细胞培养基配方的使用教程

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干细胞培养基的配制及培养方法指南

干细胞培养基的配制及培养方法指南干细胞（Stem Cells）是具有自我更新和多能分化能力的一类特殊细胞，具有广泛的潜在应用前景。

在干细胞研究中，正确的培养基配制及培养方法是确保细胞生长和分化的关键。

本文将为您介绍干细胞培养基的配制及培养方法指南，以帮助您顺利进行实验。

首先，让我们来了解一下干细胞培养基的组成。

一般来说，基本的干细胞培养基主要包括培养基基础（Basal Medium）和补充物（Supplement）。

培养基基础是为细胞提供必需的营养物质和生长因子，而补充物则可以根据实验需求来进行选择和添加。

一、干细胞培养基的配制1. 首先，准备好培养基基础。

常用的干细胞培养基基础有DMEM/F12、RPMI 1640、E8等。

您可以根据实验的需要选择适合的基础培养基。

2. 接下来，选择适当的补充物。

常用的补充物包括胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）、基础纤维生长因子（Basic Fibroblast Growth Factor, bFGF）、人血小板衍生生长因子（Platelet-Derived Growth Factor, PDGF）等。

具体选择和添加的补充物应根据干细胞类型和实验目的来确定。

3. 正确控制pH值。

将培养基基础和补充物按照比例混合后，使用pH计检测pH值，通常干细胞培养基的pH值应保持在7.2-7.4之间。

4. 最后，将配制好的培养基过滤以去除可能存在的微生物，然后储存在低温环境中，避免光照和冻结。

二、干细胞培养方法指南1. 准备培养皿。

选择含有黏附因子的培养皿，如明胶、凝胶体、胎牛血清等。

在使用之前，进行预处理，以去除可能存在的细菌和残留的化学物质。

2. 培养基更换和细胞分割。

干细胞培养过程中，定期更换培养基以提供新鲜的养分和生长因子。

另外，当细胞达到一定程度的密度时，需要将其分割为合适的尺寸，以保持细胞的良好生长。

3. 细胞培养环境的控制。

干细胞在培养过程中对环境的要求较高，需要在无菌和恒温的环境下进行培养。

培养基配制的过程和注意事项

培养基配制的过程和注意事项一、培养基配制的基本步骤1. 材料准备：首先，需要准备培养基所需的各种原料和试剂。

常用的培养基原料包括蛋白胨、葡萄糖、琼脂等。

此外，还需要准备适量的水和试剂的称量工具。

2. 称量试剂：按照配方中的比例，准确地称取所需的试剂。

在称量过程中，应注意保持实验环境的清洁，并使用洁净的称量工具，以避免试剂受到污染。

3. 溶解试剂：将称取好的试剂溶解于适量的水中。

在溶解过程中，可以通过搅拌或加热的方式促进试剂的溶解。

溶解完毕后，应检查溶液的透明度和均匀性，确保试剂充分溶解。

4. 调整pH值：根据具体的培养基配方，使用酸碱溶液调整培养基的pH值。

通过逐滴加入酸碱溶液，并经过搅拌均匀，逐步调整pH 值至所需范围。

在调整pH值的过程中，应注意避免过度调节，以免对培养细胞产生不良影响。

5. 加热消毒：将配制好的培养基加热至沸腾，保持沸腾状态持续5-10分钟，以达到消毒的目的。

在加热过程中，应注意避免溢出和烧焦，同时要保持试剂的充分混合。

6. 灭菌冷却：将消毒完毕的培养基冷却至适宜的温度，通常为45-50摄氏度。

在冷却过程中，应避免引入环境中的微生物污染，可使用无菌工作台或灭菌过滤器进行操作。

7. 分装保存：将冷却好的培养基分装到无菌培养皿或试管中，并密封保存。

在分装过程中，要注意避免试剂接触到外界空气，以防止污染。

二、培养基配制的注意事项1. 实验环境要保持清洁，操作过程要注意无菌操作，以避免试剂受到污染。

