纤维素降解菌的分离鉴定及固态发酵条件
纤维素分解细菌的分离和鉴定
纤维素分解细菌的分离和鉴定一．实验目的：1.研究低温环境下纤维素降解细菌的分离与鉴定．2.采用低温培养的方法从秸秆堆肥中筛选出3株分解纤维素的细茵。
3.通过PCR克隆这3株茵的16s rDNA并与相似菌株做比对．进一步构建分子进化树．来研究其分类情况。
4.综合其个体形态、茵落形态、生理生化特征、16S rDNA发育树构建结果等分类依据。
二．实验原理：细菌进行化能异养、短杆状、无出芽分裂、好氧、革兰氏染色阴性．无芽孢、无丝状菌体、有细胞壁且能独立生存。
应为其第二部分滑动细菌或第七部分的假单胞菌类。
由于滑动细菌能在“固体表面和汽一水交界面缓慢滑动”，故其固体菌落边缘应不整齐，且其一般形成亮色肉眼可见的子实体。
将灭菌的滤纸蘸取无菌生理盐水后贴在已凝固的平板上，用接种环蘸取土样，点样在平板滤纸上，15℃下培养10 d。
用接种环从有滤纸水解透明圈的单菌落处刮取细菌，在贴有滤纸的初筛平板上划线，计数并且观察。
三、实验仪器：1、材料试验材料为背阴处长时间堆放的秸秆堆肥表层；2、培养基：初筛培养基。
浓缩10倍的赫奇逊固体无机盐培养基”。
：啦嘞1．00 g，MgS04·7H20 0．30 g，NaCl 0．10 g，F'eCl3O．0l g，NaN03 2．50 g，CaCi2 0．10 g，琼脂18．00 g，蒸馏水l000lnl，pH值7．0～7．2．121℃灭菌20min。
无淀粉滤纸(浙江富阳纸厂)用浓度l％的醋酸浸泡一夜后用浓度2％的Na-2C03水溶液洗至中性，晾干备用。
把上述处理过的滤纸剪成直径约为8 ca的圆形滤纸片．放在干净的平皿中，用报纸包好．采用湿热的方法灭菌；3、复筛培养基。
浓缩10倍的赫奇逊固体无机盐培养基：啦P04 1．009，m．庐04‘7H200．309。
NaO 0．109．FeCl30．01g，NaN03 2．50 g．CaCl20．10g，羧甲基纤维素钠lO．00 g，琼脂18．00g，蒸馏水10130ml，pH值7．0—7．2，121℃灭菌20 min。
纤维素降解菌的分离与鉴定
培养基的配置和分装
纤维素琼脂培养基： • (NH4)2SO4 2 g , • MgSO4· 7g， • H2O 1g, • NaCl 1g, • CaCO3 2g, • 水 500mL ,
• 121 ℃ 灭菌20 min，倒平板后,盖上不平板大小一致的无菌滤纸
（注意：滤纸要用秲醋酸浸泡一夜 ，用碘液检查是否有淀粉 ，若已去除完全 ， 则用 2％苏打水冲洗至中性，干热灭菌 后备用 ）。
环境中纤维素降解菌的筛选和初步鉴定
生物技术班
实验目的 实验原理 实验器材 实验步骤 实验结果与分析
实验目的 • 从环境中筛选出能降解纤维素的菌株 • 初步鉴定出菌株所属的类型
试验原理
• 纤维素酶酶系组成及降解机理 纤维素酶酶系包括内切葡聚糖酶(Cx酶）、外切 葡聚糖酶(Cl酶)，[来自真菌简称CBH，来自细菌简 称Cex)]和B．葡聚糖苷酶l，也称纤维二糖酶，简 称BG)。滤纸酶(FPase)活力代表了三种酶协同作用 后的总酶活力。 纤维素是有许多葡萄糖分子通过β-1，4一糖苷 键连接起来的大分子物质，对其的水解需要上述 三种酶的共同作用。酶的种类完整性、各种酶之 间的比例兲系等都会影响到纤维素酶的整体活力 。
分离
（1）无菌条件下，取富集后的培养液将土壤悬液秲释成101~10-7系列浓度。
（2）分别用秱液器精确地吸取各秲释菌液0.2 ~0.3 mL，对号 先后涂布于编好号刚果红培养基平板,（涂布时涂布棒要从 浓度小的梯度开始，将加入平板培养基上的土壤秲释液在 整个平板表面涂匀，涂完一个平板用酒精灯灭菌）。置于 30 ℃ 培养箱中，倒置培ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ一周。
