pull down流程和结果模板

pull down 实验方法

.；.Pull Down实验流程1. 混合两种预测相互作用的蛋白。

（Protein-A-GST & Protein-B-HIS，下面实验用GST 树脂IP，用Western Blot检测HIS；反之亦然。

如果是纯化后的蛋白，需要进行偷袭或者使用超滤离心管为蛋白更换溶液，之后才能继续Pull Down。

）2. 加入1 mL Binding Buffer。

Binding Buffer：50 mM Tris.HCl （pH7.50.）100 mM NaCl0.25% Triton-X 10035 mM β-Me（巯基乙醇）3. 将混合蛋白在4℃条件下旋转结合2-4 h。

4. 加入20-30 μL GST-Bind TM Resin结合2-4 h。

5. 4 ℃，150-200 g 离心2 min，吸弃上清（小心！不要吸弃底部沉淀）。

第一次弃去的上清样品记为Washing- Protein-A/ Protein-B，用于SDS-PAGE电泳时的对照。

6. 加入1 mL Binding Buffer，4 ℃条件下旋转混匀5-10 min，4 ℃，150-200 g 离心2 min，吸弃上清。

7. 重复步骤6，用1 mL Binding Buffer 清洗5-6次。

8. 最后一次清洗后留有20-30 μL 液体，加入适量的Loading Buffer，95℃金属浴5-10 min，150-200 g 离心5 min，样品记为上样跑SDS-PAGE电泳。

电泳样品顺序：Marker，Protein-A-GST，Protein-B-HIS，Washing- Protein-A/ Protein-B，Pull Down- Protein-A/ Protein-B此次电泳的目的，一是初步检测两个蛋白是否互作，二是可以为后面正式实验所需蛋白量提供参考。

用于正式检测两个蛋白是否互作电泳顺序如下：（input，蛋白量为后两者的1/10）Marker，Protein-B-HIS ，GST+ Protein-B-HIS，Protein-A-GST+ Protein-B-HISMarker，Protein-A-GST ，HIS+ Protein-A-GST，Protein-B-HIS+ Protein-B-GST9. 转PVDF膜，350 mA 恒流，2 h 左右。

pull-down蛋白质鉴定流程

pull-down蛋白质鉴定流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!1. 样品制备：细胞裂解：将细胞培养至适当密度，收集细胞并使用裂解缓冲液裂解细胞，以释放蛋白质。

pulldown实验原理

pulldown实验原理Pulldown实验是一种常用的分子生物学实验技术，用于研究蛋白质与DNA或RNA之间的相互作用。

该实验原理基于核酸的亲和性纯化技术。

在Pulldown实验中，我们需要准备两种重要的试剂：目的蛋白和亲和填料。

目的蛋白是我们想要研究的蛋白质，而亲和填料则是用于显示目的蛋白与核酸相互作用的亲和性表位。

通常，亲和填料有两种类型：固定填料和亲和标记填料。

固定填料是通过共价键结合到固定材料上，如琼脂糖珠。

而亲和标记填料则是具有荧光或放射性同位素等标记，以便于后续的蛋白质分析。

Pulldown实验的步骤如下：1.准备目的蛋白：我们首先需要克隆目的蛋白的基因，并将其表达在适当的表达系统中，如大肠杆菌。

通过分析蛋白质序列，我们可以知道目的蛋白背后的结构和功能。

2.准备亲和填料：根据目的蛋白的特性，选择适当的亲和填料。

例如，如果目的蛋白是DNA结合蛋白，我们可以使用DNA纯化填料，如聚腺酸。

如果目的蛋白是RNA结合蛋白，我们可以使用RNA纯化填料。

3.将目的蛋白和亲和填料结合：将目的蛋白与亲和填料一起孵育，以使它们发生特异性的相互作用。

这可以通过混合目的蛋白和亲和填料，在适当的缓冲液中进行几个小时的孵育来完成。

4.固定亲和复合物：使用试剂将亲和复合物固定在固定剂上，如琼脂糖珠。

这可以通过将珠子加入到反应中，然后对混合物进行旋转和洗涤来完成。

5.洗涤亲和复合物：通过多次洗涤琼脂糖珠，去除非特异性结合的蛋白质和其他杂质。

这可以通过多次旋转珠子和加入适当的洗涤缓冲液来完成。

6. 蛋白质分析：现在我们已经得到了特异性的目的蛋白-亲和填料复合物。

我们可以通过热变性、SDS-、Western blotting等方法对复合物进行分析和检测。

这些分析方法可以帮助我们确定目的蛋白质与DNA或RNA的相互作用。

通过Pulldown实验，我们可以研究蛋白质与DNA或RNA之间的相互作用，从而深入了解生物分子的功能和结构。

细胞pulldown实验的详细步骤及详细说明

细胞pulldown实验的详细步骤及详细说明利用重组技术将探针蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。