2. 在配制过程中，应准确称取试剂的质量，并按照配方中的比例进行配比，以保证培养基的质量和配方的准确性。

3. 在试剂溶解和调整pH值时，应充分搅拌均匀，确保试剂充分溶解和均匀混合。

4. 加热消毒时，应注意控制加热时间和温度，以避免试剂烧焦或溢出。

5. 冷却过程中，要避免污染和细菌的侵入，可使用无菌工作台或灭菌过滤器进行操作。

6. 培养基的分装要在无菌条件下进行，并尽快密封保存，避免试剂受到外界空气和微生物的污染。

培养基配制的基本过程

培养基配制的基本过程1、配制溶液向容器内加入所需水量的一部分,根据培育基的配方,称取各种原料,依次加入使其溶解,最终补足所需水分.对蛋白胨、肉膏等物质,需加热溶解,加热过程所蒸发的水分,应在全部原料溶解后加水补足.配制固体培育基时,先将上述已配好的液体培育基煮沸,再将称好的琼脂加入,连续加热至完全溶化.并不断搅拌,以免琼脂糊底烧焦.2、调整pH值用pH试纸(或pH电位计、氢离子浓度比色计)测试培育基的pH值,如不符合需要,可用10%HCl或10%NaOH进行调整,直到调整到配方要求的pH值为止.3、过滤用滤纸、纱布或棉花趁热将已配好的培育基过滤.用纱布过滤时,最好折叠成六层,用滤纸过滤时,可将滤纸折叠成瓦棱形,铺在漏斗上过滤.4、分装已过滤的培育基应进行分装.假如要制作斜面培育基,须将培育基分装于试管中.假如要制作平板培育基或液体、半固体培育基,则须将培育基分装于锥形瓶内.分装时,一手捏松弹簧夹,使培育基流出,另一只手握住几支试管或锥形瓶,依次接取培育基.分装时,留意不要使培育基粘附管口或瓶口,以免浸湿棉塞引起杂菌污染.装入试管的培育基量,视试管和锥形瓶的大小及需要而定.一般制作斜面培育基时,每只15150毫米的试管,约装3～4毫升(1/4～1/3试管高度),如制作深层培育基,每只20230毫米的试管约装12～15毫升.每只锥形瓶装入的培育基,一般以其容积的一半为宜.5、加棉塞分装完毕后,需要用棉塞堵住管口或瓶口.堵棉塞的主要目的是过滤空气,避开污染.棉塞应采纳一般新奇、干燥的棉花制作,不要用脱脂棉,以免因脱脂棉吸水使棉塞无法使用.制作棉塞时,要依据棉塞大小将棉花铺展成适当厚度,揪取手掌心大小一块,铺在左手拇指与食指圈成的圆孔中,用右手食指插入棉花中部,同时左手食指与姆指稍稍紧握,就会形成1个长棒形的棉塞.棉塞作成后,应快速塞入管口或瓶口中,棉塞应紧贴内壁不留缝隙,以防空气中微生物沿皱折侵入.棉塞不要过紧过松,塞好后,以手提棉塞、管、瓶不下落为合适.棉塞的2/3应在管内或瓶内,上端露出少许棉花便于拔取.塞好棉塞的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆札,预备灭菌.6、制作斜面培育基和平板培育基培育基灭菌后,如制作斜面培育基和平板培育基,须趁培育基未凝固时进行.(1)制作斜面培育基.在试验台上放1支长0.5～1米左右的木条,厚度为1厘米左右.将试管头部枕在木条上,使管内培育基自然倾斜,凝固后即成斜面培育基.(2)制作平板培育基.将刚刚灭过菌的盛有培育基的锥形瓶和培育皿放在试验台上,点燃酒精灯,右手托起锥形瓶瓶底,左手拔下棉塞,将瓶口在酒精灯上稍加灼烧,左手打开培育皿盖,右手快速将培育基倒入培育皿中,每皿约倒入10毫升,以铺满皿底为度.铺放培育基后放置15分钟左右,待培育基凝固后,再5个培育皿一叠,倒置过来,平放在恒温箱里,24小时后检查,如培育基末长杂菌,即可用来培育微生物.。

各种培养液的配方

各种培养液的配方不同的细胞类型和培养目的需要使用不同的培养液。

下面列举一些常见的细胞培养液配方及其用途。

1.DMEM培养液：DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）是一种最常用的细胞培养基，适用于多种哺乳动物细胞的培养。