初筛
以下各步骤均在无菌条件下进行。 （1）称取土壤样品10 g，倒入含有90 mL水和玱璃珠的三角 瓶中振荡5 min，使土样充分打散。（注意：等水冷却了 再倒入土样。） （2）取 5 mL悬液加入盛有 50 mL富集培养基 (纤维素琼脂培 养基 )的三角瓶,在 28 ℃和 150 r/min下, 振荡培养 3~ 5 d后 秱取 5mL培养液至另一盛有新鲜富集培养基的三角瓶中继 续培养。
文档：分离纤维素分解菌实验操作步骤
分离纤维素分解菌实验操作步骤实验的具体操作步骤如下1.土样的采集土壤中的微生物，大约70%～90%是细菌。
细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数分布在距地表约3～8cm的土壤层。
因此，土壤取样时，一般要铲去表层土。
另外，土样的采集要选择富含纤维素的环境，这是因为在纤维素含量丰富的环境，通常会聚集较多的分解纤维素的微生物。
2.选择培养3.富集培养在将样品稀释涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基之前，先通过选择培养增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。
富集培养所需要的仪器有：250ml锥形瓶、天平、药匙、玻璃棒、电炉、摇床、玻璃珠、称量纸等。
选择培养基的制备比例见下：纤维素分解菌的选择培养基纤维素粉 5gNaNO31gNa2HPO4•7H2OKH2PO4MgSO4•7H2OKCl酵母膏水解酪素将上述物质溶解后,用蒸馏水定容到1000ml按上表比例配制50ml选择培养基。
在250ml锥形瓶中装入50ml培养基，放5～6颗玻璃珠，用8层纱布做成瓶塞，将瓶口塞紧，再在瓶塞外包裹两层牛皮纸，用线绳扎紧，在121℃下高压蒸汽灭菌20min。
称取土样20g，在无菌条件下加入装有50ml培养基的锥形瓶中。
将瓶置于摇床上，在30℃下振荡培养3～4d，至培养基变浑浊。
4．梯度稀释所需仪器：试管（7支）、移液器、枪头。
需要先经高压蒸气灭菌的仪器：试管（每只内装9ml蒸馏水）、枪头（黄色、蓝色）。
用量程为1000µL的移液管从富集培养土壤液中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的试管中充分混匀。
然后换枪头从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml 无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的土壤溶液。
5.刚果红染色法分离与观察（涂布平板）所需仪器：无菌培养皿（12个）、涂布器（3个）、移液器、枪头、温箱等。
需要灭菌的仪器：无菌培养皿（12个）、涂布器（3个）、移液器、枪头。
玉米秸秆纤维素降解菌的分离及发酵条件优化
玉米秸秆纤维素降解菌的分离及发酵条件优化作者：向殿军满丽莉张春凤等来源：《安徽农业科学》2014年第04期摘要[目的]研究玉米秸秆纤维素降解菌的分离与产酶条件。
[方法]从富含腐烂玉米秸秆的土壤中分离筛选到1株能降解纤维素的真菌C01，经形态观察和ITS序列分析，初步鉴定该菌种，并对该菌产酶条件进行优化。
[结果]玉米秸秆纤维素降解真菌最佳接种种龄5 d，培养液初始pH为5，接种量12%；培养时间5 d的优化条件下，酶活力达1.76 IU/ml。
该菌株对玉米秸秆降解效果较好，优化条件下，7 d降解率达66.8%。
[结论]该研究可为提高玉米秸秆的利用率提供优质的菌种资源。
关键词玉米秸秆；纤维素降解；分离；产酶条件中图分类号S181.3文献标识码A文章编号0517-6611（2014）04-01159-03基金项目牡丹江市科学技术计划项目（玉米秸秆纤维素降解菌的选育及应用研究，G2013n0012）的阶段性研究成果。
