电诱导细胞融合试剂盒
体外诊断试剂分类和常见产品技术原理及应用
体外诊断试剂的分类（三）
按照技术方法分： 1.比色法（颜色反应）；2.分光光度法； 3.凝集法；4.散射法（沉淀反应）； 5.透射比浊法（沉淀反应）；
6.速率法、终点法（产物或底物量）；
7.标记技术；8.生物亲和；9.免疫技术； 10.发光技术；11.荧光技术；12. 放射技术；
13.形态分析； 14.流式细胞；15.电泳技术；
普通生化类试剂（清洁环境）
★原理：与普通生化试剂（十万级要求）类相同。 ★产品涉及：无机离子检测、血气电解质类、血液分析仪用试剂类等试剂。
★ 工艺要求：除生产可在清洁环境中进行操作外，生产工艺和关键控制点与普通生化试剂（十万级要求）类相同。
（第十四类） 干化学类试剂
干化学试剂（条、卡或盒）：干化学尿液分析试纸条； 尿微量白蛋白（UALB）测试卡
常见的体外诊断产品技术原理及应用
在实际应用中，单一技术往往不能满足检测需要，因此，诊断试剂会联合使用多种技术。常见的体外诊断产品：
1.生化分析仪、生化试剂；
2.酶标仪、酶免试剂； 3.免疫化学发光仪及试剂；
4.胶体金（乳胶、荧光）免疫层析试剂；
5.血细胞分析仪、细胞检测试剂；
6.尿液分析仪、尿液检测试剂（试纸）；
注：*号的品种，预期用途为血源筛查时按药品受理和审评，为临床诊断时，按第三类医疗器械进行管理。
体外诊断试剂的分类（二）
二、 按医疗器械受理和审评的体外诊断试剂 ：
1、临床血液学和体液学检验试剂
2、临床化学检验试剂 3、临床免疫学检验试剂 。 4、微生物学检验试剂 5、组织细胞学检验试剂 6、变态反应、自身免疫诊断检验试剂（盒） 7、遗传性疾病检验试剂 8、分子生物学检验试剂 9、其它检验试剂（盒）
SOX5_对大鼠成骨细胞增殖及核因子-资B_信号通路的影响
[收稿日期]2021-08-25 [修回日期]2022-09-23[基金项目]湖北省卫生健康委2021-2022年度青年人才项目(WJ2021F032)[作者简介]冷冬月(1985-),女,硕士,主治医师.[文章编号]1000⁃2200(2024)02⁃0146⁃06㊃基础医学㊃SOX5对大鼠成骨细胞增殖及核因子⁃κB 信号通路的影响冷冬月1,李旭峰2,方兴刚1(1.湖北省十堰市太和医院中西医结合科,442000;2.湖北省十堰市人民医院中医科,442000)[摘要]目的:探究Y⁃box 蛋白5(SOX5)对大鼠成骨细胞(OB)增殖及核因子⁃κB(NF⁃κB)信号通路的影响㊂方法:取新生24h SPF 级SD 乳鼠,应用酶消化法分离大鼠颅骨OB㊂形态学观察和ALP 染色鉴定成骨细胞;取生长良好的第4代OB,分为空白对照组㊁pcDNA3.1组㊁pcDNA⁃SOX5组㊁si⁃NC 组㊁siRNA⁃SOX5组㊂转染48h 后qRT⁃PCR 检测细胞中SOX5mRNA 的表达;MTT 法检测细胞增殖活力;ALP 活性检测试剂盒测量ALP 活性;茜素红染色观察钙结节的形成情况;Western blotting 检测OB 分化及NF⁃κB 信号通路相关蛋白Runt 相关转录因子2(Runx2)㊁Ⅰ型胶原蛋白(Collagen Ⅰ)㊁NF⁃κB p65及其磷酸化蛋白㊁KB 抑制蛋白激酶α(IκBα)㊁肿瘤坏死因子α(TNF⁃α)的表达㊂结果:与空白对照组相比,pcDNA⁃SOX5组大鼠OB 中SOX5mRNA 水平㊁p⁃NF⁃κB p65/NF⁃κB p65㊁TNF⁃α蛋白表达显著升高(P <0.05),OB 增殖活力㊁ALP 活性㊁钙化结节数量和面积㊁Runx2㊁Collagen Ⅰ㊁IκBα表达显著降低(P <0.05);siRNA⁃SOX5组大鼠OB 中SOX5mRNA 水平㊁p⁃NF⁃κB p65/NF⁃κB p65㊁TNF⁃α蛋白表达明显降低(P <0.05),OB 增殖活力㊁ALP 活性㊁钙化结节数量和面积㊁Runx2㊁Collagen Ⅰ㊁IκBα表达明显升高(P <0.05)㊂结论:SOX5具有调控OB 增殖㊁分化的作用,其作用机制可能与调控NF⁃κB 信号通路有关㊂[关键词]骨质疏松;Y⁃box 蛋白5;成骨细胞;核因子⁃κB[中图法分类号]R 681 [文献标志码]A DOI :10.13898/ki.issn.1000⁃2200.2024.02.002Effects of SOX5on rat osteoblast proliferation and NF⁃κB signaling pathwayLENG Dongyue 1,LI Xufeng 2,FANG Xinggang 1(1.Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine ,Taihe Hospital ,Shiyan Hubei 442000;2.Department of Traditional Chinese Medicine ,Shiyan People′s Hospital ,Shiyan Hubei 442000,China )[Abstract ]Objective :To explore the effects of Y⁃box protein 5(SOX5)on rat osteoblasts (OB)proliferation and nuclear factor κB (NF⁃κB)signaling pathway.Methods :The newborn 24h SPF grade SD suckling rats were taken,and the OB of the rat skull was separated by enzyme digestion method.Morphological observation and ALP staining were used to identify osteoblasts.The fourth generation OBs with good growth were divided into blank control group,pcDNA3.1group,pcDNA⁃SOX5group,si⁃NC group,and siRNA⁃SOX5group.After 48h of transfection,qRT⁃PCR was used to detect the expression of SOX5mRNA in the cells;MTT method was used to detect cell proliferation viability;ALP activity detection kit was used to measure ALP activity;alizarin red staining was used to observe the formation of calcium nodules;Western blotting was used to detect OB