鸭圆环病毒Cap蛋白的原核表达

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鸭圆环病毒病原学特性及分子生物学诊断方法研究进展

鸭圆#病毒病&学特性*分子生物学/0方法研456李天芝#，于新友#，张颖2(1.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州256600;2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州256600)摘要：鸭圆环病毒病(D uC V D)是由鸭圆环病毒(D uC V)感染引起的一种免疫抑制性疾病。

临床表现为羽毛发育不良、脱落、生长缓慢、饲料转化率降低、消瘦、贫血等。

单纯感染该病毒时，鸭的死亡率低，混感或继发其它疾病，致鸭死亡率升高，给养鸭业造成了一定的经济损失。

本文综述了 D u C V的病原学特性及分子生物学检测方法研究进展，以期为该病的快速诊断和防控提供参考。

关键词：鸭圆环病毒；病原学特性；诊断中图分类号：S858.322.65文献标识码:A鸭圆环病毒病circovirus disease，DuCVD)是由鸭圆环病毒c%rco)%r"*，DuCV$感染引起的一种免疫抑制性疾病[1]。

各品种和日龄鸭均可感染发病，临床表现为羽毛发育不良、脱落、消瘦、贫血、生长缓慢、饲料转化率降低等[2]。

单纯感染该病毒时，一般仅造成鸭零星死亡，但该病毒感染后可造成鸭免疫抑制，容易混感或继发其它疾病，致鸭死亡率升高，给养鸭业造成了一定的经济损失。

2003年德国学者Hattermann等首先报道该病[3]，随后世界各地均有相关报道，2006年 C hen等在我国台湾地区检测到DuCV感染，2008年傅光华等首次在我国大陆地区番鸭中检测到DuCV感染[4]，随后山东、福建、浙江、江苏、广东等省陆续有相关报道。

近年来DuCV在我国鸭群中收稿曰期：2018-07-23文章编号：1673-1085(2018)08-0040-04的感染及混合感染病例呈上升趋势[5]，引起兽医界高度关注，具有重要的经济意义。

了DuCV的病原学特性及分子生物学检测方法研究进展作一简要概述，以期为该病的快速诊断和防。

1病原学特性DuCV属圆环病毒科圆环病毒属，病毒粒子呈圆形或二十面体对称，无囊膜，直径约为15; 16nm，是目前已知最小的鸭病毒。

鸭圆环病毒的分子流行病学调查及诊断方法的建立

鸭圆环病毒的分子流行病学调查及诊断方法的建立鸭圆环病毒(Duck circovirus,DuCV)是圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)的一新成员,2007年ICTV(The International Committee on Taxonomy of Viruses)将DuCV列入圆环病毒属中的暂定种。

DuCV感染可导致鸭子羽毛凌乱、生长迟缓、体重减轻等症状。

本文拟从DuCV的流行病学调查、克隆测序及分子遗传变异、人工感染的病理组织动态变化、建立血清学检测方法和体外组织细胞培养等方面进行研究和探索。

1、山东省樱桃谷鸭群中鸭圆环病毒及混合感染的流行病学调查本研究旨在调查中国山东省樱桃谷鸭(Cherry Valley ducks)群DuCV的感染与流行情况。

2006-2007年间,从山东省70个樱桃谷肉鸭养殖场随机选取742只鸭,采用PCR和Dot-blot方法,对DuCV感染情况进行流行病学调查。

结果显示,被调查鸭中有33.29%感染了DuCV;3、4周龄的鸭子较2周龄的更易感;PCR鉴定方法比Dot-blot敏感。

此外,与DuCV阴性鸭比较,DuCV阳性鸭与鸭1型肝炎(25.50%vs7.47%)、鸭疫里默氏菌(23.48%vs8.28%)及大肠杆菌(16.19%vs4.85%)的混合感染率较高。

调查显示,DuCV在樱桃谷鸭群中普遍存在,且DuCV呈阳性的鸭更易与其它病原发生混合感染。

2、鸭圆环病毒的克隆测序及序列分析从中国大陆樱桃谷鸭中得到LY0701、WF0701两株DuCV的全基因组,Genbank登录号分别为EU022374,EU022375。

基因序列特征分析表明,这两株病毒的基因组均具有以下分子特征:(1)颈环结构;(2)滚环复制;(3)四个重复序列;(4)两个主要开放阅读框,分别编码复制蛋白Rep基因和编码衣壳蛋白Cap基因。

通过与已发表的序列比较分析,所分离的两株病毒分别在两个分支上,LY0701株与台湾T1、T2、T3株、中国LY0701同源性高达96.7%以上,位于一个分支上,WF0701株则与美国株、德国株以及台湾的T4株更为接近,同源性达到93.5%以上,位于另一分支上。