作者简介向殿军（1978-），男，黑龙江望奎人，讲师，博士，从事农业基础研究。
*通讯作者，讲师，博士，从事食品基础研究。
纤维素是构成植物细胞壁的主要成分，占植物干重的1/3～1/2，全球一年间由光合作用生产的纤维素约1.5×109 t[1-2]。
我国是一个农业大国，每年的秸秆产量约7.0亿t，其中玉米秸秆占2.2亿t[3]。
纤维素中由于存在许多高能的氢键，因此其水解、利用均很困难，89%的秸秆以堆积、荒烧等形式直接倾入环境，造成极大的污染和浪费。
秸秆还田可补充土壤有机质，维持土地利用的物质平衡，利于农业可持续发展，是降解秸秆的一种良好途径。
相对于间接还田方式，玉米秸秆原位还田可减轻劳动强度，节省成本，已经在农区广为推广应用。
然而，我国北方地区玉米收获、秸秆还田是在深秋时节，由于气候干燥、温度偏低，原位还田的玉米秸秆自然腐解速度缓慢，给农业生产带来许多不利影响，导致秸秆还田应用阻力较大，应用面积小，配施适当的秸秆降解菌剂是解决该问题的有效方法[4-5]。
纤维素菌分离和鉴定的方法
纤维素菌分离和鉴定的方法一、概述纤维素由于其特殊的生化性质，一直是微生物学和食品工业研究的关注焦点。
特别是纤维素的分解，除了传统的化学方法，生物法也是目前广泛采用的技术之一。
对纤维素酶活性和产酶微生物的分离和鉴定，是纤维素生物技术研究的重要内容。
纤维素分解酶是产生于微生物体内的一类酶，广泛存在于真菌和细菌中，可划分为纤维素酶和半纤维素酶两大类，规律的利用这些微生物菌种，开发新型的纤维素分解酶。
纤维素的微生物分解菌种较多，其中许多菌种能分泌出多种细胞外酶，如单糖的转化酶、纤维素酶、半纤维素酶、葡萄糖氧化酶、木糖酶、果糖酶和葡聚糖酶等。
多种新型有机物的产生依赖于工业生产中微生物的应用技术，目前各国纤维素降解的菌株和发酵产物分离和鉴定方法越来越多。
纤维素菌的分离可采用筛选、稀释和富集等方法。
实际应用中，常用的分离方法有：（一）厌氧富集法：根据纤维素菌能够在厌氧条件下进行生长和代谢的特点，采用富集培养方法，利用耐氧性微生物限制氧气的供应，引起产生厌氧性纤维素分解菌类，然后推广领域固定化、发酵和应用。
可根据繁殖时间将厌氧富集法分为短时间富集法和长时间富集法。
（二）筛选法：在纤维素富含的自然环境或人工培养环境中进行筛选。
先用一些微生物菌株做为预培养菌种，加入富含纤维素的培养基，通过短期采取接种、稀释、摇动等处理方式，寻找纤维素分解酶活力最高的培养物，然后进行分离纯化、性质鉴定。
（三）稀释法：将样品依一定比例进行稀释，将稀释后的液体均匀地均匀的加入纤维素培养基中，用深层培养的方式进行发酵，进行分离鉴定纯化。
稀释法适用于富含纤维素且菌株较多的培养基的菌群筛选。
（一）形态学特征鉴定法：根据菌株的形态学特征进行鉴定。
此方法是最基本也是最重要的鉴定方法之一。
菌株的形态学特征包括形状、结构、颜色和大小等，进一步对分离的菌株进行正确定义。
常用的形态学特征包括：形态特征、结构特征、色素特征和大肠杆菌。
（二）生理生化特征鉴定法：通过菌株的生长特性在不同培养基中的表现，或菌体在不同生长条件下表现的生化过程，如碳源利用情况，氮源利用情况，温度和pH值的影响等，进行鉴定。
纤维素分解菌的分离筛选和产酶条件优化 (1)
透明度
不透明 不透明 不透明 不透明
38
2. 2 纤维素刚果红鉴别培养基的分离结果 初筛的四个菌株在刚果红鉴别培养基上水解圈 大小如表 2所示, 水解圈直径 /天数壁纸大致反应酶 活高低. 各菌株均能在羧甲基纤维素钠培养基上较 好生长, 其中菌株 H - 3和 H - 4长的最快, 其余菌 株则生长缓慢, 而 A 值 H - 3最大, 可见 H - 3分解 纤维素类物质的能力最强 ( 表 2).