differentiation and the expression of NF⁃κB signaling pathway⁃related proteins [Runt⁃related transcription factor 2(Runx2),type Ⅰcollagen (collagen Ⅰ),nuclear factor κB p65(NF⁃κB p65)and its phosphorylated protein,KB inhibits protein kinase α(IκBα),tumor necrosis factor α(TNF⁃α)].Results :Compared with the blank control group,the SOX5mRNA level,p⁃NF⁃κB p65/NF⁃κB p65,and TNF⁃αproteins expression in the OB of rats in the pcDNA⁃SOX5group were significantly increased (P <0.05),the OB proliferation activity,ALP activity,the number and area of calcified nodules,Runx2,collagen Ⅰ,and IκBαexpression were significantly reduced (P <0.05);the SOX5mRNA level,p⁃NF⁃κBp65/NF⁃κB p65,and TNF⁃αproteins expression in the OB of rats in the siRNA⁃SOX5group were significantly reduced (P <0.05),the OB proliferation activity,ALP activity,the number and area of calcified nodules,Runx2,collagen Ⅰ,and IκBαexpression were significantly increased (P <0.05).Conclusions :SOX5can regulate the proliferation and differentiation of OB,and its mechanism may be related to the regulation of NF⁃κB signaling pathway.[Key words ]osteoporosis;Y⁃box protein 5;osteoblasts;nuclear factor⁃κB 骨质疏松症(OP)是一种骨代谢疾病,其特征在于骨量下降,伴随着骨组织和微结构的恶化以及骨矿物质密度的下降[1]㊂在OP 中,骨形成与吸收之间的不平衡最终导致了骨的变性和易骨折[2]㊂成骨细胞(osteoblasts,OB)是一类特殊的具有成骨潜能的细胞,在骨重建及骨稳态维持中都发挥着重要的作用[3];OB活性下降是OP的主要原因[4]㊂Y⁃box蛋白5(SOX5)是SOX家族SoxD组的成员,编码控制细胞命运的各种转录因子并在许多谱系中进行分化,包括神经元㊁软骨细胞和B细胞[5-7]㊂研究[8-9]表明SOX5与类风湿关节炎和软骨形成密切相关,是治疗绝经后OP的有希望的分子靶标㊂已经在卵巢切除小鼠的骨髓细胞中发现了差异表达的SOX5;且与绝经前健康女性的骨髓样本相比,绝经后OP病人骨髓中SOX5的mRNA和蛋白表达水平显著上调;SOX5过表达可抑制人间充质干细胞的成骨分化[10]㊂而SOX5对OB增殖的分子功能及作用机制尚不明确;因此,本研究以大鼠OB为对象,探讨SOX5对OB增殖的影响及其潜在的作用机制,为OP的治疗及药物开发提供参考㊂1 材料与方法1.1 实验材料 出生24h的SPF级SD乳鼠10只,雌雄不限,质量(10±3)g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,许可证为SCXK(京)2019⁃0009㊂饲养温度(20±2)℃,相对湿度为45%~60%㊂胎牛血清㊁胰蛋白酶㊁RPMI1640培养基均购自美国GIBCO公司;TRIzol RNA分离试剂及SYBR®Premix Ex Taq TM 试剂盒均购买于日本TaKaRa公司;Lipofectamine TM 2000转染试剂盒购自美国Thermo公司;pcDNA⁃SOX5和pcDNA3.1载体㊁siRNA⁃SOX5和其阴性对照(si⁃NC)以及PCR引物序列由上海GenePharma 公司设计合成;氯化十六烷基吡啶鎓(美国Sigma⁃Aldrich,货号:C9002);碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)检测试剂盒(P0321S)㊁MTT试剂盒(C0009S)购自碧云天生物科技公司;茜素红染色试剂(北京索莱宝科技有限公司,货号:G8550);兔抗大鼠Runt相关转录因子2(runt⁃related transcription factor2,Runx2)(ab236639)㊁Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)(ab270993)㊁核因子⁃κB p65 (nuclear factor kappa⁃B p65,NF⁃κB p65) (ab16502)㊁p⁃NF⁃κB p65(ab76302)㊁肿瘤坏死因子α(TNF⁃α)(ab205587)㊁KB抑制蛋白激酶α(KB inhibits protein kinaseα,IκBα)(ab109300)㊁山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab205718)㊁β⁃actin(ab8227)均购自英国abcam公司㊂细胞培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司);ABI Prism®7300型荧光定量PCR系统(美国);倒置荧光显微镜(IX73,购自日本Olympus公司);iMark680多功能酶标仪㊁蛋白转膜装置购自美国Bio⁃Rad公司㊂1.2 成骨细胞的分离、鉴定 应用酶消化法分离大鼠颅骨成骨细胞[11]㊂取新生24h内SD乳鼠,处死后,乙醇浸泡5min,在无菌条件下,取出头盖骨,PBS冲洗后切成1mm3的骨颗粒,37℃水浴中用0.1%的胶原酶以1∶10的比例将骨颗粒消化分离20min,然后再次用胶原酶分离约1h㊂将分离获得的悬浮液以1200r/min离心,去上清液,用PBS漂洗3次,并加入含有15%胎牛血清㊁青霉素(100U/mL)和链霉素(100U/mL)的培养液㊂在37℃㊁5%CO2下孵育,1周换液2次,待细胞融合约80%时传代,换用成骨诱导培养基(基础培养基+50μg/mL维生素C+10mmol/Lβ⁃甘油磷酸钠+10nmol/L地塞米松)㊂取第3代细胞通过ALP染色和形态观察行成骨细胞鉴定,取生长良好的第4代细胞用于实验㊂鉴定成骨细胞:(1)形态学观察:在倒置相差显微镜下观察原代和继代培养成骨细胞的生长和形态变化,并在随机选择的视野中拍照㊂(2)ALP染色:将第3代的成骨细胞培养7d,并参照ALP染色试剂盒的说明进行ALP染色㊂去除成骨细胞的培养基,PBS清洗细胞2~3次,并用4%多聚甲醛固定10min㊂清洗后加入300μL显色液,避光于37℃的培养箱中孵育2h,显微镜下观察㊂1.3 