因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。

GST-pulldown主要包括以下三个部分：①利用基因重组技术构建带有GST标签的原核表达载体；②通过原核表达系统表达带有GST标签的融合蛋白；③利用GST亲和纯化柱进行蛋白纯化获得高纯度的融合蛋白，再利用GST亲和纯化柱进行蛋白间的相互作用检测。

细胞蛋白裂解液，洗脱液：PBS及PBS+1%Triton-100PBS （1L）NaCl： 8gKCl：0.2gNa2HPO4： 1.44gKH2PO4：0.24g加入800ml蒸馏水，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L 即可，高温高压灭菌,4℃保存备用。

PMSF（苯甲基磺酰氟）MW:174.19 工作浓度0.1-1mM，这里使用1mM，储存浓度100mM，将0.174g PMSF溶于10ml无水乙醇混匀即可。

保持于-20℃或者4℃。

（以下流程仅供研究已知原核蛋白A和真核过表达蛋白B相互作用）1、原核融合蛋白A的获得（1）将编码蛋白A与GST的重组质粒化转BL21（DE3）菌株（2）挑取单个克隆到含有5mlLB（+100ug/mlAmp）的10ml试管里，37℃培养过夜（3）将培养菌液转移到含有500ml LB（+100ug/mlAmp）的1L锥形瓶中，37℃，225rpm培养至OD600≈1.0-1.5左右，加入适当浓度的IPTG，在适当温度下培养适当时间（诱导条件需要根据不同的蛋白做调整），6000g，10分钟，4℃离心收集细菌，去尽上清，将菌体至于-20℃放置O/N（4）室温冻融菌体，马上置于冰上，每500ml培养液加入10-20ml细菌裂解液（PBS+1%Triton-100+PMSF），吹打混匀（5）冰上超声破碎，开2秒，停9秒，总40-60分钟。

pull-down方法步骤汇总

pull-down⽅法步骤汇总GST-Pull down:1) 利⽤纯化好的蛋⽩进⾏GST-Pull down 实验操作。

2) 实验设置2 个组合，第⼀个是实验组(90 µl BP-His +90 µl BRM(689-952aa)-GST)，第⼆个是负对照组(90 µl BP-His + 10 µl GST)，分别在1.5 ml 的离⼼管中混合均匀。

3) 加⼊1 ml binding buffer，充分混合均匀，冰箱内30 rpm 旋转⾄少2h。

4) 加⼊30 µl GST-Bind TM Resin，冰箱内30 rpm 旋转⾄少2 h。

，100 g 离⼼ 2 min，弃去上清。

6) 加⼊1 ml binding buffer，冰箱内30 rpm 旋转5 min 进⾏洗涤，然后，100 g 离⼼ 2 min，弃去上清。

重复 5 次。

7) 加⼊40 µl 5×SDS-PAGE loading buffer，煮沸5 min，12000 g，离⼼30 sec，吸取上清点样进⾏SDS-PAGE 电泳。

8) 12 %的SDS-PAGE 胶，120 V 电泳90 min。

9) 转膜，使⽤PVDF 膜，使⽤前⽤甲醇浸泡10 min，350 mA 电流转膜2h。

10) ⽤5 %的脱脂⽜奶封闭膜，60 rpm，1 h。

11) 加⼊⼀抗(20 ml 5 %的脱脂⽜奶+5 µl anti-His)，60 rpm，1 h。

12) 倒掉⼀抗，加⼊10 ml western blotting wash buffer，60 rpm，10 min，重复3 次。

13) 加⼊⼆抗(20 ml 5 %的脱脂⽜奶+5 µl Goat anti- mouse IgG(H+L) HRP conjugate)，60 rpm，1 h。

14) 倒掉⼆抗，加⼊10 ml western blotting wash buffer，60 rpm，10 min，重复3 次。

pull-down试验方法（自己总结）

pull-down试验方法（自己总结）pull-down试验方法(自己总结)12、GST蛋白的表达和纯化12、1 GST蛋白的表达（1)将表达GST融合蛋白的质粒转入BL21大肠杆菌菌株中。