纤维素刚果红鉴别培养基从不同分离源分离筛选出 对纤维素具有良好分解效果的纤维素分解菌, 并对 其酶活力进行了测定, 筛选出 1株纤维素酶活力较 高的优良菌株.
1 材料与方法
1. 1 材料 常年堆积秸秆的腐殖土 1. 2 培养基 1. 2. 1 选择富集培养基: 纤维素粉 5 g, N aNO 3
1 g, N a2H PO 4 7H 2 O 0 5 g, KH2 PO4 0 9 g M gSO4 7H2O 0 5 g, KC l 0 5 g, 酵母膏 0 5 g,
水解酵素 0 5 g. 将上述物质溶解后, 用蒸馏水定容 到 1 000 m .l
1. 2. 2 初筛分离平板培养基: 采用文献介绍 [ 5 6] 的方法配制初筛分离平板培 养基 1. 2. 3 复筛 平板 培养 基[ 7] : CMC - N a 10 g, N a2HPO4 1. 25 g, KH2 PO4 1. 25 g, 蛋白胨 1. 25 g, 酵母膏 0. 25 g, 蒸馏水 500m ,l 自然 pH, 121 灭菌 20m in. 1. 2. 4 扩大培养基: 马铃薯 100 g, 蔗糖 10 g, 琼 脂 8. 5 g, 蒸馏水 500m ,l 自然 pH, 121 灭菌 20m in. 1. 2. 5 产 酶 发 酵培 养 基: 麸 皮 80 g, 秸 秆
纤维素降解微生物的分离与鉴定方法解析
纤维素降解微生物的分离与鉴定方法解析纤维素是植物细胞壁的主要成分之一，它是一种由大量葡萄糖分子通过β-1,4-糖苷键连接而成的多糖。
纤维素的降解对于生物能源开发、废弃物处理和环境保护具有重要意义。
而纤维素降解微生物则扮演着关键的角色。
因此，分离和鉴定纤维素降解微生物的方法显得尤为重要。
本文将介绍几种常用的纤维素降解微生物的分离与鉴定方法。
一、平板法平板法是最为常用的纤维素降解微生物分离方法之一。
具体操作如下：1. 准备培养基：将适合纤维素降解微生物生长的培养基高温固化。
常用的培养基包括CMC培养基和Avicel培养基。
2. 稀释样品：将待分离的纤维素降解微生物样品进行适当稀释，通常采用百倍至千倍的稀释倍数。
3. 倒平板：将稀释后的样品均匀倒在高温固化的培养基上，并利用均衡板将其平均分布。
4. 培养：将平板培养在适当的温度下，一般为30-37℃，孵育时间根据需要而定。
5. 分离：观察培养基上的菌落情况，挑取个别菌落进行分离纯化。
二、液体培养法液体培养法是另一种常用的纤维素降解微生物分离方法。
主要包括以下步骤：1. 准备液体培养基：选取适合纤维素降解微生物生长的液体培养基，如液体CMC培养基、液体Avicel培养基等。
2. 接种：将待分离的纤维素降解微生物样品接种到含有相关培养基的试管中。
3. 培养：将试管放置于摇床或恒温培养箱中，在适当的温度和转速条件下培养一定时间。
4. 分离: 通过稀释方法，将培养液中的微生物进行分离纯化，得到单菌株。
三、生理生化特性分析对于分离的纤维素降解微生物，进一步进行鉴定需要进行生理生化特性分析。
常见的特性分析包括以下内容：1. 糖类利用能力：在各种糖类培养基上观察微生物的菌落形态和生长情况。
2. pH和温度适应性：分析微生物在不同pH和温度条件下的生长状况。
3. 酶活性检测：测定微生物产酶的能力，如纤维素酶、β-葡萄糖苷酶等。
4. 生理代谢产物分析：通过气相色谱-质谱联用技术或其他适当的方法，分析微生物在纤维素降解过程中产生的代谢产物。
纤维素分解菌的分离和鉴定
纤维素降解菌类的分离与鉴定系列实验一、实验背景纤维素是植物细胞壁主要成分，属于多糖类物质，是地球上数量最大的可再生资源。
如能利用微生物将其转化为生物产品或生物能源，即可缓解能源短缺、解决环境污染，又能形成新的产业。
由于在自然界中存在着大量产纤维素酶的细菌和真菌，因而纤维素的生物降解主要依赖于微生物的作用。
从20世纪40-50年代起，针对产纤维素酶的微生物的分离筛选就进行了大量的工作，并逐步建立起一套较完整的分离筛选方法。
迄今为止有关纤维素降解菌分离筛选的研究报导已有很多，如细菌中的生孢噬纤维菌属、噬纤维菌属及纤维单胞菌属等；放线菌由于能形成芽孢，与真菌相比较耐高温和各种酸碱度，故在高温阶段放线菌对分解木质素和纤维素起着重要的作用。
