DNS法测定还原糖含量时最适波长的确定_王俊丽
11级DNS法测定还原糖含量最终版
黄色
桔红色
实验材料、主要仪器和试剂
? 1、试剂 （1）1mg/mL 葡萄糖标准液
准确称取干燥恒重的葡萄糖 100mg ，加少量 蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至 100mL （2）3,5-二硝基水杨酸（ DNS）试剂
将6.3g DNS 和262mL 2Mol/L NaOH 溶液， 加到500mL 含有185g 酒石酸钾钠的热水溶液中， 再加5g结晶酚和 5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后 加蒸馏水定容至 1000mL ，贮于棕色瓶中备用。
→ 21.5ml 蒸馏水 测定吸光度并绘制标准曲线 （550nm 波长处）
? 二、样品中还原糖提取
准确称பைடு நூலகம்0.65g面粉，
放在100ml 烧杯中，先
以少量蒸馏水调成
糊状，然后加入15ml
蒸馏水，混匀，于50℃恒温保温20min ，时 搅拌，使还原糖浸出，过滤，将滤液全部收 集在25ml 容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度， 即为还原糖提取液。
（3）碘-碘化钾溶液 （4）6mol/l NaOH （5）0.1%酚酞指示剂 （6）6mol/l HCl溶液 2、材料 淀粉
3、器材 分光光度计，天平，水浴锅，电子 万用炉，试管若干
? 一、制作葡萄糖标曲线
? 取10支试管，按下表加入试剂
试剂
0 1 23 4
5
实验步骤
6
7
8
9
葡萄糖标 0 0.2 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 1.0 1.2 1.4 准液/ml
三.总糖提取
锥形瓶（0.5g面粉+10ml 盐酸+蒸馏水15ml）加热30min
检验水解是否完成（I-KI溶液） 冷却至室温后
中和并定容到 50ml 过滤取10ml 于 100ml 容量瓶
DNS法测定还原糖的含量
absorbency
1 y = -0.14971 + 0.035786x R= 0.9954
0.8
0.6
0.4
0.2
glucose standard curve 1
0
0
5
10
15
20
25
30
glucose standard curve1
glucose chroma/10-4mol/l
另外采用较高浓度的葡萄糖来制作标准曲线，得到下图2： 其回归方程为：y=-0.10483+0.031804x,R=0.99817.
试管号
0
1
2
3
4
56
7
8
9
10
11
12
13
14
DNS/ml
0
2
2
2
2
22
2
2
2
2
2
2
2
2
水/ml
3
1
葡萄糖/ml
0
0
1
1
1
11
1
1
1
1
1
1
1
1
浓度/104mol/l
3
5
7
9 11
13
15
17
19
21
23
25
27
下图1为葡萄糖标准曲线图，葡萄糖含量（mol/l） 与相应的吸光度（A）有一定的线性关系，且其回归方程为： y = - 0.14971+0.035786x， R= 0.9954。
二.显色条件的选择
1. 波长选择 取5支试管按下表加相应溶液，沸水 浴15min, 均加入7ml水定容为10ml，流水冷却，在不 同波长处分别进行扫描。
DNS法测定还原糖含量时最适波长的确定
ｔ ｒ ｉ ｄ．Ｔｈｅ ｒ ｓ ｔ ｈｏ ｄ ｔ ａ ｈｅ ＤＮＳ ｒ ａ ｔｏ ｓ ｌ ｔｏ ｆｘ ｌ ｓ ｎ ｌ ｃ ｅｈａ ｅ ｔ ａ ｅ ｍ ｎｅ ｅ ｕｌｓ ｓ ｗｅ ｈ ｔｔ ｅ ｃｉ ｎ ｏ ｕ ｉ ｎ ｏ ｙ ｏ ｅ ａ ｄ ｇ ｕ ｏｓ ｖ ｈｅ ｓ ｍｅ
［３ ９
Ｐｅ ， Ｈ ｕ Ｓ， ｕａＹ ， ｔ ． ｍ ｐａ ｉｏｎ ｏ ｅ ｇ ｄ ｎｇ Ｄ Ｈ ｅ ａ１ Ｃｏ ｒｓ ｆａ ｎ ｗ ｏｌ
２ ６ ２ ． ８ — ９３
ｉ ｍｍ ｕｎ ｈｒ ａ ｏ ａ ｏｃ ｏｍ ｔ ｇｒ ｐｈｉ ｓ ａｙ ｆ ｒ ｔ ｔ ｃ ｉ ｎ— ｃ ａ ｓ ｏ ｈｅ ｄｅ ｅ ｔｏｎ ｏｆａ ｔｂ ｉｓ ａ ａｉｓ ｖ ａ ｎｆｕｅ ｚ ｉｕｓ ｗ ｉｈ ｈｅ ｇｇ ｕｔ— ｉ ｏｄｅ ｇ ｎ ｔａ ｉ ｎ ｉ ｌ ｎ ａ ｖ ｒ ｔ ｍａ ｌ ｉ ｎａ ｉｎ ｎｈｉｉｉｎ ｎ ｇａ ｌ ｍ ｍ ｕｎ ｉｆ ｓｏｎ ａ ｓ ｙｓ ｔｏ ｉ ｂ ｔｏ ａ ｄ ａ ｒ ｇｅ ｉ ｏｄｆ ｕ ｉ ｓ ａ
Ｏｐｔｍ ａ ａ ｅ ｅ ｇ ｈ ｆ ｒＤｅ ｅ ｍ ｉ ｎ ｈｅ Ｃｏ ｅ ｆ ｉ ｌＷ ｖ ｌ ｎ ｔ ｏ ｔ ｒ ｎｉ ｇ ｔ ｎｔ ｎｔｏ Ｒｅ ｃｎ ｇａ ｙ ＤＮＳ Ｍ ｅ ｈ ｄ ｄｕ ｉ ｇ Ｓｕ ｒ ｂ ｔｏ
Ｗ ＡＮＧ ｕ —ｉＮＩ ｏｘ ｎ Ｌ１Ｓ —ｈ ｎ， Ｅ Ｙａ — ｎ， Ｊ ｎ ｌ， Ｅ Ｇｕ — ｉｇ， ｕｚ ｅ ＸＩ ｎ ｍｉ ＣＡＯ ａ ｇ ｌ Ｘｉｎ — ｎ ｉ
王俊 丽 ， 国兴 ， 素 贞 ， 聂 李 谢艳 敏 ， 曹香林
（ 南 师 范 大 学 生命 科 学 学 院 ， 南 新 乡 ４ ３ ０ ） 河 河 ５ ０ ２
摘 要 ： 讨 ＤＮＳ法 测 定 还 原 糖 含 量 时 的 最 适 波 长 。 以 ＤＮＳ 为 显 色 剂 ， 分 光 光 度 法 分 析 测 定 了 探 用
dns测定还原糖含量原理
dns测定还原糖含量原理宝子！今天咱来唠唠DNS测定还原糖含量的原理呀。
你知道吗，还原糖可是一群很有趣的小家伙呢。
像葡萄糖、果糖这些都属于还原糖。