分组及转染 取生长良好的第4代成骨细胞,按每孔2×106个接种于24孔板,分成5个处理组:(1)空白对照组,不进行任何转染;(2)pcDNA3.1组,用Lipofectamine2000按照说明书将100nmol/L pcDNA3.1转染至成骨细胞;(3)pcDNA⁃SOX5组,用Lipofectamine2000按照说明书将100nmol/L pcDNA⁃SOX5转染至成骨细胞;(4)si⁃NC组,将si⁃NC转染至成骨细胞;(5)siRNA⁃SOX5组,将siRNA⁃SOX5转染至成骨细胞㊂转染48h后收获细胞以进行后续实验㊂1.4 qRT⁃PCR检测细胞中SOX5mRNA的表达 使用TRIzol试剂提取细胞总RNA,使用分光光度计测量总RNA的浓度㊂按照试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA,进行PCR扩增(见表1)㊂反应体系(20μL):cDNA(200ng/μL)2μL,SYBR®Premix Ex Taq TM(2×)10μL,上下游引物各0.4μL,ddH2O7.2μL㊂循环条件:94℃持续10min,然后在94℃持续10s,60℃持续20s和72℃持续1min进行40个循环㊂用β⁃actin作为对照,相对SOX5mRNA的表达量采用2-ΔΔCt方法计算㊂表1 RT⁃PCR引物序列基因引物序列SOX5F:5′⁃CAG CCA GAG TTA GCA CAA TAG G⁃3′R:5′⁃CTG TTG TTC CCG TCG GAG TT⁃3′β⁃actinF:5′⁃TTG CGT TAC ACC CTT TCT TG⁃3′R:5′⁃TGT CAC CTT CAC CGT TCC A⁃3′1.5 MTT法检测细胞增殖活力 转染48h后将成骨细胞以2×103细胞/孔的浓度接种到96孔板中,继续培养24h,然后每孔中加入20μL的MTT溶液(5mg/mL),于培养箱中孵育4h,吸去上层清液后加入150μL的DMSO, 490nm波长处测定各孔吸光度值(OD),计算细胞增殖率㊂细胞增殖率=(实验组OD值-空白孔OD 值)/(对照组OD值-空白孔OD值)×100%㊂1.6 ALP活性测定 ALP是成骨细胞分化的早期标志㊂将转染的成骨细胞用成骨培养基培养7d㊂然后,除去OM培养基,并使用0.1%TritonX⁃100裂解细胞获得细胞裂解液,然后12000g离心10min,取上清液为样品㊂使用ALP活性检测试剂盒测量上清液中ALP活性㊂于405nm处测定各组OD值,使用对硝基苯酚绘制标准曲线;另用BCA法测定每个样品的总蛋白浓度㊂并将每个样品的ALP活性标准化为相应的总蛋白含量㊂1.7 茜素红染色 采用茜素红染色观察钙结节的形成数量,评估成骨细胞的矿化能力㊂成骨细胞按1.3方法进行分组处理,转染后将细胞培养2周,弃去培养液,细胞用PBS洗涤2次,并在室温下用4%多聚甲醛固定30min㊂弃去多聚甲醛,PBS洗涤后在37℃下用0.1%茜素红染液染色1h㊂倒置光学显微镜下观察图像并拍照,并使用Image⁃Pro Plus6.0软件统计钙化结节染色阳性区域的面积和数量㊂1.8 Western blotting检测成骨细胞NF⁃κB信号通路相关蛋白的表达 使用RIPA裂解液提取细胞中蛋白质㊂使用BCA试剂盒对蛋白质浓度进行定量㊂取等量蛋白质样品上样(每泳道30μg),10%SDS⁃PAGE分离蛋白质,并通过半干转移将其转移到PVDF膜上㊂将膜用5%脱脂牛奶封闭,并在4℃下与一抗(Runx2㊁CollagenⅠ㊁NF⁃κB p65㊁p⁃NF⁃κB p65㊁TNF⁃α㊁IκBα㊁β⁃actin,1∶1000)孵育过夜㊂第2天,将膜与偶联辣根过氧化物酶的二抗孵育(1∶2000)2h,然后使用化学发光试剂盒(ECL)进行显色㊂以β⁃actin为内参,分析结果㊂1.9 统计学方法 以上所有实验均重复3次㊂采用单因素方差分析(One⁃way ANOVA),Tukey的事后检验用于单因素方差分析后的成对比较㊂2 结果2.1 成骨细胞原代培养和鉴定 原代培养第3天,倒置相差显微镜下见成骨细胞从碎骨块周围爬出,呈放射状贴壁生长,形态不规则,呈多边形或三角形,有较多突起,单核卵圆形, 1~2个核仁,胞质丰富清晰,ALP染色呈阳性,蓝黑色颗粒沉积在细胞质及细胞核ALP活性部位(见图1)㊂2.2 各组成骨细胞中SOX5mRNA的表达 与空白对照组相比,pcDNA⁃SOX5组大鼠OB 中SOX5mRNA水平显著升高(P<0.05),siRNA⁃SOX5组大鼠OB中SOX5mRNA水平明显降低(P <0.05)(见表2)㊂表2 各组大鼠OB中SOX5mRNA水平比较(x±s;n i=3)分组SOX5mRNA空白对照组 1.00±0.00 pcDNA3.1组 1.02±0.01 pcDNA⁃SOX5组 4.65±0.37*si⁃NC组 1.01±0.01 siRNA⁃SOX5组0.41±0.05* F315.94 P<0.01 MS组内0.028 q检验:与空白对照组比较*P<0.052.3 各组成骨细胞增殖活力 与空白对照组相比,pcDNA⁃SOX5组大鼠OB增殖活力显著降低(P <0.05),siRNA⁃SOX5组大鼠OB 增殖活力明显升高(P <0.05)(见表3)㊂表3 各组大鼠OB 增殖活力比较(x ±s ;n i =3)分组增殖率/%空白对照组100.00±0.00pcDNA3.1组102.13±10.01pcDNA⁃SOX5组64.75±6.16*si⁃NC 组104.06±9.31siRNA⁃SOX5组137.31±7.42* F144.83 P<0.01 MS 组内55.976 q 检验:与空白对照组比较*P <0.052.4 各组成骨细胞ALP 活性 与空白对照组相比,pcDNA⁃SOX5组大鼠OB中ALP 活性显著降低(P <0.05),siRNA⁃SOX5组大鼠OB 中ALP 活性明显升高(P <0.05)(见表4)㊂表4 各组大鼠OB 中ALP 活性比较(x ±s ;n i =3)分组ALP 活性空白对照组 1.00±0.00pcDNA3.1组 1.03±0.08pcDNA⁃SOX5组0.75±0.05*si⁃NC 组 1.02±0.06siRNA⁃SOX5组1.54±0.09* F 60.49 P<0.01 MS 组内0.004 q 检验:与空白对照组比较*P <0.052.5 各组成骨细胞钙结节形成情况 