以下是DMEM培养液的配方：-1×DMEM：将DMEM粉末加入去离子水中，调整pH至7.2-7.4，用0.22μm过滤器过滤灭菌。

-10%胎牛血清（FBS）：将FBS加入1×DMEM中，使最终浓度为10%。

-1%抗生素/抗菌素：将1%抗生素/抗菌素（如青霉素/链霉素）加入1×DMEM中，使最终浓度为1%。

2.RPMI1640培养液：RPMI1640是一种适用于淋巴细胞和白血病细胞的培养基。

以下是RPMI1640培养液的配方：-1×RPMI1640：将RPMI1640粉末加入去离子水中，调整pH至7.2-7.4，用0.22μm过滤器过滤灭菌。

-10%FBS：将FBS加入1×RPMI1640中，使最终浓度为10%。

-1%抗生素/抗菌素：将1%抗生素/抗菌素加入1×RPMI1640中，使最终浓度为1%。

- 2-mercaptoethanol：将2-mercaptoethanol加入1×RPMI 1640中，使最终浓度为0.05mM。

3.MEM培养液：MEM（Minimum Essential Medium）是一种用于哺乳动物细胞培养的基础培养液。

以下是MEM培养液的配方：-1×MEM：将MEM粉末加入去离子水中，调整pH至7.2-7.4，用0.22μm过滤器过滤灭菌。

-10%FBS：将FBS加入1×MEM中，使最终浓度为10%。

-1%抗生素/抗菌素：将1%抗生素/抗菌素加入1×MEM中，使最终浓度为1%。

-1×非必需氨基酸：将非必需氨基酸（如谷氨酰胺、苏氨酸等）加入1×MEM中。

细胞培养液配制的流程

细胞培养液配制的流程
细胞培养液配制的流程：
①材料准备：
- 准备所需的所有化学试剂、培养基粉末、抗生素、血清、pH指示剂、无菌水或三蒸水。

②滤器消毒：
- 准备0.45μm和0.22μm孔径的滤膜，浸入三蒸水中，然后置于滤器上，打包后进行高压蒸汽灭菌。

③容器准备：
- 确保所有使用的容器（如烧杯、量筒、移液管等）都是干净且无菌的。

④溶解培养基：
- 将培养基粉末倒入无菌容器中，加入预热的三蒸水，使用磁力搅拌器充分搅拌直至完全溶解。

⑤添加补充成分：
- 按照实验需求，向溶解的培养基中加入nahco3、抗生素（如青霉素和链霉素）、L-谷氨酰胺等成分。

⑥加入血清：
- 如果配方需要，加入胎牛血清或其他类型的血清，通常为10%或20%体积比。

⑦ pH调节：
- 使用pH计检测溶液的pH值，根据需要加入1N HCl或1N NaOH进行调节，直至达到目标pH值。

⑧温度控制：
- 将配制好的培养液加热至接近细胞培养的温度（37°C左右），以防止温度骤变影响细胞。

⑨过滤除菌：
- 通过0.22μm孔径的滤器过滤培养液，以除去任何可能存在的微生物。

⑩分装：
- 将过滤后的培养液转移到无菌的细胞培养瓶或培养皿中，避免空气中的微生物污染。

⑪标记与记录：
- 在容器上标记培养液的类型、批号、配制日期以及有效期，并记录所
有操作细节。

⑫储存：
- 将配制好的培养液储存在适当的温度下，通常是4°C，直到使用前再恢复至室温或培养温度。

培养基配方及配制方法

培养基配方及配制方法培养基是一种用于寄养和培养细胞、微生物、组织等生物体的基质。

其配方的选择和配制方法对于不同的生物体和研究目的有很大的差异。

以下是一般常用的培养基配方及简单的配制方法：1. LB培养基（Luria-Bertani）LB培养基是常见的用于大肠杆菌等细菌的培养基，其配方包括：- 1% 蛋白胨（tryptone）: 添加营养源和能量- 0.5% 酵母粉（yeast extract）: 提供维生素和生长因子-1%NaCl（氯化钠）:调节渗透压-蒸馏水:使混合液体稀释至所需体积配制方法：将蛋白胨、酵母粉和NaCl加入蒸馏水中，调整pH至7.0，将混合液体加热至溶解，过滤杂质，如需固化则加入1.5%的琼脂。

2. YPD培养基（Yeast extract-Peptone-Dextrose）YPD培养基常用于酵母菌的培养，其配方包括：- 1% 酵母提取物（yeast extract）: 提供维生素和生长因子- 2% 蛋白胨（peptone）: 为细菌提供碳源和能量- 2% 葡萄糖（dextrose）: 为细菌提供碳源和能量-蒸馏水:使混合液体稀释至所需体积配制方法：将酵母提取物、蛋白胨和葡萄糖加入蒸馏水中，调整pH至7.0，将混合液体加热至溶解，过滤杂质，如需固化则加入2%的琼脂。

3. DMEM培养基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）DMEM培养基是常用的哺乳动物细胞培养基，其配方包括：-10%胎牛血清（FBS）:提供生长因子和营养物质- 1% 青霉素-链霉素溶液（Penicillin-Streptomycin Solution）: 防止细菌污染- 1% L-谷氨酰胺（L-Glutamine）: 提供细胞代谢所需的基础物质-DMEM基础培养液:包括氨基酸、维生素等成分-蒸馏水：使混合液体稀释至所需体积配制方法：将胎牛血清、青霉素-链霉素溶液、L-谷氨酰胺和DMEM基础培养液加入蒸馏水中，调整pH值至7.4，混合均匀即可。