（2) 挑单克隆于3ml LA(LB+Amp)培养基中，37℃摇菌过夜，获得种子液。

（3)将种子液稀释于50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始OD600为0、1。

（4)28℃,220rpm摇菌培养2小时。

（5)加入50μl100mM IPTG,16～27℃摇菌培养1～8小时。

（6)收菌，将菌液倒入大离心管，2管/50ml菌液，4℃5krpmx5min离心，弃上清。

（7)加入10ml PBS/管，重悬细胞,5krpm离心5min，弃上清。

（8) 加入2ml PBS/管，重悬细胞。

转移至5ml离心管。

（9)超声破壁破壁前，在细胞悬液中加20μl10mg/ml PMSF,80μl 蛋白酶抑制剂(100x)。

破壁参数：Frequency:100～200w 60s，pause 20s run40s,5cycles破至菌体由浑浊变为澄清。

加100μl20%TritonX－100，冰上放置30min。

（10)将裂解液分入1、5ml离心管中，4℃离心12krpm10min，取上清。

（11)吸取少量上清，加入蛋白电泳上样缓冲液，在沸水中煮3min。

离心（12krpm,1min），取上清作SDS-PAGE电泳，检测表达情况。

12、2 准备50%GST Sepharose4Bslurry（1)将原75%Glutathione Sepharose4B的slurry弹至混匀。

（2) 取677μl原液/管，3krpm离心5min，弃上清。

（3)加500μl PBS，颠倒混匀，3krpm离心5min，弃上清。

反复5次。

（4)加500μl PBS，颠倒混匀，配成50%Glutathione Sepharose4B 备用。

12、3 GST融合蛋白的纯化（1)在新鲜制备的细胞裂解液上清中加入20μl50%Glutathione Sepharose4B，4℃，摇床上摇，反应30min～60min。

PullDown实验具体步骤及详细方法

PullDown实验详细步骤及详细方法实验目的：体外检测蛋白质与蛋白质之间互相作用。

用于验证两个蛋白的互相作用，或者挑选与蛋白互相作用的未知蛋白。

实验原理：利用重组技术将探针蛋白与GST〔Glutathione S transferase〕交融，交融蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH〔Glutathione〕亲和结合。

因此，当与交融蛋白有互相作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而别离。

试剂：NaCl， KCl，Na2HPO4，KH2PO4，Triton-100，IPTG(Merck分装)，PMSF 〔Amersco〕，Cocktaier〔Merck 539134〕，Immobilized Glutathione 〔PIERCE 15160〕实验操作程序：材料及试剂探针蛋白与GST交融的原核蛋白，裂解的细胞蛋白，或者组织蛋白提取物细胞蛋白裂解液，洗脱液：PBS及PBS+1%Triton-100PBS (1L)NaCl： 8gKCl： 0.2gNa2HPO4： 1.44gKH2PO4： 0.24g参加800ml蒸馏水，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L 即可，高温高压灭菌！4℃保存备用！PMSF(苯甲基磺酰氟) MW:174.19 工作浓度0.1-1mM，这里使用1mM，储存浓度100mM，将0.174g PMSF溶于10ml无水乙醇混匀即可！保持于-20℃或者4℃〔以下流程仅供研究原核蛋白A和真核过表达蛋白B互相作用〕1：原核交融蛋白A的获得1.1：将编码蛋白A与GST的重组质粒化转BL21(DE3)菌株1.2：挑取单个克隆到含有5mlLB(+100ug/mlAmp)的10ml试管里，37℃培养过夜1.3：将培养菌液转移到含有500ml LB(+100ug/mlAmp)的1L锥形瓶中，37℃，225rpm培养至OD600≈1.0-1.5左右，参加适当浓度的IPTG，在适当温度下培养适当时间〔诱导条件需要根据不同的蛋白做调整〕，6000g，10分钟，4℃离心搜集细菌，去尽上清，将菌体至于-20℃放置O/N1.4：室温冻融菌体，马上置于冰上，每500ml培养液参加10-20ml细菌裂解液〔PBS+1%Triton-100+PMSF〕，吹打混匀1.5：冰上超声破碎，开2秒，停9秒，总40-60分钟。

pull down 蛋白表达

pull down 蛋白表达（最新版）目录1.Pull-down 蛋白表达的概念2.Pull-down 蛋白表达的过程3.Pull-down 蛋白表达的应用4.Pull-down 蛋白表达的优缺点正文1.Pull-down 蛋白表达的概念Pull-down 蛋白表达是一种用于研究蛋白质之间相互作用的实验技术。

通过这一技术，可以识别与某个目标蛋白质相互结合的其他蛋白质，从而揭示蛋白质之间的联系。

这种方法主要依赖于亲和色谱法，利用目标蛋白质与某种固相载体上的亲和标签结合，从而将带有目标蛋白质的复合物从溶液中分离出来。

2.Pull-down 蛋白表达的过程Pull-down 蛋白表达的过程主要包括以下几个步骤：（1）制备亲和载体：将固相载体与亲和标签（如 FLAG、HA 等）融合，制备成亲和载体。