倒置显微镜下观察可见细胞呈多层重叠生长,各组细胞间均可见橘红色钙化结节;与空白对照组相比,pcDNA⁃SOX5组大鼠OB 钙化结节数量和面积显著降低(P <0.05),siRNA⁃SOX5组大鼠OB 钙化结节数量和面积明显增加(P <0.05)(见图2㊁表5)㊂2.6 各组成骨细胞分化及NF⁃κB 信号通路相关蛋白的表达 与空白对照组相比,pcDNA⁃SOX5组大鼠OB 中p⁃NF⁃κB p65/NF⁃κB p65㊁TNF⁃α蛋白表达显著升高,Runx2㊁Collagen Ⅰ㊁IκBα表达显著降低(P <0.05),siRNA⁃SOX5组大鼠OB 中p⁃NF⁃κB p65/NF⁃κB p65㊁TNF⁃α蛋白表达明显降低,Runx2㊁Collagen Ⅰ㊁IκBα表达明显增加(P <0.05)(见图3㊁表6)㊂3 讨论 OB 是骨形成的主要功能单位,负责骨骼重塑过程中骨骼基质的合成㊁分泌和矿化㊂OB 在维持骨量和减少骨质流失中起关键作用㊂刺激OB 增殖并促进其分化成熟是调节骨代谢㊁促进新骨形成㊁修复骨缺损的重要方法[12]㊂MTT 法是检测细胞增殖的指标,可以反映生活细胞的代谢水平㊂本研究采用MTT 法检测SOX5对OB 增殖活性的影响,结果显示SOX5mRNA 过表达后,对体外培养的OB 增殖有明显的抑制作用,而采用siRNA 技术干扰SOX5的表达后,OB 增殖率明显增加;表明沉默SOX5具有促进OB 增殖的作用㊂ OB 的增殖通常通过测量细胞总蛋白㊁ALP 活性和Collagen Ⅰ分泌来评估㊂ALP 是OB 分泌的一组膜结合糖蛋白,是OB 早期分化的特异性标志,ALP 活性的高低,能较客观地反映OB 分化成熟的程度[13]㊂Runx2㊁Collagen Ⅰ是OB 相关的蛋白,在成骨分化活动中起重要的促进作用[4],在增殖阶段,OB 分泌Collagen I 以帮助矿化并减少骨质流失㊂OB 分化成熟后多层重叠生长形成结节样结构,并不断分泌基质和矿物质,形成矿化结节㊂茜素红染色可以评估成骨分化晚期细胞外基质矿化情况钙化结节的形成情况[14]㊂本实验中,将转染的OB 用成骨培养基培养7d 后,通过ALP 活性检测了SOX5对OB 分化的影响,结果显示SOX5过表达后,ALP 活性值较低,OB 钙化结节数量和面积降低,且Runx2㊁Collagen Ⅰ表达减少,分析可能与细胞增殖㊁分化受到抑制有关;而SOX5mRNA 表达下调时,ALP 活性㊁细胞钙化程度及Runx2㊁CollagenⅠ表达增加㊂分析沉默SOX5促进成骨细胞ALP活性的原因可能是:(1)与促进细胞增殖有关,OB数量的增加,分泌的ALP也随之增加;(2)上调ALP mRNA表达水平,促进ALP的分泌,调节OB的分化㊂表5 各组大鼠OB钙结节形成情况(x±s;n i=3)分组钙化结节数量钙化结节面积/mm2空白对照组898.62±51.4360.54±5.71 pcDNA3.1组901.05±72.6161.12±5.63 pcDNA⁃SOX5组616.47±60.54*33.28±4.17* si⁃NC组895.09±58.3062.35±4.24 siRNA⁃SOX5组1174.81±73.42*89.76±6.79* F28.7041.08 P<0.01<0.01 MS组内4074.34729.154 q检验:与空白对照组比较*P<0.05表6 各组大鼠OB分化及NF⁃κB信号通路相关蛋白的表达(x±s;n i=3)分组Runx2CollagenⅠ p⁃NF⁃κB p65/NF⁃κB p65 IκBαTNF⁃α空白对照组0.98±0.10 1.12±0.11 0.49±0.04 0.89±0.080.32±0.02 pcDNA3.1组 1.01±0.09 1.10±0.10*0.51±0.050.91±0.070.31±0.03 pcDNA⁃SOX5组0.66±0.07*0.74±0.07* 1.28±0.11*0.40±0.05*0.87±0.06* si⁃NC组0.99±0.06 1.08±0.090.52±0.070.88±0.040.34±0.04 siRNA⁃SOX5组 1.25±0.08* 1.31±0.12*0.33±0.04* 1.22±0.06*0.16±0.03* F20.0312.8892.2768.09150.30 P<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01 MS组内0.0070.0100.0050.0040.001 q检验:与空白对照组比较*P<0.05 NF⁃κB控制主要骨骼细胞类型(破骨细胞[15]㊁成骨细胞[16]和软骨细胞[17])的分化或活性㊂生理和病理性骨重塑的刺激都会影响NF⁃κB信号转导[18];NF⁃κB的启动子活性主要是由核移位和NF⁃κB磷酸化引起[19]㊂在静息细胞中,NF⁃κB以NF?κB/IκBα复合物的形式存在于细胞质;在病理条件下,刺激激活核因子抑制剂IκB激酶(IκB kinases, IKKs),该激酶通过靶向将IκBα蛋白降解,释放NF⁃κB并允许其核移位和DNA结合,促进TNF⁃α㊁IL⁃1β等炎性因子的表达,减少骨细胞形成,使OB增殖㊁分化能力降低㊂研究发现NF⁃κB的激活下调OB分化[20];抑制IκBα的降解,稳定NF⁃κB/IκBα复合物,可抑制NF⁃κB的活化,减少炎性因子的释放[21-22]㊂HUANG等[23]发现在人牙槽骨OB分化中,三七皂苷R1可通过抑制NF⁃κB通路,逆转TNF⁃α诱导的钙结节和ALP活性的降低㊂杨青坡等[24]发现姜黄素能降低骨组织中NF⁃κB表达,明显改善OP大鼠骨密度㊂在本研究中,我们通过pcDNA3.1质粒转染构建SOX5过表达OB,发现大鼠OB中磷酸化NF⁃κB p65㊁TNF⁃α蛋白表达升高, IκBα表达降低,说明NF⁃κB信号通路被激活;而沉默SOX5的表达后,IκBα表达增加,磷酸化NF⁃κB p65㊁TNF⁃α表达降低,提示NF⁃κB信号通路被抑制㊂综上所述,沉默SOX5具有促进OB增殖的作用,并可调节OB的分化,其作用机制可能与抑制NF⁃κB信号通路的激活有关,过表达SOX5则发挥相反作用㊂但本研究尚存在一定不足,未对NF⁃κB 信号通路进行干扰从反面进行验证;此外,由于体内外环境的巨大差异,在体内沉默SOX5是否发挥相同的作用,有待进一步研究㊂[参考文献][1] MENG YC,LIN T,JIANG H,et al.miR⁃122exerts inhibitoryeffects on osteoblast proliferation/differentiation in osteoporosis byactivating the PCP4⁃Mediated JNK pathway[J].Mol Ther NucleicAcids,2020,20:345.[2] 杨菁,聂子淮,滕斌,等.基于FRAX风险评估的分层管理在社区老年骨质疏松症病人中的应用研究[J].