培养基配制使用操作规程0

培养基配制使用操作规程0一、实验前准备1.确定所需的培养基种类和配制量。

2.准备所需的实验材料和设备，如试剂、培养基成分、量筒、称量器具等。

3.检查所使用的设备和容器，确保其干净无污染。

二、配制培养基1.根据培养基配方，按照比例准确称取所需的培养基成分。

不同的培养基成分可能有不同的配比，应根据具体要求进行配制。

2.准确称取培养基成分后，将其放入一个干净的容器中。

如果配制的培养基成分较多，可以选择使用一个混合容器，将不同的成分分批加入。

3.加入一定量的去离子水，使培养基成分溶解均匀。

注意搅拌培养基溶液，以确保成分充分溶解。

4.根据培养基配方需要，调整培养基的pH值。

可以使用酸碱溶液进行调节，pH值应根据具体要求控制在适宜范围内。

5.根据培养基配方需求，加入一定量的琼脂或琼脂糖，使培养基凝胶化。

注意在加热溶化琼脂时要确保充分溶解，并避免过热。

6.将配制好的培养基溶液均匀地倒入培养皿或试管中，封装好，并在密封处涂抹石蜡或添加适量的抗生素用于防止污染。

三、消毒和灭菌处理1.培养基配制完成后，应进行标本消毒处理，以确保培养基无菌。

可以使用自主炉、高压灭菌器或紫外线灯进行消毒处理，处理时间和方法应根据具体要求进行。

2.检查消毒后的培养基容器，确保无菌。

如果发现有污染或者其他异常情况，需要重新消毒处理。

四、记录1.培养基配制完后，需要记录相关信息，如培养基种类、配制日期、配制人员等。

这些记录有助于追溯和分析培养基的质量问题，也方便后续使用和管理。

以上是培养基配制的操作规程，这些规程主要是为了确保培养基质量的可靠性和可重复性。

执行这些规程可以减少操作失误和污染的风险，保证实验结果的准确性和可靠性，同时也有助于规范实验室管理和操作流程。

培养基配制流程

培养基配制流程
1. 硝酸盐法配制9 L培养基
（1）蒸馏水配制9 L培养基：需要用蒸馏水配制9 L培养基，然后將培养基中所需
要的营养原料（包括碳源、氮源、矿物质、微量元素等）一一加入到培养基中，最后将培
养基加热消毒后就可以使用了。

（2）硝酸盐法配制9 L培养基：使用硝酸盐配制培养基需要先把各种必要的原料称重，例如各种碳源，氮源，矿物质，微量元素等，然后将这些原料按照一定的比例加入到
预制的硝酸盐溶液中，搅拌均匀，确保液体浓度稳定。

（3）消毒培养基：在配制好培养基后，还需要进行消毒处理，最常用的方式就是加
热处理，一般温度处理时间保持在30-60分钟，可以有效杀死菌落离体细胞以及某些特殊
的病毒感染细胞。

（2）氯化钠法配制9 L培养基：本法配制培养基不需要添加碳源、矿物质和微量元素，需要添加的原料仅有氯化钠、磷酸二铵、氯化铵和氯化钙，按照一定的比例加入预先
制备好的氯化钠溶液，搅拌均匀，经加热消毒处理后即可准备使用。

（1）蒸馏水配制9 L培养基：和上面制备的方法一致，将所需的营养原料搅拌均匀，经加热消毒处理后即可准备使用。

4. 酒精消毒
培养基加热消毒处理后，可以采用酒精消毒的方式杀死培养基中存在的大部分菌类细胞，操作方法是用95％以上的乙醇将培养基中的悬浮物清洗净，然后将乙醇和培养基进行充分搅拌，最后将搅拌好的乙醇-培养基混合物充分反复滴加，最后待培养基中的悬浮物
完全消失或降至最低时，再进行滤过，即可配制好经酒精消毒的培养基了。

干细胞培养基的配制和使用方法

干细胞培养基的配制和使用方法干细胞培养基是一种含有必需营养物质和生长因子的特殊培养基，用于维持和扩增干细胞的生长。

干细胞具有自我更新和多向分化为不同细胞类型的潜能，因此对干细胞的培养和扩增是研究和应用干细胞的关键步骤。

本文将介绍干细胞培养基的配制和使用方法。

一、干细胞培养基的配制1. 配制指南配制干细胞培养基之前，首先要检查培养基组分的完整性，确保每个成分的质量和纯度，并根据制造商提供的指南调整培养基组分的浓度和比例。

2. 材料- 培养基基础液：基础液是干细胞培养基的主要成分，通常为含有必需氨基酸、糖、盐和缓冲剂的无菌培养液。

- 营养添加剂：添加剂包括生长因子、血清替代物和其他辅助物质，用于促进干细胞的生长和增殖。

- 抗生素-抗菌剂：用于预防细菌、真菌和其他微生物的污染。

3. 实验室操作- 先将培养基基础液倒入无菌培养瓶中，根据组分比例和浓度要求，逐一添加营养添加剂和抗生素-抗菌剂。

- 使用无菌操作技术，确保培养基的无菌性。

- 轻轻混合培养基，避免产生气泡。

- 完成配制后，标明培养基的配制日期，封存并存放在冰箱中，避免高温和阳光直射。

二、干细胞培养基的使用方法1. 培养基预热在使用干细胞培养基之前，将培养基从冰箱中取出并封存，放置在室温下约30分钟至1小时，以达到室温或37℃的温度。

预热的目的是避免温度差异对细胞造成的不利影响。

2. 干细胞接种使用培养基预热的过程中，可进行前期准备工作，如准备所需培养器皿、工具和试剂。

接种干细胞时应注意无菌技术。

- 使用细胞培养器皿前，先用70%的酒精溶液或其他有效消毒剂对其进行消毒处理。

- 将培养基预热到37℃后，将适量的培养基加入培养器皿中。

- 取出干细胞，将其悬浮于培养基中并轻轻摇动培养器皿，以使干细胞均匀分布在培养器皿中。

3. 干细胞培养条件- 高湿度：干细胞需要在高湿度的环境下培养，可通过加入培养皿内的水槽或使用高湿度培养箱来实现。

- 低氧条件：干细胞在自然环境中通常在低氧条件下生长。

常用培养基配方范文

常用培养基配方范文培养基配方是微生物学研究的基础，它们提供了养分和条件，促进微生物的生长和繁殖。

常用培养基配方有多种，以下是几个常用的配方范文。

一、莱文斯坦－鲍德尔培养基（Luria-Bertani agar）配方：成分：1.蛋白胨：10克2.酵母提取物：5克3.食盐：10克4.琼脂：15克5.蒸馏水：1000毫升6.高氯酸钠（0.1M）：2毫升（pH7.2）制备方法：1.将蛋白胨、酵母提取物和食盐加入蒸馏水中，加热至溶解。