圆环病毒Cap蛋白的研究进展

整的自组装中起着十分重要的作用。
膜、二十面体对称的单链ＤＮＡ病毒，可以感染多种动物，主要侵袭的禽类包括金丝雀、鸭子、雀类、鹅、天鹅、海鸥，哺乳动物有猪、犬。最新的报道指出圆环病毒也可侵袭鱼类、野猩猩，甚至是人类。大多数圆环病毒主要侵袭淋巴组织，导致免疫抑制，进而引起多种病原菌的混合感染，在全世界范围内给
毒的Ｃａｐ蛋白在病原感染和免疫应答方面起着十分重要的作用。本文主要阐述了圆环病毒Ｃａｐ蛋白的结构、体外表达特征、抗原表位分布、抗原性变异、中和抗体以及它们之间的内在联系。
关键词：圆环病毒；Ｃａｐ蛋白；抗原表位；抗原性变异；中和抗体
过分析抗ＰＣＶ２一Ｃａｐ和ＰＣＶ１／ＰＣＶ２一Ｃａｐ蛋白的单
以及动物福利。圆环病毒的基因组包含２个主要的阅读框（ＯＲＦ１、ＯＲＦ２），分别编码复制起始蛋白Ｒｅｐ、Ｒｅｐ＂和结构蛋白Ｃａｐ，Ｃａｐ蛋白是ＰＣＶ的主要保护性抗原蛋白，决定着病毒的抗原性，在疫苗的研发过程中起着十分重要的作用，同时Ｃａｐ蛋白还
养殖业造成了巨大的危害，也严重威胁着公共健康
３抗原表位的研究进展

鸭圆环病毒检测方法研究进展

２０１８年第３５卷第　６　期鸭圆环病毒病（Duck circovirus disease，DuCVD）是由鸭圆环病毒（Duck circovirus，DuCV）感染引起的一种免疫抑制性疾病[1]。

各品种和日龄鸭均可感染发病，临床表现为羽毛发育不良、脱落、生长缓慢、饲料转化率降低、消瘦和贫血等[2]。

单纯感染DuCV时，一般仅造成鸭零星死亡，但该病毒感染后可造成鸭免疫抑制，容易混合感染或继发其他疾病，致鸭死亡率升高，给养鸭业造成了经济损失。

2003年Hattermann等[3]首先报道该病，随后世界各地均有相关报道，2006年Chen等[4]在我国台湾地区检测到DuCV感染，2006年姜世金等在我国大陆地区鸭群中检测到DuCV感染。

近年来，DuCV在我国鸭群中的感染及混合感染病例呈上升趋势[5]，引起兽医界的高度关注。

DuCV属圆环病毒科圆环病毒属，病毒粒子呈圆形或二十面体对称，无囊膜，直径约为15~16 nm，是目前已知最小的鸭病毒。

该病毒对外界环境抵抗力强，一旦感染鸭群很难被清除，且目前尚不能在体外培养。

DuCV是单链环状DNA病毒，基因组长约2.0 kb，有2个主要的阅读框ORFV1和ORFC1，分别编码与病毒复制有关的Rep蛋白和核衣壳蛋白Cap蛋白，病毒可分为DuCV-1和DuCV-2基因型。

本文对DuCV诊断方法研究进展进行了综述，以期为该病的快速诊断和防控提供参考。

1　血清学检测方法1.1　间接免疫荧光试验（IFA）IFA的基本原理是先用一抗处理待检细胞，形鸭圆环病毒检测方法研究进展于新友1，张　颖2，李天芝1（1.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州　256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州　256600）摘　要：鸭圆环病毒病是由鸭圆环病毒感染引起的一种免疫抑制性疾病。

本文综述了鸭圆环病毒血清学和病原学检测方法的研究进展，主要包括间接免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验、核酸探针技术、普通PCR、限制性片段长度多态性聚合酶链反应、套式PCR、多重PCR、荧光定量PCR和环介导等温扩增技术等，并对各种方法的优缺点进行了汇总分析，以期为该病的诊断与防控工作提供参考。

猪圆环病毒3型衣壳蛋白(Cap)的原核表达及免疫评价

猪圆环病毒3型衣壳蛋白（Cap）的原核表达及免疫评价猪圆环病毒3型（Porcine circovirus type 3，PCV3）是一种新型的猪源病毒，最初于2016年在美国被鉴定出来。