蚌埠医学院学报,2022,47(2):254.[3] CHOTIYARNWONG P,MCCLOSKEY EV.Pathogenesis ofglucocorticoid⁃induced osteoporosis and options for treatment[J].Nat Rev Endocrinol,2020,16(8):437.[4] HUANG M,LI X,ZHOU C,et al.Noncoding RNA miR⁃205⁃5pmediates osteoporosis pathogenesis and osteoblast differentiationby regulating RUNX2[J].J Cell Biochem,2020,121(10):4196.[5] ZAWERTON A,MIGNOT C,SIGAFOOS A,et al.Widening ofthe genetic and clinical spectrum of lamb⁃shaffer syndrome,aneurodevelopmental disorder due to SOX5haploinsufficiency[J].Genet Med,2020,22(3):524.[6] LIU F,LIU X,YANG Y,et al.NEAT1/miR⁃193a⁃3p/SOX5axisregulates cartilage matrix degradation in human osteoarthritis[J].Cell Biol 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[24] 杨青坡,穆合塔尔㊃买买提热夏提,王法正,等.姜黄素联合有氧运动对骨质疏松大鼠骨密度㊁氧化应激能力及骨组织NF⁃κB的影响[J].中国骨质疏松杂志,2021,27(1):55.(本文编辑 刘梦楠)。
HA标签融合蛋白纯化试剂盒
HA标签（YPYDVPDYA）融合蛋白纯化试剂盒Cat#：KAP0063（本品仅用于科学研究，不可用于诊断及治疗）1.背景信息HA-Tag（YPYDVPDYA），常用于真核蛋白质重组表达标记。
HA标签（YPYDVPDYA）融合蛋白纯化试剂盒，主要成分是Anti-HA亲和纯化凝胶（Anti-YPYDVPDYA (HA) Affinity Gel），由高品质的HA兔多克隆抗体与Sepharose 4B琼脂糖颗粒共价偶联制成，具有高载量（至少为1.2mg protein/ml 凝胶），高特异性，性质稳定，可反复使用的特点，可用于HA标签融合蛋白的亲和纯化。
2.性能指标应用范围：可用于Met修饰的N端HA融合蛋白（Met-HA–Protein），N端HA融合蛋白（HA–Protein），C端HA融合蛋白（Protein-HA）及中部HA融合蛋白的亲和纯化。
载量：1ml Sepharose 4B琼脂糖颗粒，共价偶联800μg Anti-HA 兔多克隆抗体，可结合至少1.2mg HA融合蛋白。
强度：重力柱纯化，可反复使用5次以上。
保存方法：在加入了50%甘油和0.2‰叠氮钠的PBS保存液后，预装纯化柱可于-20℃可保存1年。
3.试剂盒组成-100（说明见5.3）注意事项（开箱前必读）3.1本试剂盒冷藏条件下运输，如果暂时不用，请将纯化柱（空柱）取出，室温保存；亲和凝胶于-20℃保存；试剂盒及其它成分保存于4℃。
3.2HA peptide溶解方法：该多肽为轻质粉末，开盖前应离心。
建议将40ul 10xPBS溶液加至1mg多肽粉末中，彻底溶解后，加入160ul双蒸水，制成5mg/ml储存液，-20℃保存。
使用时用1xPBS稀释至需要的浓度。
按需求浓度稀释至工作浓度。
3.3有文献显示，与传统的Glycine-HCl洗脱液相比，本试剂盒提供的pH3.0的Arginine-HCl做为洗脱液，可以减少蛋白质变性，延长抗体亲和纯化柱的使用寿命。
蛋白质转染技术制备方法
蛋白质转染技术是一种将表达出的目标蛋白直接转入细胞的过程。
这个过程中，通常会用到辅助蛋白或构建融合蛋白来帮助目标蛋白进入细胞质。
转染方法通常是共孵育。
具体制备方法如下：
1.准备实验材料，包括细胞（如鼠成纤维细胞）、试剂和试剂盒（如丙戊酸培养液）、仪器和耗材
（如培养皿、移液枪和枪头等）。
2.将目标蛋白（如重组重新编程蛋白质，包括Oct4-11R、Sox2-11R、Klf4-11R和c-Myc-11R）
与培养基混合，并可能添加其他辅助剂（如丙戊酸和HDAC抑制剂）来提高编程效率。
3.将处理过的细胞在特定条件下培养一段时间（如36小时），使目标蛋白有机会进入细胞并发挥
作用。
4.在完成多次（如四次）蛋白转导后，处理过的细胞可能需要进行后续处理，如转移到其他类型的
细胞上，并在特定培养基中保存和扩增。
另外，值得注意的是，由于蛋白质转染技术并不涉及基因的导入，因此它只适用于瞬时转染，即目标蛋白的作用会在一段时间后消失。
如果需要长期的蛋白表达，可能需要考虑其他方法，如基因转染。
此外，对于蛋白质转染，也有一些专门的试剂，如PULSinTM，这是一种由Polyplus Transfection公司开发的新型转染试剂，它可以通过正电荷外衣包裹许多蛋白质/抗体，使其能够有效地转染到活细胞中。
PEG诱导细胞融合
科目细胞生物学实验实验题目动物细胞融合日期姓名*** 系年级2011级生物基地学号***实验一利用聚乙二醇为媒介物进行细胞融合摘要细胞融合(cell fusion)是在自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。
基本过程包括细胞融合形成异核体(heterokaryon)、异核体通过细胞有丝分裂进行核融合、最终形成单核的杂种细胞。
诱导细胞融合的方法有三种：生物方法（病毒）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（离心，震动，电刺激）。
某些病毒如：仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒的被膜中有融合蛋白（fusion protein），可介导病毒同宿主细胞融合，也可介导细胞与细胞的融合，因此可以用紫外线灭活的此类病毒诱导细胞融合。
化学和物理方法可造成膜脂分子排列的改变，去掉作用因素之后，质膜恢复原有的有序结构，在恢复过程中便可诱导相接触的细胞发生融合。
关键词细胞融合；人工诱导；PEG前言人工诱导的细胞融合，在六十年代作为一门新兴技术而发展起来。
由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。
基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体（homokaryon）；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体（heterokaryon）。
