均数为纵坐标绘制细胞生长 曲线。 １．２．５中期分裂相染色体的制备与核型分析：① 细胞生长至７０％一８０％汇合时，于４９２冰箱中放置 １５ ｈ后，加入秋水仙素至终浓度０．１仙ｓ／ｍＬ，在 ３７℃、５％ＣＯ：饱和湿度的培养箱中作用３ ｈ；②轻
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第３期
尹明等：胎牛成纤维细胞的分离培养
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图ｌ组织块培养法分离培养和转基因的胎牛成纤维细胞 ＆组织块贴附培养２ ｄ，部分组织块边缘已开始游离出少许成纤维细胞（相差，１００×）；ｂ．组织块贴附培养４ ｄ，多数组织块周 围都有较多的成纤维细胞生长（相差，１００×）；ｃ．组织块贴附培养５ ｄ，组织块周围的成纤维细胞数量明显增多且生长旺盛（相 差，１００×）；ｄ．组织块贴附培养７ ｄ，各个组织块周围的细胞汇合，密密的铺满瓶底（相差。１００×）．
轻吹打使阻断于分裂中期的细胞脱壁，将细胞悬液 装入１５ ｍＬ离心管，１ ５００ ｒ／ｒａｉｎ离心５ ｍｉｎ，去上 清；③缓缓加入３７℃预热的０．０７５ ｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ ５ ｍＬ， ３７。Ｃ孵育３０ ｒａｉｎ；④加入１ ｍＬ新鲜配制固定液（甲 醇：冰乙酸＝３：１）预固定３ ｒａｉｎ，１ ５００ ｒ／ｒａｉｎ离心 ５ ｍｉｎ，去上清；⑤加入新鲜固定液６ ｍＬ，轻轻吹打 均匀，室温固定３０ ｍｉｎ，５００ ｒ／ｒａｉｎ离心５ ｒａｉｎ去上 清，重复固定细胞２遍；⑥末次离－ｔｌ，后，小心吸除大 部上清液，余下０．５ ｍＬ固定液，轻轻吹打重悬细胞 并混匀；⑦吸少量细胞悬液，滴落在一２０℃预冷过 的洁净载玻片上，迅速在酒精灯火焰上烤干；⑧制备 好的染色体标本用Ｇｉｅｍｓａ染色液浸染１０ ｍｉｎ，流水 冲洗三次，自然干燥后，于显微镜下观察，统计其染 色体数目。
生长的细胞铺满瓶底时，去除组织块，传代培养，大 量扩增后冷冻保存。 １．２．２ ＰＣＲ法鉴定胎牛成纤维细胞的性别：①细 胞基因组ＤＮＡ的提取：在细胞第一次传代培养时， 取少量细胞，应用天为时代基因组ＤＮＡ提取试剂盒 提取细胞的基因组ＤＮＡ。同时以黑白花公牛和母 牛的血液分别作为对照。②ＰＣＲ引物：根据牛Ｙ染 色体上命名为Ｓ４的一段特有的重复序列Ⅲ１合成一 对引物，同时以牛细胞角蛋白５基因序列为模板，设 计一对引物作为内部参照。引物的序列见表１。
第２７卷第３期 ２０１０年６月
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§研究·论著§
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实验动物科学
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Ｖ０１．２７ Ｎｏ．３ Ｊｕｎｅ ２０１０
胎牛成纤维细胞的分离培养
尹 明１ 章轶哲１ 多曙光２
（１．北京市维通达生物技术有限公司。北京１００１０７） （２．北京大学生命科学学院，北京１００８７１）
摘要：应用组织块培养法从胎牛耳部分离培养了胎牛成纤维细胞。应用ＰＣＲ方法鉴别了细胞的性别。选择雌性成 纤维细胞，进行了形态观察、生长曲线测定、染色体分析。结果表明，分离培养的细胞具有正常的大小、形态、分裂 增殖特性和染色体数目。胎牛成纤维细胞的培养方法的建立以及其相关的生物学特性的分析，有利于给同种和异 种体细胞克隆牛研究提供形态良好、染色体数目正常的供体细胞，同时也为体细胞转基因等其他领域的研究提供 了基础条件。 关键词：胎牛成纤维细胞；分离培养；性别鉴定；染色体分析 中图分类号：Ｑ８１９ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００６—６１７９（２０１０）０３－０００１－０６