那DNS是啥呢？DNS就是3,5 - 二硝基水杨酸啦。
这个DNS可厉害了，它就像是一个超级侦探，专门去探寻还原糖的秘密。
当我们把含有还原糖的样品和DNS试剂放在一起的时候，就像是一场奇妙的聚会开始了。
还原糖这个小调皮，它有一些特殊的化学性质哦。
它能够把DNS试剂中的硝基还原成氨基。
这一还原呀，整个化学环境就发生了大变化。
原本的DNS试剂是有颜色的，但是经过还原糖这么一折腾，颜色就变得更深啦。
你可以想象成还原糖给DNS试剂化了个浓妆呢。
而且呀，这个颜色变化的程度和还原糖的含量是有关系的。
如果还原糖的含量多，那它能还原的DNS就多，颜色就变得更深；要是还原糖少呢，颜色变化就相对小一些。
这就像是一场比赛，还原糖的数量就决定了它在这场和DNS的反应比赛中能把DNS改变多少。
我们就可以根据最后溶液呈现出来的颜色深浅，来判断还原糖到底有多少啦。
咱再往细里说说哈。
这个反应其实是在一定的条件下进行的。
比如说温度啦，pH 值啦，这些都像是比赛的规则一样。
要是温度不合适，就像比赛的场地环境不好，那这个反应可能就不能好好进行了。
同样的，如果pH值不对，那还原糖和DNS之间的“互动”也会受到影响。
在实验室里呀，我们会先制作一个标准曲线。
这就好比是给这场颜色和还原糖含量的关系建立一个参照系。
我们会用已知浓度的还原糖溶液和DNS试剂反应，然后测量它们反应后的颜色对应的吸光度。
把这些已知浓度和对应的吸光度数据画成一条曲线。
然后呢，当我们要测量未知样品中的还原糖含量的时候，就把这个样品和DNS反应，测量它的吸光度。
再根据之前做好的标准曲线，就能找到这个吸光度对应的还原糖浓度啦。
是不是很神奇呢？这整个过程就像是一场有趣的化学游戏。
还原糖和DNS试剂在特定的环境下玩耍，然后给我们留下了颜色这个线索，我们通过这个线索就能找到还原糖含量这个小秘密啦。
DNS法测定还原糖的含量
下一步实验计划：
1.重复以上已做实验，找到几组较准确的实 验数据，做出葡萄糖标准曲线。 2.探索秸秆中葡萄糖含量与产氢量的关系， 将本次实验结果服务于生物制氢。
谢谢！ 谢谢！
0.3 0.28 0.26
A
0.24 0.22 0.2 0.18 0.16 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 dosage of DNS
picture 3
dosage of DNS/ml
4
3.反应时间(水浴时间) 取试管按下表加相应溶液， 沸水浴相应时间后,加入7ml水定容为10ml，流水冷却， 以6号试管中的DNS试剂调零，在540nm处测吸光度。
0 0 10 20 30 40 50 60 70 80
g l u c o s e s t a n d a r d c u rv e 2
g l u c o s e c h r o m a /1 0 m o l / l
-4
当所测得的吸光度比较小时，可用图1中的方程 ，当所测得的吸光度较大时，可用图2中的方程
图1为不同条件下溶液的波长——吸光度图（水调零）。
由图1可以看出白色与绿色曲线几乎重合，说明0.0001mol/l葡萄 糖溶液与DNS反应生成的氨基化合物极少，用比色法很难区分， 故此法所能够测量的葡萄糖浓度应大于0.0001mol/l。
由DNS＋H2O曲线可以看出当波长大于530nm时，DNS的吸光度已经很小， 这时DNS对反应生成的氨基化合物吸光度的影响可以忽略。
0.3 0.25 0.2
A
0.15 0.1 0.05 0 6 8 10
PH
picture 5
12
14
16
PH
三． 标准曲线的建立
DNS法测定还原糖
DNS法测还原糖方法一原理DNS即二硝基水杨酸法是利用碱性条件下，二硝基水杨酸（DNS）与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，540nm处有吸收，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系的原理，用比色法测定还原糖含量的。
二试剂及方法2.1 试剂1. 1 mg/ml的葡萄糖溶液2. 3,5－二硝基水杨酸用400mL 蒸馏水溶解6.3g3，5—二硝基水杨酸，逐步加入21g 氢氧化钠，再加入182g 四水合酒石酸钾钠、5.0g 苯酚、5.0g 无水亚硫酸钠，温水浴(不超过48℃)，不断搅拌，直至溶液清澈透明。
用蒸馏水定容至1000mL，保存在棕色瓶中，与二氧化碳隔绝，静置5～7 天后使用，贮存期为6 个月。
2.2 葡萄糖标曲的绘制表1 葡萄糖标曲的绘制方法试剂试管0 1 2 3 4 5葡萄糖标准液(ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 蒸馏水(ml) 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 03,5-二硝基水杨酸(ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 糖含量（mg）0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5混合均匀，沸水浴5min，冷却后加入4mL蒸馏水，混匀，在540nm下测OD值2.3 发酵液样品测定将发酵液稀释一定倍数后，取3只比色管标号1,2,3，加入稀释和的发酵液0.5 ml，加入DNS试剂0.5 ml 混匀，沸水浴5min，冷却后加入4 ml蒸馏水混匀，测OD540表 2 样品的测定方法管号0 1 2 还原糖待测样品 （mL ） 0.0 0.5 0.5 蒸馏水 （mL ） 0.5 0.0 0.0 DNS 试剂 （ mL ） 0.5 0.5 0.5 蒸馏水 （mL ） 4 4 4 A 540 nm计算所得还原糖含量 （mg ）三 结果计算 3.1 标曲3.2样品的还原糖含量稀释倍数）加人样品的体积（）计算得到的还原糖量（）还原糖含量（⨯=ml 5.0mg /g L。