主要有诺卡氏菌属、链霉菌属、芽孢杆菌属及小单胞菌属等；真菌中研究较多的是青霉属、根霉属、曲霉属等，其中以木霉属的菌株纤维素酶活较高。
以羧甲基纤维素钠和添加少量葡萄糖作为碳源，培养纤维素酶产生菌株，培养一定时间后，经刚果红染色和稀碱液固定，在菌落周围形成透明水解圈，根据透明圈的大小，快速定性鉴定纤维素酶产生菌酶活大小。
与传统纤维素酶活检测方法比较，本方法菌丝生长快，两天后菌落经染色，透明圈边缘清晰，直观性强，与酶活力成一定线性关系。
纤维素是世界上所有植物的组成部分，是地球上最为丰富且可再生的资源。
随着世界能源形势趋于恶化，环境问题日益加剧，利用纤维素生产有高附加值资源的以维持人类可持续发展的研究方向近年来逐步成为科学研究的热点方向。
利用微生物将纤维素、半纤维素降解转化为生物产品或生物能源即可缓解能源短缺、解决环境污染，又能形成新的产业。
因此分离和筛选高酶活性的菌株是有效利用纤维素物质的关键。
二、实验目的从目标试样中分离筛选出具有降解纤维素能力的菌株。
三、实验材料：1、样品的采集1）风干土样E4-1、E2-6、E2-6试样。
2）潮湿土样E4-1、E2-6、E2-6试样。
3）牛粪样品2份以上实验材料全部取自三教微生物实验室冰箱中；2、培养基1）CMC培养基2）LB培养基3）高氏1号培养基4）PDA培养基3、其他物品天平，称量纸，药匙，试管架，涂布器、摇床、烘箱、灭菌锅、瓶子、45ml无菌水（带玻璃珠），含9ml无菌水的试管，无菌培养皿，1ml及0.08ml移液管。
纤维素降解菌的分离与筛选微生物资源的开发与利用
纤维素降解菌的分离与筛选微生物资源的开发与利用纤维素是一种广泛存在于自然界中的高分子有机化合物，由大量的葡萄糖分子组成。
在生物学中，纤维素是植物细胞壁的主要组成部分，也是陆地生态系统中最常见的有机物质之一。
然而，由于其结构复杂、难以分解，纤维素对于生物体的降解造成了很大的挑战。
而纤维素降解菌就是一类能够分解、降解纤维素的微生物。
它们通过产生纤维素酶，将纤维素分解成更小分子的糖类，从而为自身提供能量和营养物质。
这类菌种在生物能源、环境保护、农业生产等方面具有重要的应用潜力。
因此，分离与筛选纤维素降解菌，开发和利用其微生物资源，对于推动生物技术的发展和解决环境问题具有重要意义。
纤维素降解菌的分离是研究者们开展微生物资源开发与利用工作的第一步。
在分离纤维素降解菌时，一般会从自然环境中选取一些能够产生纤维素降解酶的样品，如土壤、淡水等，进行采样。
接下来，通过在富含纤维素的培养基上进行接种和筛选培养，通过观察菌落和菌液的形态、颜色等特征，以及通过测定降解效果，最终得到纤维素降解菌的纯培养。
筛选纤维素降解菌的关键是通过对菌株的降解能力评价。
这种评价可以通过孔板筛选、固体培养基筛选以及液体培养基筛选等方式进行。
其中，孔板筛选是最常用的方法之一。
通过孔板上的纤维素固体培养基，可以筛选出具有较强纤维素降解能力的菌株。
此外，在液体培养基中添加纤维素底物，通过测定底物的降解率，也可以评价菌株的降解能力。
纤维素降解菌的开发与利用离不开对其微生物资源的研究和应用。
一方面，研究者们可以通过对纤维素降解菌的基因组学、蛋白质组学等方面的研究，了解其纤维素降解途径和关键酶系统，为进一步优化菌种提供理论基础。
另一方面，纤维素降解菌的应用潜力很广泛。
例如，通过改造纤维素降解菌的基因，可以增强其降解能力，使其在生物质能源开发中发挥更大的作用；同时，纤维素降解菌的应用还可以在纸浆工业、饲料添加剂以及餐厨垃圾处理等方面发挥积极作用。
总之，纤维素降解菌的分离与筛选是开发与利用其微生物资源的关键步骤。
纤维素分解细菌的分离和鉴定1`
进行多序列比对并构建系统发育树。
革兰氏染色 菌体形状 Gram’ s Bacterial
staining shape
荚膜
+ + +
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
芽孢 运动性
+ + +
菌体大小