与其他圆环病毒相比，PCV3具有较高的遗传变异性，并且能够感染多种生物组织和细胞类型，引起多种疾病。

作为一种病毒，PCV3具有特殊的复制和感染特性。

PCV3的基因组长度为1.7千碱基对（kbp），包含两个开放阅读框（open reading frame，ORF），编码了9个蛋白质。

其中，衣壳蛋白（Cap）是PCV3病毒颗粒的主要组成成分之一，也是潜在的疫苗候选抗原。

为了理解PCV3 Cap的功能和免疫学特性，研究人员进行了原核表达及免疫评价的实验研究。

首先，研究人员从PCV3感染的猪组织中提取了PCV3基因组DNA。

随后，他们通过特定引物和PCR方法，扩增出PCV3 Cap基因。

将PCR产物纯化后，将其连接到原核表达载体中，构建了原核表达载体。

之后，将重组质粒转入大肠杆菌宿主，通过特定的培养基和培养条件，诱导PCV3 Cap蛋白在大肠杆菌中高效表达。

为了评价PCV3 Cap蛋白的免疫学特性，研究人员进一步对表达的蛋白进行了纯化和鉴定。

首先，他们采用亲和层析技术，纯化了在大肠杆菌中表达的重组蛋白。

通过蛋白浓缩和凝胶电泳技术，研究人员确认纯化的蛋白得到了高效且纯度较高的表达。

接下来，他们通过Western blotting和间接免疫荧光技术，验证了纯化的蛋白的免疫反应性。

结果表明，PCV3 Cap蛋白与PCV3感染的病毒颗粒中的Cap蛋白具有较高的相似性，能够诱导机体产生强烈的免疫反应。

为了深入了解PCV3 Cap蛋白的免疫学特性，研究人员进一步对其免疫原性进行了评价。

他们以小鼠为实验动物，注射纯化的PCV3 Cap蛋白，观察小鼠的免疫反应。

实验结果显示，注射PCV3 Cap蛋白后，小鼠产生了特异性的抗体反应，并且能够与PCV3感染的病毒颗粒结合。

猪圆环病毒2型Cap全基因的克隆与原核表达

猪圆环病毒2型Cap全基因的克隆与原核表达李海花;覃尧;张全红;李秀丽【摘要】Cap蛋白是猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的主要结构蛋白,能诱导免疫保护,是临床上利用血清学诊断PCV2的主要依据.本研究根据PCV2 TJ株全基因核苷酸序列(GenBank登录号:KC751546)设计特异性引物,利用PCR从PCV2 TJ株扩增获得Cap全基因,将该基因片段连接到原核表达载体pET-32a(+)中,获得重组质粒pET32a-Cap,经IPTG诱导获得约48 ku的重组融合蛋白,Western blotting分析结果表明其与小鼠抗6×His单克隆抗体和PCV2阳性猪血清均呈阳性反应.本研究成功克隆Cap全基因,构建原核表达载体,并实现Cap融合蛋白的表达,这为PCV2 Cap蛋白的功能研究及诊断方法的建立和亚单位疫苗的研制奠定了基础.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2015(042)002【总页数】5页(P337-341)【关键词】猪圆环病毒2型;Cap基因;克隆;原核表达【作者】李海花;覃尧;张全红;李秀丽【作者单位】天津市畜牧兽医研究所,天津300384;中国农业大学动物医学院,北京100193;国家知识产权局专利局专利审查协作北京中心,北京100190;天津市畜牧兽医研究所,天津300384【正文语种】中文【中图分类】Q786猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原体[1]。

PMWS以断奶仔猪的进行性消瘦、贫血、淋巴结肿大、肝炎、肾炎和肺炎为特征。

除PMWS外，PCV2还与许多相关疾病的发生有关，如猪皮炎与肾炎综合征、增生性坏死性肺炎、仔猪先天性颤抖、猪呼吸道综合征、繁殖障碍、肠炎等疾病也与PCV2有重要关联[1-4]。

鸭源新城疫F基因和鸭圆环病毒Cap基因融合表达DNA疫苗的构建

２０１４年２７卷１期
Ｖ０Ｌ２７Ｎｏ．１
西
南
农
业
学
报
４２３
ＳｏｕｔｈｗｅｓｔＣｈｉｎａＪｏｕｎａｒｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ
文章编号：１００１— ４８２９（２０１４）０１— ０４２３— ０５
（１．ＣｏＵｅｇｅｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＧｕａｎｇｘｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＧａｎｎｇｘｉＮａｎｎｉｎｇ５３０００４，Ｃｈｉｎａ；２．ＧｕａｎｇｘｉＶｅｔｅｉｒｎａｒｙＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｇｕａｎ一
ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｎｉｍａｌＶｃｃａｉｎｅｓａｎｄＮｅｗＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＧｕａｎｇｘｉＮｎｎａｉｎｇ５３００１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｗｏｐａｉｓｒｏｆｓｐｅｃｉｉｃｆｐｉｍｃｒｓｗｒｅｒｅｄｅｓｉｇｎｄ，ａｅｎｄｔｈｅｎｔｈｅａｍｐｌｉｆｉｅｄＦａｎｄＣａｐｇｅｎｅｓｗｅｒｅｉｎｓｅｒｔｄｉｅｎｔｏｐｅＤＮＡ３．１ｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄｐｌａｓｍｉｄｐｃＤＮＡ３．１－Ｆ－Ｃａｐ．Ｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎｄｅｐｌａｓｍｉｄ８ｃｏｎｆｍｎｄｅｂｙｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｎｄａｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ＡｎｄｓｕｂｓｅｑｕｅｎｌｔｙｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄｐｌａｓｍｉｄｗａｇｔｒｎｓａｆｅｔｄｅｉｎｔｏＶｅｔｏｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅｉｎｖｉｔｒｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｈｅｔｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｗａｇｉｄｅｎｔｉｆｉｄｅｂｙｈｅｔｉｍｍｕｎｏｌｆｕｏｅｓｒｃｅｎｃｅｔｅｓｔ．

猪圆环病毒3型Cap蛋白的原核表达

·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘要：为获得具有良好抗原性的猪圆环病毒3型（PCV3）Cap 重组蛋白，根据本实验室已测序获得的1株全基因组序列设计特异性引物，以阳性病料中提取的病毒DNA 基因组为模板，通过PCR 方法扩增得到PCV3的去核定位信号的Cap 蛋白基因，将目的片段插入到pCold TF 载体中构建pCold TF-dPCV3-Cap 重组质粒，然后将其转化至表达宿主菌BL21（DE3）中，通过优化表达和纯化条件，最终获得纯度较高的Cap 重组蛋白。

SDS-PAGE 分析表明，该蛋白能够在上清液中大量表达，并且在IPTG 终浓度为1 mmol/mL 、16℃诱导20 h 的条件下表达量最高；Western blot 结果证实通过磁珠纯化后的目的蛋白与PCV3阳性血清能够发生特异性反应。