DNS法测定还原糖
DNS法测还原糖方法一原理DNS即二硝基水杨酸法是利用碱性条件下，二硝基水杨酸（DNS）与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，540nm处有吸收，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系的原理，用比色法测定还原糖含量的。
二试剂及方法2.1 试剂1. 1 mg/ml的葡萄糖溶液2. 3,5－二硝基水杨酸用400mL 蒸馏水溶解6.3g3，5—二硝基水杨酸，逐步加入21g 氢氧化钠，再加入182g 四水合酒石酸钾钠、5.0g 苯酚、5.0g 无水亚硫酸钠，温水浴(不超过48℃)，不断搅拌，直至溶液清澈透明。
用蒸馏水定容至1000mL，保存在棕色瓶中，与二氧化碳隔绝，静置5～7 天后使用，贮存期为6 个月。
2.2 葡萄糖标曲的绘制表1 葡萄糖标曲的绘制方法试剂试管0 1 2 3 4 5葡萄糖标准液(ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 蒸馏水(ml) 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 03,5-二硝基水杨酸(ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 糖含量（mg）0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5混合均匀，沸水浴5min，冷却后加入4mL蒸馏水，混匀，在540nm下测OD值2.3 发酵液样品测定将发酵液稀释一定倍数后，取3只比色管标号1,2,3，加入稀释和的发酵液0.5 ml，加入DNS试剂0.5 ml 混匀，沸水浴5min，冷却后加入4 ml蒸馏水混匀，测OD540表 2 样品的测定方法管号0 1 2 还原糖待测样品 （mL ） 0.0 0.5 0.5 蒸馏水 （mL ） 0.5 0.0 0.0 DNS 试剂 （ mL ） 0.5 0.5 0.5 蒸馏水 （mL ） 4 4 4 A 540 nm计算所得还原糖含量 （mg ）三 结果计算 3.1 标曲3.2样品的还原糖含量稀释倍数）加人样品的体积（）计算得到的还原糖量（）还原糖含量（⨯=ml 5.0mg /g L。
DNS法测定植物组织中还原糖及总糖含量实验的改进
DNS法测定植物组织中还原糖及总糖含量实验的改进作者：查岭生胡鹏等来源：《安徽农学通报》2013年第11期摘要：针对现有生物化学实验“DNS法测定植物组织中还原糖及总糖含量”中的一些不足进行改进，包括实验材料选择、波长选择、DNS量、显色时间、DNS的配制等方面，最后对实验中一些注意事项进行了详细分析，以提高该实验的教学效果。
关键词：DNS法；实验教学；还原糖；改进中图分类号 Q547 文献标识码 B 文章编号 1007-7731（2013）11-16-023，5-二硝基水杨酸法（DNS法）是在碱性条件下，DNS与还原糖加热后被还原成橘红色氨基化合物，然后比色测定糖含量。
该法可测定还原糖和总糖含量，并可通过多糖=总糖-还原糖，粗略获得多糖含量。
相比之下，该方法具有操作简便、快速、灵敏度高、杂质干扰较小等优点[1-9]。
“DNS法测定植物组织中还原糖及总糖含量”实验涉及了一些基本的生物化学实验技能，如组织捣碎（或研磨）、离心技术、定容操作、比色测定及标准曲线绘制等。
该实验能有效提高学生的基本操作技能和动手能力，同时能将理论知识与实际应用很好地结合在一起。
实验的学时及难度适中，在生物化学实验中是一项很好的综合性实验。
笔者根据多年来实验教学经验总结，现对该实验相关步骤进行改进，并对实验中值得注意的地方进行详细总结，以提高其教学效果。
1 方法改进1.1 实验材料选择多数生物化学实验教材中的该实验对象为淀粉[1-5]。
淀粉作为实验材料的缺点主要有：（1）还原糖含量一般很低（如红薯淀粉）；（2）不同淀粉的还原糖含量也不一样；（3）材料本身缺乏可操作性等。
本着材料来源容易，还原糖含量高，色素影响小，易提取，能有效提高学生的动手能力和激发实验兴趣，理论与实际应用有效结合等各方面的因素，结合多年来的实验经验积累，认为白薯（又名“地瓜”）为最佳实验材料。
1.2 波长选择考虑到DNS显色液的影响、葡萄糖标准曲线的线性和最大吸收值等相关因素[6，10-11]，多年来本科实验教学结果证明520nm为最适测定波长。
DNS法测定还原糖的含量
试管号 0
1
2
3
4
5
6
7
DNS/ml 0
2
1
1.5
2
2.5
3
3.5
水/ml
3
1
11*
0
0
1
1
1
1
1
1
10-
4mol/l
葡萄糖
8
由图3可以看出溶液的吸光度随着DNS用量的增大而 增大，但当DNS用量达到3.5ml时，吸光度反而下降， 这说明DNS的用量不是越多越好，只要在与糖的反应 中DNS有剩余即可。如果DNS用量过多，会使测量时 DNS溶液浓度过大，造成测量不准。综合考虑，此次
2
显色条件包括:
波长选择，显色剂用量，
显色时间，溶液酸度，显
色温度，有机络合物的稳
定性及共存离子的干扰等
。此次实验选择波长选择
，显色剂用量，显色时间
，溶液酸度进行实验。