Bacteria μ size ∥ m 1. 0～1. 5 × 1. 8～2. 8 1. 2～1. 5 × 2. 0～2. 5 1. 0～1. 5 × 2. 5～3. 2
图1 菌株 WH 12 对滤纸的降解
Fig. 1 The degradation of filter paper with strain WH 12
将获得的 PCR 产物送交上海生工生物工程技术服务有 限公司测序。
1. 7. 3 序列比对与系统发育树的构建。 将测得的 16S rDNA
表1 3 株纤维素降解菌的个体形态观察结果
对3株菌在复筛培养基上15进行形态观察结果见表2菌株wh12对滤纸的降解fifilterpaper株纤维素降解菌的个体形态观察结果tablndividualmorphologicalobservatihreestrainscellulosedegradingbacteri菌种strai革兰氏染色grastaining菌体形状bacterialshape荚膜capsula芽孢gemma运动性motility菌体大小bacteri株纤维素降解菌的菌落形态观察tablcolonialmorphologicalobservatihreestrainscellulosedegradingbacteri菌种strai大小sizemm颜色color干湿状况drywetconditions形状shape高度height透明度transparency边缘edgewh1扁平半透明整齐wh3扁平半透明整齐wh12不规则圆凹下近透明整齐可见3株菌具有不同的菌落形态
微生物分离纤维素降解菌的筛选与分离
微生物分离纤维素降解菌的筛选与分离纤维素是一种广泛存在于自然界中的有机化合物，它是植物细胞壁的主要组成部分。
纤维素具有高度的生物降解性，然而，其高度结晶性和复杂的结构使其难以被常规的酶解系统降解。
在生物领域中，微生物分解是一种有效且环保的方法，因此，筛选和分离纤维素降解菌对于提高纤维素降解效率具有重要意义。
一、筛选纤维素降解菌的方法1.1 培养基的选择筛选纤维素降解菌的第一步是选择合适的培养基。
常用的纤维素降解培养基包括CMC（羧甲基纤维素钠）、Avicel（微晶纤维素）、Whatman No.1滤纸等。
这些培养基能够提供纤维素降解菌所需的碳源和营养物质，有利于菌群的生长和繁殖。
1.2 筛选方法传统的筛选方法是利用纤维素作为唯一的碳源，在培养基中培养环境中的微生物，通过测定产酶能力来判断纤维素降解菌的存在。
常用的方法有：（1）红色亚甲基纤维素（RAC）将纤维素培养基添加亚甲基蓝等指示剂，在纤维素降解区域由蓝色转变为红色，表明纤维素被降解。
（2）半定量筛选利用葡萄糖法测定纤维素降解能力。
在培养基中添加不同浓度的纤维素，观察菌落的生长情况和菌液中的葡萄糖含量，评估纤维素降解能力。
（3）放射标记纤维素将放射性同位素标记在纤维素分子上，通过测定纤维素的解脱率来评估菌株的降解能力。
二、纤维素降解菌的分离与鉴定2.1 分离方法从自然环境中分离纤维素降解菌是筛选过程的关键步骤之一。
常用的分离方法包括：（1）稀释平板法将适当稀释的样品在纤维素培养基上均匀涂布，经过一段时间后，将生长的菌落分离并培养纯种。
（2）可溶性物质包埋法将样品与纤维素培养基搅拌均匀，接种到含有纤维素的胶状物上，培养一段时间后，可分离出纤维素降解菌。
2.2 鉴定方法为了确定分离的菌株是否为具有纤维素降解能力的菌株，需要进行鉴定。
常用的鉴定方法包括：（1）形态学鉴定观察菌落的形态、颜色和菌落边缘等特征，使用显微镜观察细胞的形状和结构。
（2）生理生化特性鉴定测定菌株的氧耗、氧释等生理特征，通过测定菌株对不同碳源和氮源的利用情况来判断其代谢特性。
纤维素分解微生物的分离和筛选方法
纤维素分解微生物的分离和筛选方法纤维素是植物细胞壁的主要成分之一，具有广泛的应用前景。
然而，纤维素的分解一直是科学家们面临的难题之一。
为了解决这一难题，研究人员们积极寻找能够高效分解纤维素的微生物，以进一步开发出高效纤维素降解酶，促进生物能源和生物材料的开发利用。
本文将介绍纤维素分解微生物的分离和筛选方法。
一、样品来源和处理为了获得纤维素分解微生物，首先需要合理选择样品来源。