因此，重组Cap 蛋白具有良好的反应原性和特异性，可以作为研制PCV3多表位基因工程疫苗和血清抗体诊断方法的候选靶抗原。

关键词：猪圆环病毒3型；原核表达；Cap 蛋白中图分类号： S852.659.2文献标志码：A文章编号：1674-6422（2021）05-0059-05Prokaryotic Expression and Antigenic Analysis of Cap Protein of Porcine Circovirus Type 3W ANG Shuaiyong, W ANG Qi, ZHU Shiqiang, Y AO Y un, YU Lingxue, LIU Xiaomin, SHAN Tongling,ZHENG Hao, ZHOU Yanjun, TONG Wu, LI Guoxin, GAO Fei, TONG Guangzhi, YU Hai(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241,China)收稿日期：2019-04-19基金项目：上海市自然科学基金青年项目（16ZR1444000）；中央级公益性科研院所基本科研业务费项目（2019JB05）；中国农业科学院创新工程“猪病毒性繁殖障碍综合症团队”项目作者简介：王帅勇，男，硕士研究生，预防兽医学专业通信作者：猪圆环病毒3型Cap 蛋白的原核表达王帅勇，汪琪，朱世强，姚云，虞凌雪，刘晓敏，单同领，郑浩，周艳君，童武，李国新，高飞，童光志，于海（中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241）2021,29(5): 59-63Abstract: According to the complete genomic sequence of Porcine circovirus type 3 (PCV3) that was isolated in our laboratory, a pair of speciﬁ c PCR primers were designed and the nuclear localization signal-defected capsid protein gene was ampliﬁ ed by PCR for prokaryotic expression. The PCR product was inserted into the pCold TF vector to construct the recombinant plasmid pCold TF-dPCV3-Cap, which was then transformed into expression host strain BL21(DE3) with IPTG induction. The expressed fusion protein was analyzed by SDS-PAGE. The results showed that the recombinant Cap protein was expressed and released into the supernatants in soluble form. The optical conditions for the Cap protein expression were determined to be 16℃, 1 mmol/mL IPTG and induction for 24 h. The Cap protein was puriﬁ ed by using magnetic beads and antigenic analysis was carried out by Western blot. The results demonstrated that the Cap protein obtained had good antigenicity and speciﬁ city.Key words: Porcine circovirus type 3; prokaryotic expression; Cap protein· 60 ·中国动物传染病学报2021年10月猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）属于圆环病毒科圆环病毒属，是一种单股环状DNA病毒。

鸭圆环病毒的PCR鉴定及分子特点分析

2018年第2期（总第253期）试验研究鸭圆环病毒的PCR鉴定及分子特点分析刘新勃（山东畜牧兽医职业学院山东潍坊 261061）孙嘉吴少鹏鞠孜敬（山东农业大学山东泰安）唐德宏*（山东省泰安市动物疫病预防控制中心）摘要本研究采用2对针对鸭圆环病毒(DuCV)的特异性引物，对57份病死鸭病料进行PCR检测，探究了DuCV在病死鸭的感染情况；同时，随机选择2个DuCV阳性的样品进行克隆、序列测定。

结果显示，病死鸭中DuCV阳性率为7.0%；同源性分析显示，2株DuCV的核苷酸序列与广西参考株(KC460535)的同源性最高，分别为97.7%、96%。

基因进化树分析显示，2株DuCV与德国参考株(AY228555)和广西参考株(KC460532、KC460535)属于同一群，为基因1型。

本研究对病死鸭DuCV感染情况的初步调查，补充了其流行病学资料，对肉鸭疫病防控具有一定的参考意义。

关键词鸭圆环病毒(DuCV) PCR鉴定分子特点中图分类号：S852.65+9.2 文献标识码：A 文章编号：1007-1733(2018)02-0005-03圆环病毒是一种目前在哺乳动物和禽类中发现和鉴定的最小的DNA病毒[1]，其在鸡、鸭、鸽、鹅、猪等动物体内普遍存在[2-5]。

圆环病毒有2个属：圆环病毒属和环病毒属。

鸡传染性贫血病毒归于环病毒属，猪圆环病毒、鹦鹉喙羽病、鸭圆环病、鹅圆环病等大部分病毒归于圆环病毒属。

目前，对动物的圆环病的研究主要集中在猪圆环病、鸡传染性贫血、鹦鹉喙羽病方面。

鸭圆环病毒最早于2003年由德国学者Hattermann通过PCR和电镜从番鸭的法氏囊组织中发现[6]。

2004年Soike等[7]研究发现，感染圆环病毒42日龄的半番鸭临床上表现为羽毛紊乱、生长迟缓、体况消瘦，组织病理学检测显示，鸭法氏囊内淋巴细胞减少、法氏囊出现坏死、组织细胞增多，这与其他动物圆环病毒引起的病毒诱导性淋巴组织损伤类似，由此推测该病毒可能具有免疫抑制作用。

猪圆环病毒2型 Cap 基因的克隆与原核表达

猪圆环病毒2型 Cap 基因的克隆与原核表达杨克礼;孟丽;时代;段正赢;田永祥;周丹娜;郭锐;刘泽文;袁芳艳;刘威【摘要】According to the complete genome of Porcine Circovirus Type 2 ( PCV2) strain HBEZ, a pair of specific primers were designed to amplify ORF2 gene in HBEZ, and Sac Iand Hind III were used in the primers.ORF2 gene fragment was cloned to the prokaryotic expression vector pET-28a to construct the recombinant plasmid pET-ORF2.PCR and restrict enzyme identifi-cation confirmed that the recombinant plasmid was constructed successfully .Then pET-ORF2 was transformed into E.coli strain Rosetta.After being induced by IPTG, the recombinant protein with the molecular weight of 34.5 kD could express mainly in the form of inclusion body in SDS-PAGE electrophoresis.The best inducement conditions were acquired as follows:bacterial culture at 37 ℃, adding 1 mmol/L IPTG when the OD-value was between 0.4 and 0.6, and inducement by IPTG for 5h.The expression product Cap protein was purified by His-tag Ni-column and then was examined by Western-blot.The results showed that the ex-pressed recombinant protein could react specifically with the polyclonal antibody against PCV 2, and it possessed a good reactoge-nicity.%利用PCV2鄂州株的基因序列设计特异性引物，分别在上、下游引物中加入Sac I和Hind III酶切位点，扩增出PCV2鄂州株的ORF2基因；将该片段克隆至pET－28a原核表达载体，经PCR、酶切鉴定，成功构建了阳性重组表达质粒pET－ORF2。