细胞融合不仅可用于基础研究，而且还有重要的应用价值，在植物育种方面已经成功的有萝卜+甘蓝、粉蓝烟草+郎氏烟草、番茄+马铃薯等等。
细胞融合另一个重要应用就是制备单克隆抗体，单克隆抗体可以用作诊断试剂，治疗疾病和运载药物，具有准确，高效，简易，快速等优点。
因此，融合细胞的研究为生物学无论在基础理论上或生产实践上开辟了一条新的道路。
这一技术已成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手段。
一．实验目的1.了解动物细胞融合的常用方法及原理。
2.掌握利用PEG为介导物对细胞进行诱导融合的方法。
高中生物选择性必修三 学习笔记 第2章 第2节 第2课时 动物细胞融合技术与单克隆抗体
第2课时 动物细胞融合技术与单克隆抗体[学习目标] 1.阐明动物细胞融合技术的概念，举例说出诱导动物细胞融合的方法。
2.概述单克隆抗体的制备过程。
一、动物细胞融合技术1．概念：使________或________动物细胞结合形成________的技术。
2．原理：________________。
3．诱导融合的方法⎩⎪⎨⎪⎧PEG 融合法 法法4．意义：细胞融合技术突破了________的局限，使________成为可能。
5．应用(1)成为研究细胞________、细胞________、肿瘤和培育________等的重要手段。
(2)用于制造________。
判断正误(1)与植物原生质体融合相比，动物细胞融合特有的诱导因素有聚乙二醇(PEG)、灭活的病毒( )(2)灭活的含义是用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构( )任务一：动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较1．19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中，观察到多核细胞。
如何解释这一现象？2．比较动物细胞融合技术和植物体细胞杂交技术(1)动物细胞融合和植物体细胞杂交技术的原理分别是什么？(2)两者在方法上有什么异同？(3)两者在最终结果上有什么不同？1．(2022·天津市高二月考)如图表示仙台病毒诱导动物细胞融合的部分过程，下列叙述正确的是()A．细胞A和细胞B必须为同种细胞才能融合B．细胞C同时有细胞A和细胞B的遗传物质C．该融合过程体现了细胞膜具有选择透过性D．此过程的原理是动物细胞具有全能性2．对比动物细胞融合和植物体细胞杂交技术，下列论述合理的是()A．均可使用PEG、电融合或灭活病毒诱导细胞融合B．两者都可以跨越种属间的生殖隔离C．两者都可以体现细胞的全能性D．在适宜的条件下，均可产生完整个体二、单克隆抗体及其应用1．传统抗体的获得(1)方法：向动物体内反复注射某种______，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需________。
OriCell-MUXMT-90031-说明书.pdf OriCell-小鼠 MC3T3-E1 细胞
细胞产品手册OriCell®小鼠MC3T3-E1细胞成脂诱导分化试剂盒产品货号：MUXMT-90031由OriCell®研发团队精心研制的OriCell®小鼠MC3T3-E1细胞成脂诱导分化试剂盒，包含适合小鼠MC3T3-E1细胞生长的基础培养基、OriCell®优级胎牛血清及诱导细胞分化所需的多种添加物。
本产品适用于小鼠MC3T3-E1细胞的成脂诱导分化。
大量细胞培养数据验证，本产品可稳定、高效诱导上述细胞分化为成脂细胞。
注意：本产品仅提供给进一步科研使用，不可用于临床治疗等其他用途。
试剂盒成分小鼠MC3T3-E1细胞成脂诱导分化试剂盒A液成分货号体积OriCell®Basal Medium For Cell CultureOriCell®细胞基础培养基BLDM-03011177mL OriCell®Fetal Bovine Serum（Superior-Quality）FBSSR-0102120mL OriCell®优级胎牛血清OriCell®Supplement For Mouse MC3T3-E1Cells AdipogenicDifferentiation A-IMUXMT-04031-a13mL OriCell®小鼠MC3T3-E1细胞成脂诱导分化添加物A-IOriCell®Supplement For Mouse MC3T3-E1Cells AdipogenicDifferentiation A-IIMUXMT-04031-a2200μL OriCell®小鼠MC3T3-E1细胞成脂诱导分化添加物A-II小鼠MC3T3-E1细胞成脂诱导分化试剂盒B液成分货号体积OriCell®Basal Medium For Cell CultureOriCell®细胞基础培养基BLDM-0301190mL OriCell®Fetal Bovine Serum（Superior-Quality）FBSSR-0102110mL OriCell®优级胎牛血清OriCell®Supplement For Mouse MC3T3-E1Cells AdipogenicDifferentiation BMUXMT-04031-b200μL OriCell®小鼠MC3T3-E1细胞成脂诱导分化添加物B其他成分货号体积Oil Red O Solultion油红O（pH=2.1）OILR-100015mL Gelatin明胶GLT-1130110mL●通过细菌、真菌、支原体、内毒素检测。
样本细胞凋亡实验报告(3篇)
第1篇一、实验背景细胞凋亡是细胞程序性死亡的过程，是生物体内重要的细胞生物学现象之一。
细胞凋亡在维持生物体内细胞数量的动态平衡、清除异常细胞以及抵御病原体入侵等方面发挥着至关重要的作用。
本研究旨在通过实验方法检测细胞凋亡的发生，探讨细胞凋亡在特定条件下的生物学意义。
二、实验目的1. 探讨细胞凋亡在特定条件下的发生机制。
2. 检测细胞凋亡的发生，并分析其与细胞增殖的关系。
3. 研究细胞凋亡在生物体内的生理和病理作用。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：细胞培养液、细胞裂解液、Annexin V-FITC/PI染色试剂盒、流式细胞仪等。
2. 实验仪器：细胞培养箱、显微镜、离心机、流式细胞仪等。
四、实验方法1. 细胞培养：将细胞接种于细胞培养瓶中，置于细胞培养箱中培养至对数生长期。
2. 处理细胞：将细胞分为实验组和对照组，实验组给予特定处理，对照组不做处理。
3. 细胞裂解：将细胞用细胞裂解液裂解，收集细胞裂解液。
4. Annexin V-FITC/PI染色：将细胞裂解液与Annexin V-FITC/PI染色试剂盒混合，室温避光孵育。
5. 流式细胞术检测：将染色后的细胞用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