常见的样品来源包括土壤、沉积物、动物肠道、植物中等。
样品应进行一系列处理，如样品的收集与保存、溶液的筛选和分离、菌液的扩培等。
样品的收集和保存要注意避免样品受到污染和降解。
溶液的筛选和分离可以通过稀释液、过滤和分离培养等方法进行。
二、培养基的选择正确选择适宜的培养基对于纤维素分解微生物的分离和筛选至关重要。
纤维素分解微生物主要是厌氧和好氧微生物，因此可以根据纤维素的性质选择合适的培养基。
常用的培养基有液态和固态培养基，可以根据具体实验需求选择合适的培养基成分，如添加纤维素、蛋白质、矿物质等。
三、分离和筛选方法1. 纤维素分解菌的分离方法（1）稀释涂布法：将样品溶液稀释至适宜浓度，利用稀释液进行涂布培养，然后观察并选取纤维素分解环带较纯的菌落进行分离。
（2）筛选法：将样品溶液通过滤膜进行过滤，得到含有微生物的滤饼，然后将滤饼均匀涂布在含纤维素的固体培养基上进行培养。
（3）玻璃珠破碎法：将样品溶液与玻璃珠混合后进行振荡或超声破碎，使微生物从样品中释放出来，然后以相同的方式将混合液稀释后通过涂布的方式进行培养。
2. 微生物纤维素分解能力的筛选方法（1）纤维素降解活性测定：通过检测微生物降解纤维素后所产生的还原糖、酸、乙醇等物质的产量来评估微生物的纤维素降解能力。
（2）纤维素酶活性测定：利用酶学方法检测微生物分泌的纤维素酶的活性，包括纤维素酶活力、纤维素酶种类及其酶解产物等。
四、分离菌株的鉴定和特性分析通过形态学、生理生化特性以及分子生物学方法，对纤维素分解微生物进行进一步的鉴定和特性分析。
纤维素分解微生物的分离与鉴定
环境微生物技术实验总结报告一、国内外研究进展：①纤维素资源据不完全统计，全球每年通过光合作用产生的植物物质高达1.8×1011 t，这些植物物质所含的能量相当于全球人类每年能量消耗量的20倍，食物中所含能量的200倍。
纤维素是构成植物细胞的基本成分，纤维素占全球植物总干重的30%一50%，是地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物，它存在于所有植物当中。
在生物界中，结合于有机体中的碳达27×1010t，在自然界有机体中构成纤维素的碳约占40%，据此估算，在植物界中纤维素的总量约达26.0×1010t，而且自然界中的植物原料是年复一年地不断生长和更新的，可以说，纤维素在自然界中是一种最丰富的可再生的有机资源。
纤维素是一种不能被大多数动植物直接利用的多糖物质。
但对人类来说只要能将其降解成小分子物质，纤维素就会成为一种有广阔应用前景的资源。
而且这种潜在的资源数量是惊人的，其中的大多数作为绿色植物的成分在维持生态平衡中起作用而不宜利用，但是仍有数量可观的纤维素由人类生活和生产产生，它们主要存在于农作物秸秆和城市垃圾之类的废弃物中。
灾荒或战乱造成的粮食危机依然是正存在的和潜在的威胁;随着全球经济的飞速发展，地球上石油、煤炭的储量正以惊人的速度减少，能源危机成了世界大多数国家所面临的一个严峻问题;由于对资源的破坏性开采和利用，人类赖以生存的环境正在不断地恶化，对可再生资源利用的研究与开发的可持续发展战略己在世界各国逐步展开。
如何处理和利用废弃纤维素将成为一个十分紧要的问题。
②农业废弃物资源的利用现状植物纤维素资源的开发利用对解决粮食和能源短缺以及环境污染问题有极其深远的意义。
我国的纤维素资源极为丰富，每年的农作物秸秆产量达5.7x107吨，约相当于北方草原年打草量的50倍。
但是，农作物秸秆产生数量多且产生时间集中(每年到收获季节农村就会有大量的秸秆产生)，而我国的农作物秸秆主要用于燃料、畜禽饲料与自然堆肥，不仅利用效率低，而且随着农村生活水平的提高，农作物秸秆成为农村固体废弃物的主要来源。
白酒糟纤维素降解菌的分离筛选及发酵条件优化
白酒糟纤维素降解菌的分离筛选及发酵条件优化宁露佳，刘倩楠，景 雯，杨月轮,李彦芹*收稿日期：2020-12-07修回日期：2021-02-06基金项目:河北大学橫向课题(2016-01)作者简介:宁露佳(1996-)，女，硕士研究生，研究方向为微生物学。