（2）表达目标蛋白质：在实验体系中表达带有亲和标签的目标蛋白质。

（3）结合：将表达的目标蛋白质与亲和载体混合，让目标蛋白质与亲和载体上的亲和标签结合。

（4）洗脱：用适当的缓冲液将结合后的复合物从固相载体上洗脱下来。

（5）鉴定：通过 Western Blot 等方法鉴定洗脱下来的蛋白质。

3.Pull-down 蛋白表达的应用Pull-down 蛋白表达技术广泛应用于蛋白质组学研究、蛋白质相互作用网络构建、蛋白质功能研究等领域。

通过这一技术，科学家们可以深入了解蛋白质之间的相互关系，为研究生物过程提供重要线索。

4.Pull-down 蛋白表达的优缺点优点：（1）操作简便，实验周期较短；（2）可识别与目标蛋白质相互作用的蛋白质；（3）可用于研究蛋白质组中的多种蛋白质。

gst pull-down实验流程

GSTPulldown实验流程一、实验准备阶段1.确定实验目的（1）确定进行GSTPulldown实验的目的和研究问题（2）定义所需的实验指标和结果参数2.准备实验材料（1）准备所需的细胞或组织样本（2）提取或购买GST标记的蛋白二、样品处理与制备1.细胞处理（1）处理细胞以获得所需的细胞提取物（2）对细胞提取物进行蛋白浓缩或纯化2.样品制备（1）将GST标记的蛋白与细胞提取物混合（2）进行样品预处理如加入缓冲液等三、GSTPulldown实验1.准备GSH亲和树脂（1）将GSH亲和树脂进行预处理和平衡（2）加入样品到GSH亲和树脂上2.亲和纯化（1）将混合样品与GSH亲和树脂一起孵育（2）清洗亲和树脂以去除非特异性结合物3.Elution（1）使用Elution缓冲液洗脱目标蛋白（2）收集洗脱的蛋白样品并保存四、蛋白分析与检测1.SDSPAGE分析（1）将洗脱的蛋白样品进行SDSPAGE电泳分析（2）观察蛋白条带的大小和清晰度2.Westernblot检测（1）将SDSPAGE分离的蛋白转移至膜上（2）使用特异性抗体进行GST标记蛋白的检测五、数据分析与结果解释1.带图像分析（1）分析SDSPAGE和Westernblot的图像（2）计算目标蛋白的相对含量和表达水平2.结果解释（1）根据实验结果解释GSTPulldown实验的结论（2）分析实验结果与预期结果的一致性和差异六、结果验证与文献探索1.实验验证（1）重复实验以验证结果的可重复性和稳定性（2）进行相关实验以进一步验证结论2.文献探索（1）检索相关文献并对实验结果进行比对和验证（2）吸收和借鉴相关研究的成果，完善研究结论。

pull down 实验流程

pull down 实验流程英文回答：Pull down is a common phrase used in various contexts, and its meaning can vary depending on the specific situation. In general, it refers to the action of bringing something down or lowering it from a higher position. Letme explain it further with some examples.In a physical sense, pulling down can refer tophysically bringing something down. For example, if youwant to remove a poster from a wall, you would pull it down. Similarly, if you want to demolish a building, you wouldpull it down using heavy machinery or other tools. Another example is when you want to close a window blind, you would pull it down to cover the window.In a metaphorical sense, pulling down can refer to reducing or decreasing something. For instance, if you want to lower the volume of the music playing, you would pulldown the volume knob on the stereo. In a similar vein, if you want to decrease the temperature of a room, you would pull down the thermostat setting. This usage can also be applied to financial or economic situations. For example, if the stock market experiences a downturn, it means that the prices of stocks are being pulled down.Furthermore, pull down can also be used to describe the act of bringing someone's reputation or status down. This can happen through spreading negative rumors or engaging in malicious gossip. For instance, if someone spreads false rumors about a celebrity, they are trying to pull downtheir reputation. Similarly, in a competitive environment, people may try to pull down their rivals by spreading negative information about them.中文回答："Pull down"（拉下）是一个常用的短语，其含义可以根据具体情况而有所不同。

rna pull down 质谱步骤

rna pull down 质谱步骤
RNA pull down 实验是一种用于研究RNA与蛋白质相互作用的技术，其步骤通常包括以下几个阶段：
1. 构建RNA过表达质粒：需要通过基因合成并经过测序验证来构建RNA过表达质粒。