2.加入琼脂并搅拌均匀，再加入高氯酸钠调节pH值。

3.煮沸1~2分钟，然后分装入培养皿中。

注意事项：1.注意消毒操作，以防止污染。

2.琼脂的煮沸时间通常为15~20分钟。

二、营养琼脂培养基（Nutrient agar）配方：成分：1.蛋白胨：5克2.细胞色素：1克3.维生素B1：0.1克4.卵黄：10克5.食盐：5克6.琼脂：15克7.蒸馏水：1000毫升制备方法：1.将蛋白胨、细胞色素、维生素B1、卵黄和食盐加入蒸馏水中并加热溶解。

2.加入琼脂并搅拌均匀。

3.煮沸1~2分钟，然后分装入培养皿中。

注意事项：1.注意消毒操作，以防止污染。

2.煮沸时间可根据需要适当延长，但不要超过20分钟。

三、马尿素琼脂培养基（MacConkey agar）配方：成分：1.蛋白胨：17克2.硼砂：1.5克3.细胞色素：2.5克4.氯化钠：5克5.水合甲基红：0.03克6.钴绿：0.015克7.红绿二色砂：0.15克8.琼脂：13.5克9.蒸馏水：1000毫升制备方法：1.将蛋白胨、硼砂、细胞色素、氯化钠、水合甲基红、钴绿和红绿二色砂加入蒸馏水中并加热溶解。

2.加入琼脂并搅拌均匀。

3.煮沸1~2分钟，然后分装入培养皿中。

注意事项：1.注意消毒操作，以防止污染。

2.此培养基适用于选择肠道革兰氏阴性杆菌。

以上是常用的几个培养基配方范文，供参考使用。

在制备培养基时，需要注意消毒操作，以防止污染。

另外，不同微生物对培养基的要求也有所不同，可以根据实际需要进行配方的修改和优化。

小球藻培养基配方

小球藻培养基配方
我们为您提供了若干小球藻培养基配方：
1.Sulau藻细胞培养基：把1杯的蔗糖、3克的褐藻粉末、5克的
泡藻粉末、2克的卵磷脂、0.1克的胱氨酸溶液、及3克的酵母抽提物
混合放入2升的缸内；然后加入水至体积达6升，把pH值调节至7.2，并用50ml的盐酸拌和混合，再加入适量的谷氨酸把密度调节到
1.035g/L 左右，然后把汤体加热至90℃，保持2分钟，再稍凉后过
0.45um滤膜过滤，即可得到小球藻培养基。

2.CZW-6透明质酸培养基：这种培养基的组分包括：蔗糖2克，
K2HPO4 1克，KI 0.1克，MgSO4 0.2克，NaHCO3 1克，FeCl3 0.02克，Na2SiO3 0.5克，藻类维生素0.05克（或细菌维生素），CaCl2·2H2O 0.1克，pH调节到6.4～7.2（可适当有所调节），盐酸拌和、空气混
合等。