重组杆状病毒表达鸭圆环病毒Cap蛋白及活性检测

重组杆状病毒表达鸭圆环病毒C ap蛋白及活性检测石超1张恒2*赵汉嵩3(1上海爱森肉食品有限公司上海201408 2山东诸子生物科技有限公司山东诸城2622003诸城市畜牧兽医管理局山东诸城262200 )[摘要]为了获得具有活性的鸭圆环病毒C ap蛋白，笔者通过P C R方法获得鸭圆环病毒I型完整C叫基因片段，将其克隆到昆虫杆状病毒基因组中，获得重组杆状病毒qBac-P-Cap，其病毒效价T C ID50可以达到9. 25 %重组杆状病毒可在悬浮Sf9细胞中表达具有活性的鸭圆环病毒C ap蛋白。

研究表明蛋白表达最佳收获时间为120 8纯化后蛋白表达量可以达到200 #g/m L。

这为进一步研究C ap蛋白功能和大规模制备鸭圆环疫苗奠定了基础。

关键词：重组杆状病毒；鸭圆环病毒；C ap蛋白表达；活性检测鸭圆环病毒（£>mc々circowirw〗，D m C V)/10属于圆环病毒科，是无囊膜、二十面体对称的病毒，其基因组为单股环状D N A，主要侵害宿主的免疫系统，造成宿主免疫功能低下，进而易引发二重甚至多重感染，造成巨大的经济损失[23]。

目前，动物圆环病毒中，鸡传染性贫血病病毒和猪圆环病毒的体外增殖[45]研究比较深人，而D m C V由于没有体外增殖的方法，所以研究进展缓慢。

杆状病毒表达系统具备完整的翻译后修饰系统，明显优于细菌和酵母，且易于操作及大规模生产等6。

本研究拟利用杆状病毒表达系统表达鸭圆环病毒的C ap蛋白，为进一步研究C ap蛋白的功能和大规模制备鸭圆环疫苗奠定基础。

1材料与方法1. 1 材料1.1.1菌株、细胞和载体:感受态细胞JM109购于宝生物工程(大连）有限公司，昆虫杆状病毒线性杆粒、p1064转移载体和鸭圆环全基因组PM D18-T-H Z1701质粒由山东诸子生物科技有限公司实验室提供，Sf9悬浮昆虫细胞由上海倍谙基生物有限公司提供。

鸭圆环病毒cap基因的表达与检测cap抗体的间接elisa方法建立

摘要鸭圆环病毒（duck circovirus，DuCV）是圆环病毒科圆环病毒属的成员之一，主要引起宿主的淋巴系统损伤，导致免疫抑制，进而引起继发感染或二重及多重感染，已引起越来越多的关注。

美国、匈牙利、德国和中国台湾等地区相继报道在番鸭、半番鸭、樱桃谷肉鸭中发现该病毒。

国内福建、山东、浙江和广州等省份的流行病学调查，也证实了DuCV的普遍存在。

DuCVcap蛋白是DuCV的主要的免疫原性蛋白，也是病毒的主要结构蛋白。

为了能够得到DuCV的免疫原性蛋白，并以此建立诊断方法，为鸭场大规模样品中检测DuCV抗体提供依据。

研究用DuCV cap基因原核表达蛋白，并进行纯化，建立间接ELISA方法，初步应用于安徽省部分鸭场DuCV抗体检测。

具体如下：首先利用软件对DuCV AQ0901株cap基因的保守区域进行分析，设计了一条特异性引物，将N末端影响外源蛋白表达的稀有密码子截去后，将其克隆到原核表达载体PET-28a中，并在完成对构建质粒PCR、EcoR/ⅠSalⅠ双酶切鉴定，测序鉴定后，用诱导剂IPTG对其进行诱导表达，同时对诱导剂浓度，诱导时间，蛋白表达的可溶性等条件进行优化。

在大量表达重组dcap蛋白后，利用NI纯化树脂对His-dcap蛋白进行纯化，同时还对重组蛋白的浓度，纯度以及免疫活性等特性进行检测，并用纯化好蛋白免疫健康樱桃谷肉鸭，制备了多克隆抗体血清。

结果显示，构建好的pET-28a-dcap重组质粒诱导表达后，经SDS-PAGE检测及Western-blot分析证明，在大肠杆菌中得到了高效表达，并以包涵体的形式表达；用NI纯化树脂对His-dcap蛋白进行纯化后，蛋白浓度可达1.285mg/mL，且表达蛋白保留了部分天然cap蛋白的抗原性；利用纯化蛋白乳化后制备多克隆抗体血清经琼扩试验测定抗体效价可达1∶128。