2. 体外转录模板准备：设计含有T7启动子的引物，通过PCR扩增得到转录模板。

3. 体外转录：以PCR产物为模板，进行体外转录以获得目的RNA。

4. 蛋白样品准备：选择适合的细胞系或组织样品，扩大培养后收集细胞裂解提取总蛋白备用。

5. RNA探针制备：将体外转录得到的RNA与磁珠结合，形成磁珠-RNA探针复合物。

6. RNA pull down实验：将磁珠-RNA探针复合物与蛋白样品孵育，使得RNA与相互作用的蛋白结合。

7. 清洗和洗脱：去除未结合的蛋白，并对磁珠-RNA-蛋白复合物进行洗脱处理。

8. 质谱分析：将洗脱下来的蛋白进行质谱分析，以鉴定与RNA相互作用的蛋白质。

9. 数据处理：对质谱数据进行分析，确定与RNA相互作用的蛋白种类及其相对丰度。

10. 验证实验：通过免疫印迹（Western blot）或其他方法对质谱结果进行验证。

在进行RNA pull down实验时，需要注意实验设计的严谨性，确保RNA探针的特异性和蛋白样品的活性。

此外，实验中应包含适当的对照组，以排除非特异性结合的干扰。

通过这些步骤，可以有效地鉴定和研究RNA与蛋白质之间的相互作用，进而揭示RNA在生物学过程中的功能和作用机制。

PullDown实验具体步骤及详细方法

PullDown实验具体步骤及详细方法实验目的：体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用。

用于验证两个已知蛋白的相互作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。

实验原理：利用重组技术将探针蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。

因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。

试剂：NaCl， KCl，Na2HPO4，KH2PO4，Triton-100，IPTG(Merck分装)，PMSF （Amersco），Cocktaier（Merck 539134），Immobilized Glutathione （PIERCE 15160）实验操作程序：材料及试剂探针蛋白与GST融合的原核蛋白，裂解的细胞蛋白，或者组织蛋白提取物细胞蛋白裂解液，洗脱液：PBS及PBS+1%Triton-100PBS (1L)NaCl： 8gKCl： 0.2gNa2HPO4： 1.44gKH2PO4： 0.24g加入800ml蒸馏水，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L 即可，高温高压灭菌！4℃保存备用！PMSF(苯甲基磺酰氟) MW:174.19 工作浓度0.1-1mM，这里使用1mM，储存浓度100mM，将0.174g PMSF溶于10ml无水乙醇混匀即可！保持于-20℃或者4℃（以下流程仅供研究已知原核蛋白A和真核过表达蛋白B相互作用）1：原核融合蛋白A的获得1.1：将编码蛋白A与GST的重组质粒化转BL21(DE3)菌株1.2：挑取单个克隆到含有5mlLB(+100ug/mlAmp)的10ml试管里，37℃培养过夜1.3：将培养菌液转移到含有500ml LB(+100ug/mlAmp)的1L锥形瓶中，37℃，225rpm培养至OD600≈1.0-1.5左右，加入适当浓度的IPTG，在适当温度下培养适当时间（诱导条件需要根据不同的蛋白做调整），6000g，10分钟，4℃离心收集细菌，去尽上清，将菌体至于-20℃放置O/N1.4：室温冻融菌体，马上置于冰上，每500ml培养液加入10-20ml细菌裂解液（PBS+1%Triton-100+PMSF），吹打混匀1.5：冰上超声破碎，开2秒，停9秒，总40-60分钟。

RNA pull down

RNA pull down 实验技术流程①目标RNA生物素标记②磁珠富集RNA③RNA结合蛋白孵育④RNA结合蛋白洗脱⑤WB或者MS检测RNA pull- down实验常见问题一.质粒转化、涂板、摇菌1. 取JM109感受态细菌80µl，加入1.5mlEP管中，用10µl枪头沾取质粒加入上述EP管中，混匀。

2. 冰上静置30min。

3. 42℃热休克90-120s。

4. 迅速移至冰上静置2min。

5. 在超净台内，于上述EP管中加入50µl lb培养基(Amp-)，37℃，160rpm摇床，增菌0.5-1h。

6. 菌液4,000rpm离心10min，弃大部分上清，将沉淀重悬，菌液全部加入LB平板(Amp+)上，涂布均匀，37℃倒置培养(过夜12-15h)。

7. 将37℃培养(12-16h)平板取出，于无菌操作台中挑取单克隆放入内含5ml LB培养基(Amp+)的15ml离心管中，于37℃、250rpm摇床增菌过夜18H,看菌液是否浑浊。

菌液浑浊后进行质粒中提。

二. 质粒中提(TIAN gen，DP107-02)1. 柱平衡：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500µl的平衡液BL，12,000rpm离心1min，尽量吸除上清。

2. 取1.5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm离心1min，尽量吸除上清。

3. 向留有菌体沉淀的离心管中加入250µl溶液P1使用移液器彻底细菌沉淀。

4. 向离心管中加入250µl溶液P2，温和的上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

5. 向离心管中加入350µl溶液P3，立即温和的上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀，12,000rpm，离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。

6. 将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中，12,000rpm，离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

pull down 实验方法

Pull Down实验流程1. 混合两种预测相互作用的蛋白。

（Protein-A-GST & Protein-B-HIS，下面实验用GST 树脂IP，用Western Blot检测HIS；反之亦然。

如果是纯化后的蛋白，需要进行偷袭或者使用超滤离心管为蛋白更换溶液，之后才能继续Pull Down。

）2. 加入1 mL Binding Buffer。

Binding Buffer：50 mM Tris.HCl （pH7.50.）100 mM NaCl0.25% Triton-X 10035 mM β-Me（巯基乙醇）3. 将混合蛋白在4℃条件下旋转结合2-4 h。