用温水稀释，然后加入谷氨酸把密度调节到1.035g/L左右，经
过热处理后即可得到小球藻培养基。

3T3-L1细胞培养

3T3-L1细胞培养一、复苏冻存的3T3-L1细胞1 从液氮罐中用镊子拿出冻存的细胞，迅速放入37 ℃浴中，溶解约1min 取出（要留小部分冰不融化）。

2 打开前用75%的酒精清洗冻存管外壁，打开后，移入小号培养瓶，立即加入4~5mL培养基，稀释DMSO，然后放入培养箱。

二、冻存的3T3-L1细胞1 当细胞长到70~80%时，消化细胞。

去除培养基，用5mL 1*PBS 洗去残留培养基，加入1mL 胰酶，轻晃培养瓶，使胰酶覆盖整个培养瓶底部，放入培养箱消化2~3min。

2 加入3~4mL DMEM(10%NBS) 终止消化，轻轻吹打使细胞均匀。

3 取1/5的量移入大培养瓶继续培养。

4取700uL加入冻存管中，，向冻存管中加入100uL DMSO，200uL FBS。

放入程序降温盒，再放入-80度冰箱过夜，第二天拿出放入液氮罐，记录存放位置。

5 每消化一次，细胞代数增加一次，要记录清楚。

三、3T3-L1细胞换液1 新复苏或消化的细胞，在种入新培养瓶5~6h或过夜后，观察细胞贴壁情况。

2 每两天换一次液；待细胞长到70~80%时，进行消化，消化步骤如上所述。

四、种入24孔板1 种入24孔板前，细胞要进行消化，步骤如上所述。

2 计算好传代和种入板中的量。

如：大号培养瓶中细胞长到70~80%进行消化，加入1.5mL胰酶消化，加入4mL 培养基终止消化。

其中0.5mL用于继续培养，剩余5mL, 每一24孔板需要1/5的量。

3 24孔板事先铺0.5%的明胶。

注意事项：1 从液氮中拿出冻存管时尽量不要用手碰，以免冻伤。

2 冻存管取出后迅速放入水浴中，培养基使用前可以先用37度预热。

3 冻存管打开前要用酒精消毒，防止污染。

4 尽快加入培养基稀释DMSO，防止DMSO对细胞毒性作用。

5 冻存复苏细胞遵循“慢冻快融”原则。

6 程序降温盒内是异丙醇，用5次更换一次异丙醇。

7 若没有程序降温盒，可将细胞放入4度冰箱1h，-20度冰箱1h，再放入-80度过夜。

细胞培养基的使用方法NEW

细胞培养基的使用方法NEW细胞培养基的种类繁多，细胞培养方式也较多，如何正确地使用培养基及最大程度地保持培养基的营养以维持细胞的生长，对每个细胞培养工作者都很重要。

培养基的使用依据不同的培养基种类、培养方式、细胞种类的不同而存在差异。

1 细胞培养液的构成细胞培养液指细胞生长的液体环境，一般指完全培养液，添加了血清、水解乳蛋白、各种添加剂等可以直接使用的培养液。

1.1 细胞培养基&血清模式血清对于在传统培养基配方中生长和增殖的大多数细胞系来说是需要的，因为大多数单独的培养基并不能提供细胞生长所需要的全部营养，如MEM培养基，较为常用的量为5%～10%的比例，而特殊的低血清培养基血清量可降至3%左右，细胞的形态和功能不受影响。

图1 BHK21-13第14代，MEM SLM培养基（SLM120）+3%NBS，100×注：SLM120为清大天一公司低血清培养基，左为培养24小时细胞密度，右为48小时细胞密度。

血清可在培养基灭菌后加入，也可与培养基混合后一起过滤。

血清的添加一方面补充了细胞生长、增殖所需的一些因子（如生长因子等），另一方面也增加了培养基的黏滞度，这样可以降低细胞在悬浮培养中或被胰蛋白酶消化后的损伤。

但是血清的加入也带来了很多问题，血清都是批量生产，各批之间差异很大，血清含一些对细胞产生毒性的物质，如多胺氧化酶、补体、抗体、细菌毒素等都会影响细胞生长，甚至造成细胞死亡。

血清的使用使得实验和生产的标准化困难，其中的蛋白质使得某些转基因蛋白生物药品生产中分离纯化工作很难完成。

血清质量问题还会对接种病毒以及毒价产生影响，例产毒少，毒价低。

1.2 细胞培养基&乳欧液模式化学合成培养基现虽已大规模使用，但在某些培养领域水解乳蛋白（Lactalbumin Hydrolysate ）仍在使用，以补充培养液中缺乏的氨基酸、小肽物质。

较为常用的方式是用汉氏（Hanks’ BSS）或欧式(Earle’s BSS)平衡盐溶液溶解水解乳蛋白（一般为5‰浓度），即成乳汉（欧）液，再与化学合成培养基（一般为MEM）按比例混合使用（如1：1）。

细胞培养基使用方法

细胞培养基使用方法
细胞培养基使用方法：
① 在开始实验前确保所有器具如培养皿移液管等已经经过高压灭菌处理并放置在超净工作台内备用；
② 根据所需培养细胞种类选择合适基础培养基如DMEM RPMI1640等并检查有效期避免使用过期产品；
③ 将所需量培养基倒入无菌瓶中加入适量血清抗生素等补充成分搅拌均匀直至完全溶解无沉淀物；
④ 使用pH计调节溶液酸碱度至适宜范围通常为7.2～7.4之间具体数值依据不同细胞系略有差异；
⑤ 将配置好的培养基放入37摄氏度水浴锅中预热10分钟左右使其温度接近人体体温方便细胞生长；
⑥ 在无菌条件下小心开启瓶盖用移液管吸取适量培养基注入事先准备好的细胞悬液中轻轻混匀；
⑦ 取出一定体积混合液转移至培养皿中注意不要形成气泡以免影响细胞贴壁效果；
⑧ 将装有细胞的培养皿放入CO2培养箱内保持37摄氏度5%二氧化碳气氛下静置过夜；
⑨ 次日观察细胞生长状态如形态分布密度等记录下初始情况作为后续跟踪依据；
⑩ 在细胞达到约80%汇合度时需进行传代操作即用胰蛋白酶消化后重新接种到新鲜培养基中；
⑪ 定期更换培养基一般每2～3天一次去除代谢废物补充营养成分同时检查是否有污染迹象；
⑫ 最后提醒在整个操作过程中都要严格遵守无菌技术规范防止外来微生物侵入污染细胞株；。