其次利用上述纯化好dcap蛋白建立一种检测cap抗体的间接ELISA方法，为规模化鸭场DuCV感染情况调查提供快速简易的血清学方法。

鸭圆环病毒Cap基因在昆虫细胞杆状病毒系统中的表达及鉴定

鸭圆环病毒Cap基因在昆虫细胞杆状病毒系统中的表达及鉴定张兴晓;邹金峰;相琪旺;王鑫;陈琳;谢之景;姜世金【摘要】The whole Cap gene of duck circovirus (DuCV) was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and then cloned into the baculovirus donor vector pFastBacTMHTB according to the right open reading frame (ORF). The recombinant plasmids Pf-CP DNA were transformed into E. Coli competent cells DHlOBac containing baculovirus shuttle vector. The recombinant bacmid (rBacmid-CP) was screened and verified by PCR. The rBacmid-CP was transfected into Sf9 insect cells and the recombinant baculovirus was obtained and confirmed by Western blot and immunofluorescence assay with the antiserum was collected from the mice which were immunized with the Cap expressed in prokaryotes. The recombinant Cap would be useful resource for studying on the function of Cap.%通过PCR方法扩增完整的鸭圆环病毒Cap基因,按正确的阅读框架将其克隆入pFastBacTM HTB杆状病毒载体,将筛选的阳性重组载体pF-CP转化至含有杆状病毒穿梭载体和辅助载体的DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,经过蓝白斑筛选和PCR鉴定,获得重组表达载体rBacmid-CP.在脂质体的介导下转染Sf9昆虫细胞,72 h后获得重组杆状病毒.Western blot和间接免疫荧光(IFA)试验结果表明,表达的蛋白与原核表达Cap蛋白免疫小鼠采集的血清具有良好的反应原性,为进一步研究Cap蛋白的功能奠定基础.【期刊名称】《西北农业学报》【年(卷),期】2012(021)003【总页数】5页(P7-11)【关键词】鸭圆环病毒;Cap基因;昆虫细胞-杆状病毒表达系统;IFA【作者】张兴晓;邹金峰;相琪旺;王鑫;陈琳;谢之景;姜世金【作者单位】山东农业大学动物医学院,山东泰安 271018;山东农业大学动物医学院,山东泰安 271018;山东农业大学动物医学院,山东泰安 271018;山东农业大学动物医学院,山东泰安 271018;山东农业大学动物医学院,山东泰安 271018;山东农业大学动物医学院,山东泰安 271018;山东省动物生物技术与疫病防治重点实验室,山东泰安 271018;山东农业大学动物医学院,山东泰安 271018;山东省动物生物技术与疫病防治重点实验室,山东泰安 271018【正文语种】中文【中图分类】S852.65鸭圆环病毒（Duck circovirus，DuCV）属于圆环病毒科（Circoviridae），是无囊膜、二十面体对称的病毒，其基因组为单股环状DNA。

新发猪圆环病毒3型Cap蛋白的原核表达和纯化

新发猪圆环病毒3型Cap蛋白的原核表达和纯化连凯琪;周玲玲;张明亮;王英杰;张慢;宋玉伟【摘要】为制备新发猪圆环病毒3型(PCV-3)衣壳蛋白(Cap)的抗原,在大肠杆菌中表达Cap蛋白,并对其进行纯化.通过PCR扩增去除核定位信号区的Cap136-645基因,构建重组表达质粒pET30a(+)-Cap136-645,转化到E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达,然后通过SDS-PAGE电泳和Western blot分析进行鉴定,并纯化Cap136-645蛋白.结果表明,成功构建了pET30a(+)-Cap136-645重组表达质粒,且可在E.coli BL21(DE3)感受态细胞中可大量表达,表达的重组蛋白主要以包涵体形式表达,分子质量约为27.5 ku,纯化的蛋白质质量浓度高达1.28 μg/μL,且条带单一.【期刊名称】《河南农业科学》【年(卷),期】2018(047)011【总页数】5页(P120-123,129)【关键词】猪圆环病毒3型;包涵体;原核表达;蛋白质纯化【作者】连凯琪;周玲玲;张明亮;王英杰;张慢;宋玉伟【作者单位】安阳工学院生物与食品工程学院/河南省动物疫病防控与营养免疫院士工作站/河南省兽用生物制品研发与应用国际联合实验室,河南安阳455000;安阳工学院生物与食品工程学院/河南省动物疫病防控与营养免疫院士工作站/河南省兽用生物制品研发与应用国际联合实验室,河南安阳455000;安阳工学院生物与食品工程学院/河南省动物疫病防控与营养免疫院士工作站/河南省兽用生物制品研发与应用国际联合实验室,河南安阳455000;安阳工学院生物与食品工程学院/河南省动物疫病防控与营养免疫院士工作站/河南省兽用生物制品研发与应用国际联合实验室,河南安阳455000;安阳工学院生物与食品工程学院/河南省动物疫病防控与营养免疫院士工作站/河南省兽用生物制品研发与应用国际联合实验室,河南安阳455000;安阳工学院生物与食品工程学院/河南省动物疫病防控与营养免疫院士工作站/河南省兽用生物制品研发与应用国际联合实验室,河南安阳455000【正文语种】中文【中图分类】S855.3猪圆环病毒(Porcine circoviruses, PCV)是一种无囊膜的单股环状负链的DNA病毒，属于圆环病毒科圆环病毒属[1]。