自１９９７年Ｗｉｌｍｕｔ等…首次获得克隆绵羊多莉 以来，哺乳动物体细胞克隆研究进展迅速，相继已有 小鼠‘２｜、牛‘３｜、山羊‘４｜、猪‘引、兔‘６１、猫‘引、马‘８１、骡 子归］、大鼠¨０｜、狗¨¨等多种克隆动物问世。就目前 的报道可知，已成功用于体细胞核移植的供体细胞 来源主要包括：乳腺上皮细胞、皮肤成纤维细胞、输 卵管上皮细胞、颗粒细胞、肌肉细胞、胎儿成纤维细 胞等等。其中胎儿成纤维细胞由于其取材方便、生 长快、体外传代次数相对较高、转基因效率高等特 点，成为体细胞克隆和制作转基因克隆动物时一种 首选的体细胞。近年来由胎儿成纤维细胞作为核供 体相继产生了转基因克隆绵羊¨引、山羊Ｈ。、 牛…ｑ＂、以及基因定点修饰的绵羊…１和猪¨９以川。
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２７卷
后取出胎儿，用ＰＢＳ液清洗三遍，置于７０％的乙醇 中浸泡消毒１０ ｒａｉｎ，再用ＰＢＳ清洗三遍。于净化台 中剪下胎儿耳部，放入装有ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ 的３５ ｍｍ培养皿中剪成１ ｍｍ见方的小块，用相同 培养液洗３遍，然后将组织块连同培养液一起转移 到１２５的培养瓶中，轻轻摇动使组织块成２—３ ｃｍ 间隔均匀分布，吸干组织块周围的培养液，倒置放入 培养箱中培养３—４ ｈ。待组织块贴壁后，缓慢加入 适量的培养液，于培养箱中３７℃、５％ＣＯ：、饱和湿度 条件下培养。每天观察并记录细胞的生长状况。待
织块培养初期，由于细胞仍基于原组织生长，还保持 着强增殖能力，所以我们可以看到首先移出生长的 主要是上皮样细胞。真皮层是一层致密的结缔组 织，细胞成分较少，因此在组织块培养的最初几天， 成纤维样细胞由于母细胞数量少而显得增加数量较 慢。成纤维样细胞在体外的生存能力强，生长迅速， ３—４ ｄ后呈优势生长，这一特征与人皮肤组织细胞 体外生长特征相似¨“。
图４体外培养不同代次的胎牛成纤维细胞的染色体图 １，２，３．分别为培养至第５代、第１５代和第２５代的胎牛成纤维细胞的染色体
表２体外培养不同代数牛成纤维细胞核型变异率比
注：经工２检验，三组核型正常率无明显差异（Ｐ＞０．０５）
３讨论 胎牛成纤维细胞在体外培养时成贴附型生长，
原代和早期传代细胞是上皮样和成纤维样细胞的混 合物，上皮样细胞由表皮生发层的细胞分裂增殖而 来，是源于外胚层的细胞，成纤维样细胞是由真皮层 细胞分裂增殖而来，源于中胚层。在体内，生发层的 细胞由于要不断的分裂产生新的表皮细胞以补充表 层角化脱落的细胞，因而具有较强的增生能力。组
表１ 胎牛成纤维细胞性别鉴定的ＰＣＲ引物
１．２．３细胞冻存和解冻复苏培养：用０．０５％胰蛋 白酶／ＥＤＴＡ，３７℃下消化细胞３ ｍｉｎ，２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离 心５ ｍｉｎ，收集细胞，加入１ ｍＬ新鲜的培养液重悬细 胞，台盼兰染色、血球计数板计数后，用冷冻保护液 （含２０％的ＦＢＳ、１０％ＤＭＳＯ的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养液） 调整细胞至１ Ｘ １０６细胞／ｍＬ，每个冷冻管中分装 １ ｍＬ，一８０℃冰箱过夜，然后投入液氮中长期 保存。
收稿日期：２０１０—０３—２８ 作者简介：尹明（１９７５一），女，助理研究员。研究方向：细胞生物学。Ｅ—ｍａｉｌ：ｙｉｎｍｉｎｇｅｒ＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｓ 通讯作者：多曙光（１９７１一），男，高级工程师，主要从事动物模型研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｕｏｓｈｕｇｕａｎｇ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ．ｃｎ
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