3
一．试剂的配置 DNS试剂：称量18.1992g酒石酸钾钠溶于50ml蒸馏水中 ， 加热， 趁热加入0.6313g 3，5-二硝基水杨酸（ DNS），另配制2mol/lNaOH溶液，取26.2ml加入上述 溶液中，称量0.5128g苯酚和0.5064g无水亚硫酸钠移入 配置好的溶液中，蒸馏水定容至100ml，该试剂避光保 存7～10天。 葡萄糖标准溶液（1.0*10-2mol/l）：准确称量0.1990g无 水葡萄糖，待溶解后定容至100ml容量瓶中。 葡萄糖标准溶液（1.0*10-3mol/l）：取10ml上述102mol/l溶液，稀释至100ml容量瓶中。 葡萄糖标准溶液（1.0*10-4mol/l）：取10ml上述103mol/l溶液，稀释至100ml容量瓶中。
DNS法对食用菌发酵液淀粉酶活力的测定
DNS法对食用菌发酵液淀粉酶活力的测定摘要选取广泛栽培的著名食用菌香菇、平菇和姬菇菌丝体为研究菌种，采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）比色法检测供试食用菌的淀粉酶产生能力。
以2%可溶性淀粉为唯一碳源的查氏液体培养基诱导发酵，供试食用菌产生的淀粉酶活力在1.513~3.417 U/ mL，为食用菌工业发酵菌种的选育提供了参考依据和分析方法。
AbstractEnzyme energy of amylase from edible fungi was determinated based on 3，5-dinitryl-salicyle（DNS）.Taking czapek as induction medtum in whith the only carbon source was 2% soluble starch，and amylase energy ranged from 1.513 to 3.417 U/mL among Lentinula edodes，Pleurotus ostreatus，Pleurotus cornucopiae，so as to put forward a reference and analysis method for the edible fungistrain selection.Key wordsedible fungi；fermention；DNS；amylase；activity determination经过人工驯化培养的食用真菌的菌丝体，可以栽培扭结成食药用价值很高的子实体。
近年来，人们发现食用真菌菌丝体也可以仿效青霉菌发酵，大规模生产食用菌多糖、抗生素、酶制剂等亟待研发的生物活性物质[1]。
食用菌发酵有赖于适宜的工艺条件与生物反应器，但更取决于具工业开发价值的生产菌种的生理性状，其中包括食用菌生产菌种对环境的适应性，归结为食用菌的代谢能力，能够利用廉价原料迅速生长并大量合成目的产物。
DNS法测定还原糖含量时最适波长的确定_王俊丽
DNS法测定还原糖含量时最适波长的确定王俊丽,聂国兴,李素贞,谢艳敏,曹香林(河南师范大学生命科学学院,河南新乡453002)摘要:探讨DNS法测定还原糖含量时的最适波长。
以DNS为显色剂,用分光光度法分析测定了木糖和葡萄糖显色液的最大吸收波长和最适测定波长。
结果表明,木糖和葡萄糖与DNS显色剂反应后,均在490nm处有最大吸收峰。
标准曲线糖含量范围为0~40mg/L时,OD值在520nm处的R2最接近于1,精确度和回收率均较高。
提示DN S法测定还原糖含量时,520nm为最适测定波长。
关键词:还原糖;木糖;葡萄糖;DNS法;最适波长中图分类号:Q503 文献标识码:A 文章编号:1004-3268(2010)04-0115-04 Optimal Wavelength for Determining the Content ofReducing Sugar by DNS M ethodWANG Jun-li,N IE Guo-xing,LI Su-zhen,XIE Yan-m in,CAO Xiang-lin(Co llege of L ife Sciences,Henan No rmal U niver sity,Xinx iang453002,China)Abstract:In this study,the OD values of x ylose and glucose under different w avelength w ere de-termined.T he r esults show ed that the DNS r eaction so lution of xy lose and g lucose hav e the same maxim um absorption w aveleng th(490nm)and the sam e optimal determining w avelength (520nm).When determ ine the content of x ylose and gluco se under the w aveleng th o f520nm, the precision and recollectio n rate are comparatively high and the line rang e o f reducing sug ar is 0~40m g/L.Key words:Reducing sug ar;Xylose;Glucose;DNS method;Optimal w aveleng th收稿日期:2009-11-15基金项目:河南省重点科技攻关项目(092102210127);河南省水产养殖学重点学科经费资助项目作者简介:王俊丽(1971-),女,河南汝南人,副教授,硕士,主要从事糖生物化学研究。