鹦鹉喙羽症病毒Cap蛋白的原核表达与纯化

鹦鹉喙羽症病毒Cap蛋白的原核表达与纯化郭学俊;纪钟书;陈冬杰;盖新娜;常建宇【摘要】鹦鹉喙羽症病毒(PBFDV)是圆环病毒科圆环病毒属的成员,可引起多个品种鹦鹉的急性死亡或者羽毛脱落和喙变形.病毒基因组中的ORF1和ORF2分别编码病毒复制相关蛋白(Rep protein)和衣壳蛋白(Cap protein).Cap蛋白是圆环病毒的主要结构蛋白,也是其主要的免疫保护性蛋白.本试验应用PCR技术选择性扩增PBFDV Cap蛋白抗原表位集中区域的基因片段,并将其克隆入原核表达载体pGEX-6p-1中,诱导表达截短的Cap蛋白.SDS-PAGE及质谱鉴定结果显示,融合表达的CapT蛋白约45 kDa,切胶纯化后的蛋白浓度约1.6 mg/mL.该Cap蛋白的成功获得为PBFDV治疗用阳性血清制备及亚单位疫苗的开发奠定了必要的物质基础.【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2018(054)006【总页数】5页(P41-44,48)【关键词】鹦鹉喙羽症病毒;Cap蛋白截短;原核表达;蛋白纯化【作者】郭学俊;纪钟书;陈冬杰;盖新娜;常建宇【作者单位】中国农业大学动物医学院,北京海淀100193;中国农业大学动物医学院,北京海淀100193;中国农业大学动物医学院,北京海淀100193;中国农业大学动物医学院,北京海淀100193;中国农业大学动物医学院,北京海淀100193【正文语种】中文【中图分类】S852.65鹦鹉喙羽症病毒(Psittacine beak and feather disease virus，PBFDV)与猪圆环病毒同属于圆环病毒科圆环病毒属。

病毒基因组为单股DNA，可双向转录，大小约1 992～2 018 bp[1],含有7个开放阅读框(ORFs)[2]，其中的2个主要开放阅读框ORF1和ORF2分别编码病毒的复制相关蛋白(Rep protein)和衣壳蛋白(Cap protein)。

_圆环病毒Cap蛋白的研究进展

＊为通讯作者基金项目：云南省公益性关键技术研究开发计划项目（２０１３ＣＨ００１），昆明市科技合作重点项目（２０１３０２０１ＡＨ０２３０２７）圆环病毒Ｃａｐ蛋白的研究进展王钊哲　宋春莲　王皓然　胡超英　王广龙　杨亮宇＊（云南农业大学动物科技学院　云南昆明　６５０２０１）【摘要】圆环病毒科的大多数成员主要侵袭淋巴系统，进而导致机体免疫机能受到抑制，而病毒的Ｃａｐ蛋白在病原感染和免疫应答方面起着十分重要的作用。

本文主要阐述了圆环病毒Ｃａｐ蛋白的结构、体外表达特征、抗原表位分布、抗原性变异、中和抗体以及它们之间的内在联系。

关键词：圆环病毒；Ｃａｐ蛋白；抗原表位；抗原性变异；中和抗体一般来说，圆环病毒科的大多数成员都是无囊膜、二十面体对称的单链ＤＮＡ病毒，可以感染多种动物，主要侵袭的禽类包括金丝雀、鸭子、雀类、鹅、天鹅、海鸥，哺乳动物有猪、犬。

最新的报道指出圆环病毒也可侵袭鱼类、野猩猩，甚至是人类〔１〕。

大多数圆环病毒主要侵袭淋巴组织，导致免疫抑制，进而引起多种病原菌的混合感染，在全世界范围内给养殖业造成了巨大的危害，也严重威胁着公共健康以及动物福利。

圆环病毒的基因组包含２个主要的阅读框（ＯＲＦ１、ＯＲＦ２），分别编码复制起始蛋白Ｒｅｐ、Ｒｅｐ＇和结构蛋白Ｃａｐ，Ｃａｐ蛋白是ＰＣＶ的主要保护性抗原蛋白，决定着病毒的抗原性，在疫苗的研发过程中起着十分重要的作用，同时Ｃａｐ蛋白还与病毒的毒力有关，与宿主蛋白之间也存在相互作用。

１　圆环病毒Ｃａｐ蛋白的结构特征在电子显微镜下，研究人员观察到了圆环病毒的Ｃａｐ蛋白大约由６０个亚基构成，Ｃｒｏｗｔｈｅｒ等〔２〕曾报道指出鸡传染性贫血病毒、猪圆环病毒及鹦鹉幼雏病病毒的Ｃａｐ蛋白结构不同。

另外，Ｋｈａｙａｔ等〔３〕通过大肠杆菌表达系统获得了Ｎ－末端截断的病毒颗粒（４０～２３１ａａ），通过Ｘ射线及低温电镜解析蛋白晶体结构发现，Ｃａｐ蛋白呈双层胶冻样，每一层由４个反平行的β链构成。