4. 加入20-30 μL GST-Bind TM Resin结合2-4 h。

5. 4 ℃，150-200 g 离心2 min，吸弃上清（小心！不要吸弃底部沉淀）。

第一次弃去的上清样品记为Washing- Protein-A/ Protein-B，用于SDS-PAGE电泳时的对照。

6. 加入1 mL Binding Buffer，4 ℃条件下旋转混匀5-10 min，4 ℃，150-200 g 离心2 min，吸弃上清。

7. 重复步骤6，用1 mL Binding Buffer 清洗5-6次。

8. 最后一次清洗后留有20-30 μL 液体，加入适量的Loading Buffer，95℃金属浴5-10 min，150-200 g 离心5 min，样品记为上样跑SDS-PAGE电泳。

电泳样品顺序：Marker，Protein-A-GST，Protein-B-HIS，Washing- Protein-A/ Protein-B，Pull Down- Protein-A/ Protein-B此次电泳的目的，一是初步检测两个蛋白是否互作，二是可以为后面正式实验所需蛋白量提供参考。

用于正式检测两个蛋白是否互作电泳顺序如下：（input，蛋白量为后两者的1/10）Marker，Protein-B-HIS ，GST+ Protein-B-HIS，Protein-A-GST+ Protein-B-HISMarker，Protein-A-GST ，HIS+ Protein-A-GST，Protein-B-HIS+ Protein-B-GST9. 转PVDF膜，350 mA 恒流，2 h 左右。

pull-down实验步骤解析

pull-down实验步骤解析嘿，咱今儿就来好好唠唠这 pull-down 实验步骤哈！你想想，这 pull-down 实验就像是一场精心编排的舞蹈。

首先呢，得准备好“舞台”，也就是把咱要研究的蛋白啥的都准备得妥妥当当。

这就好比跳舞得先有合适的场地和舞者呀！然后呢，把带有“钩子”的东西，也就是能和目标蛋白结合的东西放进去，这就像是抛出一个诱人的“诱饵”，等着目标蛋白上钩呢！接下来可就关键啦！让它们在合适的环境里相互作用，就像舞者们在音乐中翩翩起舞，相互呼应。

等它们结合得差不多了，就该把那些没结合上的杂质啥的给清理掉，这就好比把舞台上多余的东西清理掉，让主角们更加突出。

然后呢，把结合上的复合物给分离出来，哇哦，这感觉就像是把最精彩的舞蹈动作给单独拎出来欣赏一样。

这一步可得小心谨慎，不能有一点马虎，不然就前功尽弃啦！再之后，对这些复合物进行分析鉴定，看看咱到底钓到了啥“大鱼”。

这就像是仔细欣赏舞蹈的每个细节，去评判它的好坏优劣。

你说这 pull-down 实验是不是很有意思？就像一场神秘的探险，每一步都充满了惊喜和挑战。

要是哪一步没做好，可能就找不到我们想要的答案啦！在做这个实验的时候啊，可千万不能粗心大意。

就好比跳舞时一个小失误可能就会影响整个表演的效果。

每一个环节都得精心对待，从准备试剂到操作过程，都得像呵护宝贝一样小心翼翼。

而且哦，这个实验有时候还需要点耐心呢！就像等待一朵花慢慢开放，不能着急，得慢慢等，慢慢观察。

要是太着急了，可能就会错过一些重要的细节。

咱做实验的人啊，就像是这场舞蹈的编导，要把每个步骤都安排得妥妥当当，才能让实验顺利进行，得出可靠的结果呀！这 pull-down 实验步骤，你可搞清楚了吗？别迷糊哦，要认真对待每一个环节，这样才能在科学的海洋里畅游，找到我们想要的宝藏呢！。

(完整word)蛋白相互作用Pull-Down实验

蛋白相互作用Pull-Down实验实验原理：Pull-Down技术是通过蛋白相互作用来研究细胞通路的有力工具.是确定两种或更多蛋白之间相互作用的体外方法.Pull-Down实验可用来检测已知的蛋白相互作用条件，并且可用来筛选未知的蛋白相互作用.用作诱饵的蛋白是重组蛋白,会含有一个用于纯化的亲和标签.这个融合标签就是用于Pull —Down实验的基础.最常见的标签为谷胱甘肽S-转移酶(GST）和多组氨酸（6×His）。

其分别使用固相化的谷胱甘肽和固相化的金属螯合物亲和配体（如Ni2+和Co2+）。

实验准备:实验仪器：谷胱甘肽琼脂糖凝胶（镍离子琼脂糖凝胶)、离心机、实验材料:表达的含标签的纯化蛋白、细胞裂解液实验试剂：Binding Buffer/Washing Buffer: 4。

2mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、140mM NaCl、10mM KClSDS loading Buffer: 50mM Tris-Cl（pH6.8)、2％SDS、0.1%溴酚蓝、10%甘油、10mM DTT裂解缓冲液：20mM Tris—Cl(pH8。