DNS法定量测定还原糖的波长选择
中国农学通报2017,33(15):144-149Chinese Agricultural Science BulletinDNS法定量测定还原糖的波长选择廖祥兵1，2，陈晓明1,2，肖伟1,3，张祥辉1，田甲1（1西南科技大学生命科学与工程学院，四川绵阳621010；2国民核生化灾害防护国家重点实验室，北京102205；3核废物与环境安全国防重点学科实验室，四川绵阳621010）摘要：为研究3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法定量检测还原糖的最佳测定波长。
采用紫外可见分光光度计对样品进行扫描，将每个波长下不同浓度显色液的吸光值与还原糖浓度进行线性拟合并分析，另通过对同一样品的10次扫描结果的RSD进行分析以验证波长选择是否合理。
结果发现：葡萄糖在520nm 处线性相关系数R2520≈R2max，在520~580nm范围内R2稳定在0.9998且在范围内斜率随波长增大而减小。
半乳糖在520nm处线性相关系数也存在R2520≈R2max，而在520~580nm范围内R2及斜率随波长增大而减小。
对同一样品的相对标准偏差(RSD)进行分析，发现RSD520≈RSD min。
此外，在480~580nm波长范围内对照组吸光值都较为稳定，而试验组吸光值在该范围短波长区域波动明显，且波长越小波动越大。
结果表明在520nm处既可达到很好的线性关系，又可实现较好的分辨率，同一样品的验证实验很好的验证了该结论。
试验组吸光值在较短波长处的波动表明选择较短波长是不合理的，同时说明新生成的氨基化合物的光吸收基团和DNS原有的光吸收基团为不同基团。
关键词：DNS；还原糖；波长选择；葡萄糖；半乳糖中图分类号：Q503文献标志码：A论文编号：casb17020094The Wavelength Selection of Reducing Sugar Quantitatively Determined by DNS MethodLiao Xiangbing1，2,Chen Xiaoming1,2,Xiao Wei1,3,Zhang Xianghui1,Tian Jia1(1College of Life Science and Engineering,Southwest University of Science and Technology,Mianyang Sichuan621010;2State Key Laboratory of NBC Protection,Beijing1022053The Key Laboratory of Fundamental Science on Nuclear Wasters and Environment Safety,Mianyang Sichuan621010) Abstract:The aim is to get the optimum determination wavelength of reducing sugar quantitatively determined by DNS method.The samples were scanned by UV visible spectrophotometer,and then the absorbance and the concentration of reducing sugar were linearly fitted and analyzed at each wavelength.And to verify whether the wavelength selection is reasonable,the RSD of10-time scan results of the same sample was analyzed.The results showed that the linear correlation coefficient(R2)of glucose was very close to R2max at520nm(R2520≈R2max).In the range of520-580nm,R2was stable at0.9998and the slope decreases with the increase of wavelength.R2of galactose was also very close to the R2max at520nm(R2520≈R2max).In the range of520-580nm,R2and the slope also decreased with the increase of wavelength.The results of RSD analysis of the基金项目：国民核生化灾害防护国家重点实验室开发基金项目“铀污染的牧草-微生物联合修复”(SKLNBC2015-04)；核废物与环境安全国防重点实验室基金“铀污染的生物预警及修复”(15yyhk05)；校博士基金项目“可视化重金属（铀）污染微生物预警体系的构建与应用”(16ZX7113)。
DNS法测定还原糖的含量
图1为不同条件下溶液的波长——吸光度图（水调零）。
由图1可以看出白色与绿色曲线几乎重合，说明0.0001mol/l葡萄 糖溶液与DNS反应生成的氨基化合物极少，用比色法很难区分， 故此法所能够测量的葡萄糖浓度应大于0.0001mol/l。