五、实验结果1. 实验组细胞凋亡率显著高于对照组（P<0.05），表明特定处理可以诱导细胞凋亡。
2. Annexin V-FITC染色结果显示，实验组细胞膜上磷脂酰丝氨酸（PS）外翻，表明细胞凋亡早期发生。
3. PI染色结果显示，实验组细胞核DNA降解，形成DNA ladder，表明细胞凋亡晚期发生。
六、实验讨论1. 本实验结果表明，特定处理可以诱导细胞凋亡，提示细胞凋亡在特定条件下受到严格调控。
2. Annexin V-FITC染色和PI染色结果显示，细胞凋亡过程分为早期和晚期两个阶段。
早期阶段，细胞膜上PS外翻，细胞膜完整；晚期阶段，细胞核DNA降解，细胞膜通透性增加。
3. 细胞凋亡在生物体内具有重要作用。
一种Ph-like急性淋巴细胞白血病融合基因及其应用和检测试剂盒[发明专利]
![一种Ph-like急性淋巴细胞白血病融合基因及其应用和检测试剂盒[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/a7effa044afe04a1b171de8e.png)
专利名称：一种Ph-like急性淋巴细胞白血病融合基因及其应用和检测试剂盒
专利类型：发明专利
发明人：闫金松,卢莹,张学红,黄丹,侯志杰,娄佳成,王海娜,刘强
申请号：CN202011192505.4
申请日：20201030
公开号：CN112210568A
公开日：
20210112
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供一种Ph‑like急性淋巴细胞白血病融合基因及其应用和检测试剂盒，所述融合基因为TPR‑PDGFRB。
本发明中首先发现、鉴定了急淋巴细胞白血病中存在新融合基因
TPR‑PDGFRB，评估认为TPR‑PDGFRB可以作为急性淋巴细胞白血病的特异性分子标志物，进而开发了一款临床上可用于诊断、检测患者微小残留病(MRD)的试剂盒。
试剂盒利用Taqman探针实时荧光PCR对白血病患者体内TPR‑PDGFRB融合基因进行绝对定量，其检测特异性好、灵敏度高、方法简便高效、成本低廉，能够满足临床上的诊疗需求。
申请人：大连医科大学附属第二医院
地址：116027 辽宁省大连市中山路467号
国籍：CN
代理机构：上海盈盛知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：孙佳胤
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GST Bind 纯化试剂盒 产品说明书
BugBuster Master Mix（货号71456）是将BugBuster蛋白抽提试剂，Benzonase核酸酶和rLysozyme™ 溶菌酶溶液按最优化配比混合好的一种非常方便使用的蛋白抽提试剂，有助于在最优化条件下获得可溶 活性蛋白。这种预混形式的试剂减少了稀释试剂、计算各种试剂使用量和分别添加的麻烦。100ml和 500ml包装分别足够用于20g和100g细胞沉淀的可溶蛋白抽提。
GST•Bind™ 缓冲液试剂盒
GST•Bind缓冲液试剂盒包括了从GST•Bind树脂和GST•Mag™磁性琼脂糖树脂纯化目的蛋白所需的结 合，冲洗和洗脱所需的缓冲液。试剂盒所含成分足够用于10个2.5ml柱的纯化。具体包括： • 2×100ml 10×GST Bind/Wash Buffer （43mM Na2HPO4，14.7mM KH2PO4，1.37M NaCl，27mM KCl，pH7.3） • 40ml 10×Glutathione Reconstitution Buffer (500mM Tris-HCl，pH8.0) • 1g Glutathione，Reduced，Free Acid
机械破碎法
可溶组分 这部分操作用于分离大肠杆菌可溶组分中的蛋白。用去离子水稀释试剂盒中的10×浓缩液制备1X GST Bind/Wash Buffer。 1. 10,000g离心5分钟收集细胞。倾去上清，尽量控干细胞沉淀。每100ml培养液的细胞用4ml冰冷的1X GST Bind/Wash Buffer重悬。可以加入终浓度为0.1%的NP-40或其它非离子去污剂以减少非特异性结 合。可以用Dounce匀浆器，搅拌器或超声波仪打散细胞沉淀。 2. 在冰浴或盐冰浴中超声波处理样本。根据厂家说明操作，避免长时间超声处理。如果样本已经不再粘 稠即可停止超声。如果DNA没有剪切好会因样品粘稠而堵住柱子。大的细胞块可以在1×GST Bind/Wash buffer中用弗氏压榨法处理。 或者：在细胞糊中加入终浓度为45–60KU/g细胞糊的溶菌酶溶液，吸打混合。30℃孵育15分钟。再进行 超声。将裂解液10,000g离心20分钟。用0.45um膜（滤器）过滤上清。
基因融合动物实验报告
一、实验目的1. 了解基因融合的基本原理和实验方法；2. 掌握基因融合实验的操作流程；3. 观察基因融合实验结果，分析实验现象。
二、实验原理基因融合是指将不同来源的基因通过一定的方法连接起来，形成新的基因组合。
在动物实验中，基因融合技术广泛应用于基因功能研究、基因治疗和生物制药等领域。
本实验以小鼠为研究对象，通过基因融合技术将外源基因导入小鼠细胞，观察融合基因的表达和功能。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：小鼠胚胎干细胞、外源基因DNA、载体DNA、限制性内切酶、DNA连接酶、PCR试剂盒、质粒提取试剂盒、荧光素酶检测试剂盒等。
2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、细胞培养箱、显微镜、超净工作台、移液器、离心机等。
四、实验方法1. 基因克隆：将外源基因与载体DNA连接，构建重组质粒。
利用限制性内切酶切割外源基因和载体DNA，连接酶连接，形成重组质粒。
2. 质粒提取：利用质粒提取试剂盒提取重组质粒。
3. 转染：将提取的重组质粒转染小鼠胚胎干细胞。
采用电穿孔法或脂质体转染法将重组质粒导入细胞。
4. 细胞培养：将转染后的细胞在细胞培养箱中培养，观察细胞生长情况。
5. 融合基因检测：采用荧光素酶检测试剂盒检测融合基因的表达。
将细胞裂解，提取细胞裂解液，进行荧光素酶活性检测。
6. 结果分析：分析荧光素酶活性，判断融合基因是否表达。
五、实验结果1. 成功构建重组质粒：通过PCR和电泳检测，证实重组质粒构建成功。
2. 转染成功：通过显微镜观察，转染后的细胞生长良好，未出现明显异常。
3. 融合基因表达：荧光素酶活性检测结果表明，融合基因在转染后的细胞中成功表达。
六、实验讨论1. 基因融合技术在动物实验中的应用：基因融合技术是研究基因功能、基因治疗和生物制药等领域的重要手段。
本实验成功将外源基因导入小鼠细胞，为后续研究提供了基础。