培养基配置基本步骤

培养基配置基本步骤嘿，你问培养基配置基本步骤啊？这事儿其实不难。

第一步呢，得先搞清楚你要培养啥玩意儿。

就像你要做饭得知道是给大人吃还是小孩吃一样。

要是培养细菌呢，和培养植物细胞那肯定用的培养基不一样哇。

比如说你要培养大肠杆菌，那你就得选适合大肠杆菌生长的培养基。

第二步，准备材料。

这就跟你做饭要买菜买调料一个道理。

你得准备各种化学物质啊，像什么葡萄糖啦、氨基酸啦、无机盐啦等等。

这些东西就像是培养基的“食材”。

你还得有容器，比如烧杯、烧瓶啥的。

可别拿个破碗就想配培养基哦。

第三步，开始称量。

这就像你做饭的时候要称盐巴、糖一样。

用天平把各种材料按照配方要求称好。

多一点少一点都可能影响培养效果哦。

比如说葡萄糖要是称多了，可能把细菌给“甜死”了。

第四步，溶解。

把称好的材料放到容器里，加上水，然后搅拌搅拌，让它们都溶解在一起。

这就跟你冲奶粉似的，得把奶粉搅和匀了。

要是有啥东西没溶解好，那可不行。

第五步，调 pH 值。

不同的生物对 pH 值的要求不一样。

就像有的人喜欢吃酸的，有的人喜欢吃甜的。

你得用酸碱调节剂把培养基的 pH 值调到合适的范围。

可以用 pH 试纸或者 pH 计来测一测。

要是 pH 值不对，生物可能就长不好。

第六步，灭菌。

这一步很重要哦。

就像你吃饭前要把碗洗干净一样，培养基也得消毒灭菌，不然杂菌进去了，就把你要培养的东西给搞坏了。

可以用高压蒸汽灭菌锅来灭菌。

举个例子吧，比如说你在实验室里要培养酵母菌。

你先搞清楚酵母菌需要啥样的培养基，然后准备好葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨等材料。

接着用天平称好材料，放到烧杯里加水溶解。

搅拌均匀后，用酸碱调节剂把 pH 值调到合适的范围。

再用 pH 试纸测一测，确保没错。

然后把配好的培养基放到高压蒸汽灭菌锅里灭菌。

灭菌完了，等培养基冷却下来，就可以接种酵母菌啦。

这样酵母菌就能在合适的环境里茁壮成长啦。

3T3L1细胞实验操作

3T3-L1细胞实验操作3T3-L1细胞实验操作3T3-L1 小鼠胚胎成纤维细胞（前脂肪）培养基配制（准备1L高压过的超纯水）1、DMEM粉倒入1L放旋子的烧杯，加灭菌水1000ml，盖锡纸磁力搅拌40分钟。

2、擦净，加入3.7g Na2CO3，盖锡纸磁力搅拌10分钟。

3、称2.38g HEPES（4℃保存），盖锡纸磁力搅拌20分钟。

4、拿过滤嘴、针筒，用针筒吸配好的培养基，通过滤嘴过滤至高压过的100ml瓶分装，4℃保存，用时加10ml血清配成10%FBS。

顺便先配诱导液：配好的培养基分装入100ml瓶中，90mlDMEM。

准备好FBS、IBMX、DEX、insulin（2μg/ml）先配两瓶100ml 10%FBS，A液：IBMX 1ml + DEX 100μl + insulin 250μl 入 100ml 10%FBSB液：insulin 250μl 入100ml 10%FBS （先过滤）细胞冻存（全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌）1、准备 DMEM（分装好的）* 1瓶，50 ml瓶 * 2，针，过滤器 * 1，DMSO试剂，冻存管。

2、配冻存液（10ml）：按5：4：1比例→培养基 5ml ：血清 4ml ：DMSO 1ml ，混匀。

3、拿出一个新的、标记好用针筒把过滤器弄在瓶口用针筒吸新配的冻存液，把针头摘掉，经过滤器把新配的冻存液滤到新瓶。

4、PBS清洗细胞，加完盖盖子，加在壁上，然后吸弃，换枪头吸（一对一）。

5、吸胰酶500μl（吸匀再用），放显微镜观察，消化完毕即吸弃（一对一）。

6、大皿加入2~3ml冻存液，打圈吹散，分装1ml至冻存管，勿离心。

7、-4℃ 30min，-20℃ 1h，-80℃ 2h，最后液氮冻存。

一、细胞复苏（准备10%FBS、晚上复苏）1、将从液氮取出冻存管放入37℃恒温水箱搅拌解冻。

2、将细胞悬液软管吸取至培养皿中，加入5~6 ml10%FBS，混匀。

简述培养基配制的一般程序

简述培养基配制的一般程序简述配制培养基的具体操作步骤: 1、根据配方要求,用量筒或移液管从每种母液中分别取出所需的用量,放入同一烧杯中,并用粗天平称取蔗糖、琼脂放在一边备用。