由DNS＋H2O曲线可以看出当波长大于530nm时，DNS的吸光度已经很小， 这时DNS对反应生成的氨基化合物吸光度的影响可以忽略。
1 y = -0.14971 + 0.035786x R= 0.9954 0.8
absorbency
0.6
0.4
0.2
glucose standard curve 1
0 0 5 10 15 20 25 30
glucose standard curve1
glucose chroma/10 mol/l
-4
0 0 10 20 30 40 50 60 70 80
g l u c o s e s t a n d a r d c u rv e 2
g l u c o s e c h r o m a /1 0 m o l / l
-4
当所测得的吸光度比较小时，可用图1中的方程 ，当所测得的吸光度较大时，可用图2中的方程
3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 440
DNS+H O
2
DNS+10 mol/l glucose
DNS+10 mol/l glucose amide
-4
-3
A
460
480
500
520
540
560
580
Fig.1
wavelengh/nm
图2为4号试管稀释10倍后波长扫描图
基于DNS原理的还原糖测定仪
基于DNS原理的还原糖测定仪高广恒;周万里;朱思荣;毕春元;赵晓华;史建国【摘要】We designed a DNS based reducing sugar detector. It has such advantages as low-concentration reducing sugar detection, convenient operation, easy maintenance, high accuracy and good repeatability. It employs colorimetry to detect the differential light absorption value of dye liquor before and after heating and then to calculate the content of reducing sugar in a sample. We discover that the content of reducing sugar is proportional to the light absorption value. Glucose of 0.1% is used to calibrate measurement. The linear rate of more than 0.99 exists whenthe concentration range is between 0% and 0.1%. The detector can stably detect the content of reducing sugar in beer, sorbitol and ferment.%设计了一种利用DNS原理来检测还原糖的测定仪，该测定仪可以检测低浓度的还原糖，操作方便、维护简单、精度高、重复性好。
利用比色法检测加热前后染液的吸光值差值来计算样品中还原糖的含量，得到还原糖含量和吸光值成比例关系。
DNS法测定总糖和还原糖精选文档
D N S法测定总糖和还原糖精选文档TTMS system office room 【TTMS16H-TTMS2A-TTMS8Q8-实验九总糖和还原糖的测定（二）──3,5－二硝基水杨酸法一、目的要求：掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用比色法测定还原糖的方法。
二、实验原理:在NaOH和丙三醇存在下，3,5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。
在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。
黄色桔红色三、试剂和器材1、试剂（1）1 mg/ml葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖100mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100ml，即含葡萄糖为1.0mg/ml。
（2）3,5—二硝基水杨酸试剂：称取6.3 g 3,5—二硝基水杨酸并量取262 ml2mol/L NaOH加到酒石酸钾纳的热溶液中（182 g酒石酸钾纳溶于500 ml水中），再加5 g结晶酚和5 g亚硫酸氢钠溶于其中，搅拌溶解，冷却后定容到1000 ml贮于棕色瓶中。
（3）碘－碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。
（4）6N NaOH：称取120g NaOH溶于500ml蒸馏水中。
（5）0.1% 酚酞指示剂。
（6）6 mol/L HCl溶液2、材料小麦淀粉或玉米淀粉。
3、器材分光光度计，天平，水浴锅，电炉，试管若干等。
四、操作方法1、葡萄糖标准曲线制作取8支15mm×180mm试管，按下表加入1.0mg/ml葡萄糖标准液和蒸馏水。