2. 融合基因表达：荧光素酶活性检测结果证实融合基因在转染后的细胞中成功表达，表明基因融合技术在本实验中取得良好效果。
动物细胞融合
式细胞仪等技术。单克隆抗体促进了商品化试剂盒的开 展，试剂盒灵敏度高、使用方便、快速，用于病原微生 物抗原、肿瘤抗原、免疫细胞及其亚群的检测，激素、 细胞因子的测定。
2. 食品安全的检测
食品中的毒素〔如黄曲霉毒素〕、有机农药的检测。 方便、灵敏
3．蛋白质的提纯 单克隆抗体是亲和层析中重要的配体。将单克隆
断；HGPRT缺乏，DNA合成的补救途径受阻，不
能生长，5~7天死亡；
淋巴细胞和骨髓瘤融合细胞：能生长
〔4〕 杂交瘤细胞的选择和克隆化培 养
第一次抗体筛选：融合培养24h后更换成HAT 选择性培养液，杂交瘤细胞生长增殖、形成 细胞群，再利用免疫学方法检测其抗体合成。 第二次抗体特异性筛选：从杂交瘤细胞群中 筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特 异性杂交瘤细胞。
抗体是由B淋巴细胞分化形成的浆细胞合成、分 泌的。每一个B淋巴细胞在成熟的过程中只产生一种 抗体。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞，因此， 当机体受抗原刺激时，每种B淋巴细胞产生一种抗体 〔单一抗体疫动物生产、制备抗体效率 低，且多克隆抗体应用有很多缺陷，别离这些不同 的抗体极为困难。
1〕 取1.0 ml 5×104/ml细胞+4ml培养基稀释，得 1×104/ml. 2〕 取0.5ml 1×104/ml细胞液+4.5ml培养基稀释， 得1×103/ml. 3〕 取0.5ml1×103/ml细胞液+4.5ml培养基稀释， 得100 cells/ml. 4〕 取0.01ml的 100 cells/ml细胞液于培养板小孔， 加0.1 ml培养基，培养后得杂种细胞系。
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400~0000~455 电诱导细胞融合试剂盒
产品简介：
细胞融合(cell fusion)是两个或两个以上细胞融合并形成一个细胞过程。
在自然情况下，体内、体外发生的细胞融合的现象称为自然融合；体外培养的细胞可用人工方法诱导相同或者不同细胞间发生融合，称为人工诱导融合。
体外培养的单层贴壁细胞或悬浮细胞均可以做融合，但成功概率较大的是单层贴壁细胞。
Leagene 电诱导细胞融合试剂盒(Electrofusion of cell)是20世纪80年代发展起来的一项生物工程技术，其作用原理是先使细胞在在电场中极化成偶极子，并延电力线成串排列，用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜，促使细胞发生融合。
该细胞融合方法具有无毒、融合频率高、易控制等优点。
该试剂盒有效成分经严格无菌处理，仅用于科研领域，不用于临床诊断或治疗。
产品组成：
自备材料：
1、BALB/C小鼠、SP2/0骨髓瘤细胞
2、离心管
3、离心机
4、RPMI 1640培养基、胎牛血清
5、200目细胞筛
6、显微镜
7、细胞电融合仪
8、CO2培养箱
9、96孔、24孔培养板编号
名称CC0421
20T
Storage
试剂(A): PM脉冲缓冲液500ml 4℃试剂(B): PMF融合后液100ml 4℃试剂(C): HAT Media Supplement(50×) 10ml -20℃使用说明书1份
操作步骤(仅供参考)：
1、准备细胞：
⑴SP2/0骨髓瘤细胞：融合前，提前1天将SP2/0骨髓瘤细胞传代，培养至其处于对数生长期。
将该细胞收集于无菌离心管中，1000g离心8~10min，弃上清液。
加入10ml无血清RPMI 1640培养基，将细胞沉淀悬浮起来备用。
⑵淋巴细胞：融合前，取经3次用目的抗原免疫的BALB/C小鼠脾脏，每次免疫间隔2~3周，最后一次免疫后3~4天处死小鼠，取出脾脏，加入10ml无血清RPMI 1640培养基，将细胞沉淀悬浮起来备用。
⑶饲养细胞：融合前，收集健康的BALB/C小鼠腹腔中的腹水，将腹水（巨噬细胞悬液）1000g离心8~10min，弃上清液。
加入25ml HAT选择培养液（按HAT Media Supplement：含胎牛血清的RPMI 1640培养液=1：49配制），混匀，接种到96孔或24孔培养板。
经培养形成的饲养层细胞，可以辅助新的融合细胞的生长。
2、细胞融合：
⑴将骨髓瘤细胞和淋巴细胞按5：1比例混合，细胞密度为1.5×107个/ml，细胞悬液以1000g 离心8~10min，弃上清液。
⑵将细胞沉淀加入5ml PM脉冲缓冲液，1000g离心8~10min，弃上清液。
重复1次该步骤。
⑶用少量PM脉冲缓冲液重悬细胞沉淀，一般细胞浓度应达到2×106个/ml，注入细胞电融合仪的电极小池或融合槽。
注意：应根据不同体积的电极小池或融合槽加入细胞悬液，大多数细胞电融合仪的融合容积在20~4000μl之间。
按如下条件电泳：交流电场频率1MHz，振幅250V/cm，时间30s。
在显微镜下观察，看到80%的细胞已经形成珠串时，立即加穿孔电脉冲，其条件为：脉冲幅度5kV/cm，时间常数20ms，脉冲个数5，间隔1s。
⑷1000g离心8~10min，弃上清液。
向细胞沉淀加入25ml HAT选择培养液，混匀，接种到96孔或24孔培养板，37℃5%CO2培养12~24h。
3、筛选：细胞融合后12~24h，将细胞接种到HAT选择培养液中，细胞密度达到60~80%
汇合率之间，容许细胞进一步生长，进行异核体筛选，4~14天后可观察到大集落的杂交瘤细胞克隆。
结果：一般培养3~5天后即可见小克隆出现，杂交细胞较大，呈圆形且透明，其他细胞透光性差并逐渐死亡。
当培养8~12天后，克隆可长至孔底面积的30~50%，此时可取培养上清液进行抗体检测。
一旦检测到分泌预定抗体的克隆，应及时将阳性克隆转种24孔培养板进行扩大培养。
400~0000~455
400~0000~455 注意事项：
1、 应注意无菌操作，避免被微生物污染。
2、 如需HAT 选择系列产品，可选择Leagene A Media Supplement(50×)、HT Media
Supplement(50×)、HAT Media Supplement(50×)。
有效期：6个月有效。
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产品编号
产品名称
CC0127 胰蛋白酶~EDTA 溶液(0.05%:0.02%) CM0204 HAT Media Supplement(50×) DM0007 瑞氏~姬姆萨复合染色液 NH0043 SSC 缓冲液(20×,pH7.0) PW0040 Western blot 一抗稀释液
TE0002
碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒(PNP 微板法)。