2、将称好的琼脂加蒸馏水300~400毫升,加热并不断搅拌,直至煮沸溶解呈透明状,再停止加热。

3、将所取的各种物质(包括蔗糖),加入煮好的琼脂中,再加水至1000毫升,搅拌均匀,配成培养基。

4、用1N的氢氧化钠或盐酸,滴入的培养基里,每次只滴几滴,滴后搅拌均匀,并用pH试纸测其pH 值,直到将培养基的pH值调到5.8。

5、将配好的培养基,分装到培养瓶中,并盖紧瓶口,瓶壁写上号码。

瓶中培养基的量约为容量的1/3或1/4。

细胞培养操作流程

细胞传代培养操作流程细胞复苏：1. 将新鲜培养基置于37℃水浴锅中回温，回温后喷以75%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。

如配置：50mL完全培养基(含10%FBS，1%青链霉素双抗)44.5mL基础培养基+ 5mL FBS + 0.5mL青链霉素双抗。

2. 戴防护手套后，自液氮罐中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，立即放入37℃水槽中快速解冻（避免冰晶重新结晶而造成细胞死亡），轻摇冷冻管使其在2分钟内全部融化，以75%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。

3. 将解冻的1mL细胞悬液缓缓加入细胞培养瓶内，再向瓶中加入10mL完全培养基(稀释比例为1:10)，混合均匀，放入37℃，5%CO2的恒温培养箱中培养。

取0.1ml解冻细胞悬液作存活测试。

(Sf9细胞在27℃生长，可不需CO2)4. 一般而言，细胞大都不需立即去除冷冻保护剂(例如DMSO)。

若要立即去除，则将解冻的细胞悬液加入含有5-10ml培养基之离心管内，离心1300rpm，5分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2培养箱培养。

若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。

传代培养：1.37℃恒温培养约48小时，待细胞长满80-90%后，从培养箱取出75cm2培养瓶，倒掉培养基。

加入5mLPBS缓冲液吹打以洗去残留血清，倒掉缓冲液。

2.沿壁（无细胞的一面）缓缓加入1mL胰酶溶液消化细胞约1min，轻轻摇晃，倒掉残余胰酶，将培养瓶置于恒温箱中约1min，拿出培养瓶轻轻拍打一下细胞贴壁的一面。

注意：最佳消化温度是37℃，加液后用移液管反复吹打分散细胞。

3.向瓶中加入5mL完全培养基，反复吹打均匀2min，从中取出20μl至0.5ml小离心管中，向管中加入80μl台盼蓝溶液，混匀，从混合液中取出10μl至盖好盖玻片的计数板上，计算细胞密度及活率。

4.将5mL细胞悬液全部吸出，分别接种1mL悬液到原培养瓶与另一新的培养瓶中，其余舍弃。

细胞培养试剂及操作流程

实验规范化流程一、细胞培养所需1、10%FBS 1640培养液。

2、10%FBS DMEF/12培养液。

3、10%FBS DMEM/High Glucose 培养液。

4、PBS ：商品化的粉末，一袋溶于2L 去离子水中，高压后4℃保存。

5、胰酶6、冻存液：10%DMSO 、>10%FBS ，其余成分为16407、真核抗生素：G418: 50mg/mlMDA-MB-231 800ug/mlMCF-7 800ug/ml SK-BR3 100ug/mlT47D 400ug/ml)嘌呤霉素（Puromycin ）:10mg/mL 、MCF-7 4ug/ml T47D 1ug/mlMDA-MB-231 5ug/ml潮霉素（Hygromycin B ）:50mg/mL T47D 200ug/mlMDA-MB-231 800ug/mlMCF-7 50ug/ml 8、原核抗生素：双抗（抗青霉素、链霉素）（使用浓度：1%原液）环丙沙星左氧氟沙星（储存浓度5mg/ml ，使用浓度5ug/ml ）9、细胞因子：IL-6、EGF （10ug/ml ）10、抗肿瘤药物：阿霉素（储存浓度50Mm,使用浓度0.01mM ）一、细胞培养相关技术1、细胞复苏准备：37℃水浴锅、培养液、15ml 离心管、滴管、培养瓶或培养皿试验流程：（1）将细胞从-80℃或液氮取出，遵”慢冻速溶“的原则，迅速在37℃下使其液化。

（2）将融化的细胞悬液加入适量新鲜培养液稀释吹匀，转移到15ml 离心管内。

（3）将离心管以1000rpm 转速离心5min 。

（4）小心弃去上清，最好用枪头除尽，加入新鲜的培养液6ml ，重选吹匀后转移到细胞培养瓶或培养皿，放入37℃、5%CO2细胞培养箱内培养。

2、细胞传代准备：胰酶、培养液、培养瓶或培养皿、15ml离心管、滴管实验流程：（1）将覆盖率达80-90%的对数生长期细胞弃去培养液，尽量将培养液洗净，必要时加PBS冲洗，以防止培养液对胰酶的终止作用。