0)、 200mM NaCl、 1mM EDTA（pH8。

0）、0.5% Nonidet P-40 使用前加入加入蛋白酶抑制剂。

（蛋白酶抑制剂:2ug/ul抑肽酶（aprotinin）、1ug/ul白胃素（leupeptin）、0。

7ug/ml胃酶抑素(pepstatin）、25ug/ml苯甲磺酰氟（PMSF））实验方法：方法一：1、预清除细胞裂解液：将细胞裂解液与50ul的50％谷胱甘肽琼脂糖球珠悬液和25ug GST在4℃混合孵育2h。

离心机12，000g在4℃离心2min。

将上清转移至新的离心管中.2、探测细胞裂解液两个含等量预清除细胞裂解液及50ul谷胱甘肽琼脂糖球珠的微量离心管。

在一管中加约10ug 的GST蛋白，另一管中加约10ug的GST融合探针蛋白。

《pulldown技术》课件

03
确保实验结果准确可靠，符合研究目的和研究问题。
实验操作步骤
步骤一：细胞或组织样本处理
步骤二：免疫沉淀
实验操作步骤
• 将处理后的样本与特异性抗体结合，通过抗原抗体反应将目标蛋白与其他蛋白分离。
实验操作步骤
步骤三：洗涤和离心
对结合了抗体的样本进行洗涤和离心，去除未结合的蛋白质和其他杂质。
实验操作步骤
发展
随着生物技术的不断发展和蛋白质组学研究的深入，Pulldown技术也在不断改进和完善。目前，该技术已经可以用于高通量、高灵敏度和高分辨率的蛋白质分离和纯化，为生物医学研究提供了重要的工具。
应用领域
生物医学研究
生物制品生产
Pulldown技术被广泛应用于生物医学研究中，包括疾病机制研究、药物靶点发现和药物筛选等。
在生物制品生产中，Pulldown技术可以用于分离和纯化特定的蛋白质，提高产品质量和产量。
诊断
Pulldown技术也可以用于开发新的诊断方法，通过分离和纯化特定的生物标志物，用于疾病早期诊断和治疗监测。
02 Pulldown技术实验流程
实验准备
材料准备实验所需的试剂和溶液，如缓冲液、洗涤液、抗体等。
05
Pulldown技术的未来发展与展望
技术创新与突破
01
02
03
高效蛋白质分离
通过改进分离介质和优化分离条件，提高蛋白质的纯度和回收率，降低背景干扰。
自动化与智能化
引入机器人技术和人工智能算法，实现Pulldown技术的自动化和智能化，提高实验效率和准确性。
高通量与高灵敏度
开发高通量的Pulldown技术，能够同时检测多个蛋白质样品，提高检测灵敏度和可靠性。

GST_pull_down操作流程

GST_pull_down操作流程GST pull down操作流程一、表达GST融合蛋白1、6mlLB＋单克隆＋Amp，37℃，250rmp培养过夜2、5ml菌液加入400ml LB＋Amp的1L锥形瓶中中，37℃，250rmp，2h，OD600≈0.6-0.83、取1ml菌液保存于Ep管中，sample14、大瓶加入400ul（1：1000）IPTG，4h5、取1ml菌液保存于Ep管中，sample26、诱导后的收菌，6000rpm×8min 4度，去尽上清，置于冰上7、加入20ml，－20度预冷的PBS+1%Triton-100+PMSF（1：100 PMSF）（先加15ml，再加5ml）吹打混匀8、（1）压力破碎仪破碎（2）冰上超声破碎，开2秒，停9秒，总20分钟。