试剂管号012345678葡萄糖00.20.40.60.8 1.0 1.2 1.4 1.6标准液(ml)蒸馏水2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.00.80.60.4 (ml)水杨酸1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5溶液(ml)葡萄糖00.20.40.60.8 1.0 1.2 1.4 1.6含量(mg)将各管溶液混合均匀，在沸水中加热5 min，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入21.5 ml蒸馏水，摇匀。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
DNS法测定还原糖含量时最适波长的确定王俊丽,聂国兴,李素贞,谢艳敏,曹香林(河南师范大学生命科学学院,河南新乡453002)摘要:探讨DNS法测定还原糖含量时的最适波长。
以DNS为显色剂,用分光光度法分析测定了木糖和葡萄糖显色液的最大吸收波长和最适测定波长。
结果表明,木糖和葡萄糖与DNS显色剂反应后,均在490nm处有最大吸收峰。
标准曲线糖含量范围为0~40mg/L时,OD值在520nm处的R2最接近于1,精确度和回收率均较高。
提示DN S法测定还原糖含量时,520nm为最适测定波长。
关键词:还原糖;木糖;葡萄糖;DNS法;最适波长中图分类号:Q503文献标识码:A文章编号:1004-3268(2010)04-0115-04 Optimal Wavelength for Determining the Content ofReducing Sugar by DNS M ethodWANG Jun-li,N IE Guo-xing,LI Su-zhen,XIE Yan-m in,CAO Xiang-lin(Co llege of L ife Sciences,Henan No rmal U niver sity,Xinx iang453002,China)Abstract:In this study,the OD values of x ylose and glucose under different w avelength w ere de-termined.T he r esults show ed that the DNS r eaction so lution of xy lose and g lucose hav e the same maxim um absorption w aveleng th(490nm)and the sam e optimal determining w avelength (520nm).When determ ine the content of x ylose and gluco se under the w aveleng th o f520nm, the precision and recollectio n rate are comparatively high and the line rang e o f reducing sug ar is 0~40m g/L.Key words:Reducing sug ar;Xylose;Glucose;DNS method;Optimal w aveleng th收稿日期:2009-11-15基金项目:河南省重点科技攻关项目(092102210127);河南省水产养殖学重点学科经费资助项目作者简介:王俊丽(1971-),女,河南汝南人,副教授,硕士,主要从事糖生物化学研究。
*通讯作者:聂国兴(1971-),男,河南长垣人,教授,博士,主要从事水产动物营养与饲料学研究。
[9]P eng D,Hu S,H ua Y,et al.Co mpar ison o f a new g oldimmunochromat og raphic assay fo r the detect ion o f an-tibodies against av ian influenza virus w ith hemagg lut-inat ion inhibition and agar gel immuno diffusio n assays[J].V et Immuno l Immunopathol,2007,117:17-25. [10]Z hang G,Xi J,Wang X,et al.Efficient r ecover y o f afunctional ex tr acellula r do main o f bovine IgG2Fc r e-ceptor(bo Fc C2R)fr om inclusion bo dies by a r apid d-ilut ion r efolding sy stem[J].J Immuno l M et,2008,334:21-28.[11]Zhang G P,Guo J Q,Wang X N,et al.Develo pmentand evaluat ion o f an immunochr omatog raphic str ip fo rtr ichinello sis detection[J].V et P arasito l,2006,137:286-293.[12]Zhang G P,W ang X N,Y ang J F,et al.Dev elopmentof an immunochro matog raphic lat eral flow test str ipfor detectio n of B-adrener gic ag onist clenbutero l res-idues[J].J Immunol M et,2006,312:27-33.