鸭圆环病毒Cap蛋白的原核表达

鸭圆环病毒Cap蛋白的原核表达粟艳琼;郑敏;莫胜兰;屈素洁;张步娴;梁媛【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2014(000)003【摘要】For the successful expression of duck circovirus Cap protein,using software Gene Designer 2.0,a codon optimized cap gene was designed in this study.The recombinant expression plasmid pET-32a-cap was transferred to BL21(DH3)competent cells.Following induction by 0.1mmol/L IPTG ,the bacteria were culture in 37℃ 250 r/min shake for 4 h.The result of SDS-PAGE analysis showed that the fusion Cap pro-tein with molecular bands of about 48 ku was successfully expressed in the form of inclusion body.Western blot proved that the fusion Cap protein could be specifically recognized by the His tag antibody.Finally, recombinant Cap protein was purified by using the NI-ION affinity purification colum,the recombinant pro-tein purity was 92.3%.The Cap protein lays a foundation for the serological detection.%为表达鸭圆环病毒（DuCV）Cap蛋白，通过Gene Designer 2．0软件对DuCV Cap基因进行分析和密码子优化，构建DuCV Cap基因重组表达质粒pET-32a-Cap，转化BL21（DH3）株感受态细胞。

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测方法奠定了基础。
关键词：鸭圆环病毒；Ｃａｐ蛋白；原核表达
中图分类号：Ｓ８５２．６５９．２文献标识码：Ａ文章编号：１００７ — ５０３８（２０１４）０３ — ００１９ — ０５
（广西壮族自治区动物疫病预防控制中心，广西南宁５３０００１）
摘要：为表达鸭圆环病毒（ＤｕＣＶ）Ｃａｐ蛋白，通过ＧｅｎｅＤｅｓｉｇｎｅｒ２．０软件对ＤｕＣＶＣａｐ基因进行分析
ｒｅｐ蛋白、ＯＲＦＣ１编码的Ｃａｐ蛋白（衣壳蛋白）、ＯＲＦＣ２编码的与细胞凋亡相关蛋白Ｈ］。其中Ｃａｐ

蛋白为衣壳的主要组成部分，起免疫保护性抗原作
用［５］。本研究在分析ＤｕＣＶＣａｐ蛋白基因特点的基础上，对Ｃａｐ基因进行了修饰和密码子优化，使
酶切位点，由宝生物生物工程（大连）有限公司全基
济损失。研制ＤｕＣＶ快速检测方法成为本病防控的
一
因合成，并克隆到ｐＵＣ１８载体上，命名为ｐＵＣ — Ｃａ — ｐＯｐｔｉ。分别用限制性内切酶ＢａｍＨＩ和Ｓａｌ工对质粒ｐＥＴ３２ａ和ｐＵＣ — ＣａｐＯｐｔｉ进行酶切，分别获得５．９ｋｂ的载体和７００ｂｐＣａｐ基因片段。将目的基因纯化回收后与ｐＥＴ－３２ａ（＋）载体连接，转化入
进行双酶切筛选阳性质粒。将阳性样品送宝生物工
程（大连）有限公司进行测序。
ＤｕＣＶＣａｐ融合蛋白获得了高效表达。
１．２．２ｐＥＴ一３２ａ — Ｃａｐ蛋白的诱导表达选取测序
正确的一个阳性重组质粒，转化入ＢＬ２１（ＤＥ３）株感受态细胞，利用Ａｍｐ抗性挑选单菌落，接种于５ｍＬ
自２００３年ＨａｔｔｅｒｍａｎｎＫ等ｌ＿】首次报道鸭圆环病毒（Ｄｕｃｋｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ，ＤｕＣＶ）以来，美国、德国、匈
牙利、我国台湾省相继发现了该病毒。近年来，中国大陆部分省市也报道了ＤｕＣＶ的流行］，本实验室
ＤＨ５ａ感受态细胞中，提取质粒。用限制性内切酶ＢａｍＨ工和Ｓａｌ工对阳性重组质粒ｐＥＴ一３２ａ — Ｃａｐ
个重要方面。研究表明，ＤｕＣＶ基因组结构中有３个主要结构蛋白，分别为ＯＲＦＶ１编码的与蛋白复制有关的
动物医学进展，２０１４，３５（３）：１９ — ２３
ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ
鸭圆环病毒Ｃａｐ蛋白的原核表达
粟艳琼，郑敏，莫胜兰，屈素洁，张步娴，梁媛
１材料与方法
１．１材料
２ ×ＹＴ（Ａｍｐ）培养液中，摇床培养至对数生长期加入终浓度为０．１ｍｍｏｌ／Ｌ的异丙基硫代一８一Ｄ半乳
１．２方法
１．２．１原核表达载体的构建
使用ＧｅｎｅＤｅｓｉｇｎｅｒ
２．０软件（ＤＮＡ２．０ｉｎｃ公司）对Ｃａｐ基因进行设计和密码子优化，删除Ｎ端连续碱性氨基酸，只保留Ｃ
和密码子优化，构建ＤｕＣＶＣａｐ基因重组表达质粒ｐＥＴ一３２ａ — Ｃａｐ，转化ＢＬ２１（ＤＨ３）株感受态细胞。用终浓度为０．１ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ进行诱导表达。ＳＤＳ — ＰＡＧＥ电泳分析显示Ｃａｐ融合蛋白的分子质量约为４８ｋｕ，表达的重组蛋白占菌体总蛋白的４３．１。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测显示该融合蛋白可以被针对Ｈｉｓ标签蛋白的抗体所识别。利用镍离子亲和纯化株对重组蛋白进行了纯化，纯度为９２．３。为进一步建立ＤｕＣＶ血清学检
于２０１０年首次报道了ＤｕＣＶ在广西的流行情况［３］。ＤｕＣＶ主要是侵害宿主的免疫系统，造成免疫功能
低下，进而易引发二重甚至多重感染，造成巨大的经
端部分序列（１０９ｎｔ～８７６ｎｔ），并在首尾分别加入ＢａｍＨＩ和ＳａｌＩ位点，且去除基因内部其余常见