至裂解液清澈9、14000rpm，20分钟，4℃离心，分离上清，取50ul sample310、取GST-Beads（400ul）到柱子管中，用预冷的PBS洗去其中的Triton－x－100，加上清（？），4度，旋转孵育1h 如果是小量纯化，就是50ul的GST-beads放EP管，加细菌裂解液1ml11、收集50ul的样品sample4，可与sample3作对照，检测beads的结合效率12、用-20度预冷1％的Triton－x－100 in PBS洗3次，PBS洗3次1000转2min，弃上清，留beads等体积的液体（小量PBS是1ml洗，多次）13、用大枪头剪去少许（beads：PBS=1:1）,吸出10ul跑样，检测纯化情况14、sample1，2，3，4加sample buffer，100度10min，12000rmp 30sSDS－PAGE 每样10ul15、4度保存GST－pro-beads（如果不做pull-down,可以洗脱）sample1：诱导前sample2：诱导后sample3：上清sample4：纯化后上清二、裂解细胞1、收集细胞（胰酶处理好，防止细胞破碎）1000rmp，5min，RT2、PBS 洗，离心1000rmp，5min3、加400ul IP lysis buffer（0.1％Triton）1：100加cocktail冰上孵育30minIP Lysis buffer 500ml：HEPES 5.95gNacl 4.38gEGTA 0.38gPH=7.44、针头过5次5、冰上，旋转孵育，15min6、14000rpm，20min，4度，留上清，去沉淀三、表达纯化HIS－tagged protein1、500ml LB 高温灭菌2、接种单克隆到5ml LB，加抗生素，37度，250转，过夜3、把菌液转移到500mlLB,加抗生素中，37度，250转，OD~0.7（看到云雾）4、加入IPTG 250－500ul，诱导4小时（温度摸索）5、6000转，4度，15min，弃上清，用10ml lysis buffer 溶解沉淀6、加入50ul PMSF，超声破碎，（300w，工作5，间歇10，全程10min）7、12000转，4度，20min8、柱中加入1ml ni-beads，上清转移至柱中，4度，旋转孵育1小时，（每种蛋白需要自行摸索相应的最佳条件，为防止蛋白降解，以下均在冰上）小量就是50ul的NI-beads放EP管，加细菌裂解液1ml9、用Wash buffer 1 10ml每次，洗2次（小量是1ml洗）用Wash buffer 2 5ml每次，洗2次（小量是1ml洗）,收集洗脱液电泳检测每种wash buffer 的最佳用量（防止将蛋白洗脱）10、用Elution buffer洗脱蛋白2-4次，每次0.5ml，取1ul洗脱液在NC膜上，丽春红染色，颜色越深，蛋白量越大，取蛋白量最大的做Pull down试剂配置：Lysis buffer50mM NaH2PO4，PH8.0300mM Nacl10mMImidazoleWash buffer 150mM NaH2PO4，PH8.0300mM Nacl20mM ImidazoleWash buffer 250mM NaH2PO4，PH8.0300mM Nacl40mM ImidazoleElution buffer50mM NaH2PO4，PH8.0300mM Nacl300mM ImidazoleElution buffer 40ml50mM NaH2PO4 0.312g300mM Nacl 0.701g300mM Imidazole 0.8171g三、pull down实验1、his-pro加入到已纯化的GST-Pro的EP管中，用PBS补足液体到600ul左右，以便蛋白之间能充分结合！2、4℃旋转结合，4h3、PBS+0.1%Triton-100洗3次，PBS洗3次，1000转2min，1:1留。

下拉实验流程图 (1)

Pull-down法筛选转录因子靶基因的流程图酶切10gμ基因组DNA5gμDNA片段 10gμ双链接头接头—DNA片段（纯化）结合蛋白结合蛋白—接头—DNA复合物单克隆抗体及Protein A免疫沉淀（结合蛋白—接头—DNA复合物）CI出去蛋白接头—DNA片段PCR扩增大量的接头—DNA片段酶切接头DNA片段克隆送公司测序相关软件比对及数据库分析获得靶基因的整个序列EMSA验证转录因子与靶基因的相互作用具体步骤：1制备连有接头的DNA片段（1）限制性内切酶酶切10gμ植物基因组DNA 基因组DNA片段（2）5 gμDNA片段与10 gμ双链接头链接（T4DNA连接酶, 16℃过夜）接头--DNA片段（3）通过1%琼脂糖凝胶电泳将接头--DNA片段与未连接接头的DNA片段分离(4) 切胶回收接头--DNA片段(5) 纯化接头--DNA片段2免疫沉淀与结合蛋白有相互作用的接头--DNA片段(1)20Lμ的反应体系：2Lμ10×结合缓冲液；1gμ接头--DNA片段；5μ纯化结合蛋白；1gμ单克隆抗体；0.5gμpoly-dIdC ,混匀后冰上放g置20min；(2)然后加入120Lμ蛋白A beads继续在冰上孵育20min,每隔5min轻摇一下；(3)14,000g离心30 s ,去上清,用TN缓冲液洗两次，获得免疫共沉淀复合物；(4)接着用裂解缓冲液120 Lμ重悬沉淀，14,000g离心1min，除去蛋白;(5)再用酚︰氯仿（1︰1）纯化DNA 片段，再用75%乙醇洗涤一次，12000r/1min,去上清；(6)室温晾干后，用10LμddH2O重悬接头--DNA片段沉淀。

3对筛选的接头--DNA片段进行PCR扩增,产物经琼脂糖凝胶电泳回收4对接头--DNA片段进行恢复（酶切去接头）DNA片段5克隆DNA片段至pMD19-T上6送测序7相关软件及数据库分析获得靶基因整个序列8对筛选的靶基因进行验证（EMSA）注意事项：1 为了避免酶切产物（单酶切）自身环化，对酶切产物进行去磷酸化；2 为了防止结合蛋白与接头—DNA片段非特异性结合，用poly-dIdC 处理3 最好对结合蛋白进行纯化及使用单抗4减少非特异性扩增，PCR循环次数不能少于3次。