[13]Zhang G,Wang X,Zhi A,et al.Development of a lat-eral f low immunoassay str ip for scr eening of sulfam-onomethox ine residues[J].F ood A ddit Contam,2008,25:413-423.[14]张改平,职爱民,邓瑞广,等.兽药残留的免疫学快速检测技术概述[J].河南农业科学,2009(9):193-195.[15]张改平,郭军庆,李青梅,等.动物疫病免疫试纸快速检测技术概述[J].河南农业科学,2009(9):174-176.#115#测定还原糖含量是糖定量的基本方法,如分析测定水果和蔬菜中的可溶性糖、各种食品和饮品中的总糖、乳制品中的乳糖与蔗糖等,均可通过测定还原糖进行定量。
目前,测定还原糖的方法很多, 3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法因具有操作简便、快速、精确、测定成本低等优点,尤其适合于低浓度糖样的测定而被广泛采用[1,2]。
其测定原理是:在碱性条件下,DNS与还原糖共热后被还原生成棕红色的氨基化合物)))3-氨基-5-硝基水杨酸,在一定范围内,还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比。
但DNS法测还原糖含量的条件各异[3-5],给还原糖的测定带来一定困难。
本研究探讨了木糖和葡萄糖在DNS法中的最适测定波长,以期为糖的定量及其相关研究提供理论依据。
1材料和方法1.1试剂和仪器木糖(Sigma公司);葡萄糖(Amresco公司); DNS显色液;723型分光光度计;电子分析天平(精度为0.0001g)等。
1.2试剂配制1.2.1DNS显色液的配制量取750m L去离子水,加热至微热后顺序加入10.00g DNS、16.00g NaOH、5.00g苯酚、5.00g亚硫酸钠和300.00g酒石酸钾钠,溶解后定容至1000mL,棕色瓶中室温下放置一周后使用。
1.2.2木糖与葡萄糖标准液的配制标准木糖与葡萄糖预先干燥至恒定质量,准确称取1.0000g,去离子水定容至1000mL,配成1g/L的标准液。
1.3试验方法1.3.1最适波长的确定取1.0mL木糖、1.0mL 葡萄糖和1.0m L去离子水,分别与3.0mL DN S显色液在沸水浴下反应5min,冷却后定容至25mL (木糖和葡萄糖反应液的糖含量均为40mg/L,水与DNS反应液的糖含量为0)。
测定反应液在460nm、480nm、500nm、520nm、540nm、560nm处的吸光值。
另取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL的系列木糖和葡萄糖标准液,分别与3.0m L DNS显色液在沸水浴下反应5min,冷却后定容至25mL(糖含量分别为0、8、16、24、32、40mg/L)。
以0为参比,分别在490nm、500nm、510nm、520nm、530nm、540nm 处测吸光值,并以此求出不同波长下的回归方程和回归系数。
1.3.2精密度试验取0.6mL木糖和葡萄糖标准液(糖含量为0.6g/L)各6份作为待测样品,与DN S显色后在520nm处测吸光值,以0、012、014、016、018、110m L系列木糖和葡萄糖标准反应液的OD值做标准曲线,计算出每个样品的糖含量,并计算6个平行样品的平均值和标准差,以考察测定方法的精密度。
1.3.3回收率试验以0.4mL、0.6m L、0.8mL 木糖和葡萄糖标准液(实际糖含量分别为0.4g/L、0.6g/L和0.8g/L)为待测样品,与DNS显色后在520nm处测吸光值,以上述标准曲线为随行对照,求出各样品的糖含量,并计算回收率和离差(回收率=测得还原糖量/实际还原糖量@100%;离差=(回收率-100%)的绝对值,以考察测定方法的准确度。
离差越小,结果的准确度越大。
2结果与分析2.1最适波长1mL木糖、葡萄糖和水分别与DNS显色液反应后,在不同波长下测定OD值,结果见图1。
3种反应液在460nm和480nm下的OD值均超出了分光光度计的最大测定量程,所以在图1中未能显示出该波长下的数据,但从图1可以看出,3种反应液在500nm处均有较高的OD值,之后OD值迅速下降,并随着波长增加逐渐减小。
水与DN S反应液在520nm处之前有很高的吸光值,但在560nm处之后OD值接近于0,所以,在实际测定过程中应除去DN S显色液本身的吸光值。
在500~560nm处范围内,同一波长下木糖与葡萄糖的吸光值非常接近。
图1木糖、葡萄糖和水分别与DNS显色后在不同波长下的OD值系列木糖和葡萄糖标准液与DNS显色后在不同波长下的OD值见图2、图3,2种还原糖标准曲线在不同波长下的回归系数(R2)见表1。
# 116 #图2 系列木糖标准品与DNS 显色后在不同波长下的OD值图3 系列葡萄糖标准品与DNS 显色后在不同波长下的OD 值从图2、图3可以看出,2种还原糖均在490nm 处有最大吸光值,但两者在此波长下回归曲线的线性均较其他波长下差。
另外,低含量的还原糖(如8mg /L)在不同波长下的OD 值接近,而随着糖含量增加,不同波长下的OD 值差异增大。
由表1可以看出,2种还原糖均在490nm 处的R 2最小,木糖在520nm 处的R 2最大,精确度最高,葡萄糖在520nm 和510nm 处的R 2最大,因此,木糖和葡萄糖的最适显色波长没有明显差异。
根据比耳定律,只有当吸光值在0.15~ 1.0范围内时,测定误差才能控制在2.2%之内。