*通讯作者:李彦芹(1965-),女,副教授，本科，研究方向为微生物和免疫学研究m(河#大学生命科学学院，河+保定071002)摘要:该试验将松针腐殖土样品在酒糟富集培养基中富集，采用刚果红染色和滤纸崩解初筛,3,5-二硝基水杨酸(DNS)法复筛筛选的纤维素 ，对其进行子生物鉴定，并其产条件进行优化，结果表明， 得到 的纤维素 M5,经ITS rDNA 序列分析鉴定为棘抱木霉(TrichoNerrna asperellu ；。
其在发酵温度20 !、初始pH 值为3、酒糟为碳源、牛肉膏为氮源，发酵 5 d 时竣甲基纤维素(CMC)酶活为9.17 U/mL ，滤纸为3.50 U/;L ；菌株M5所产的纤维素酶的最适反应温度为55关键词：白酒纤维素 条件优中图分类号：X797文章编号：0254-5071 (2021)05-0119-05doi:10.11882/j.issn.0254-5071.2021.05.022引文格式:宁露佳，刘倩楠，，等.白酒糟纤维素的 条件优[J].中国酿造，2021，40⑸：119-123.Isolation, screening and fermentation conditions optimization of cellulose-degrading bacteria indistillers grainsNING Lujia, LIU Qiannan, JING Wen, YANG Yuelun, LI Yanqin *(College oULiUe Science, Hebei University, Baoding 071002, China)Abstract ： In this experiment, pine needle humus soil samples were enriched in distiller's grains enrichment medium. After congo red staining and initial screening of filter paper disintegration, the cellulose-degrading strain was screened by DNS method and identified by molecular biological technique, and the enzyme-producing conditions were optimized. The results showed that a cellulose-degrading strain M5 with high enzyme activity was obtained by 3,5-dini- trosalicylic acid (DNS) method, and the strain was identified as Trichoderma asperellum by ITS rDNA sequence analysis. The results showed that the enzymeactivities of c arboxy methyl cellulose (CMC) and filter paper enzyme was 9.17 U/ml and 3.50 U/ml, respectively, at the condition of fermentation temperature 20 !, initial pH value 3, distiller's grains as carbon source and beef extract as nitrogen source. The optimum reaction temperature of cellulase produced bystrain M5 was 55 !.Key words ： distiller's grains; cellulose degrading bacteria; isolation; screening; condition optimization酒糟是酿酒产业生产的主要副产物，含有蛋白质、粗 纤维、有机酸、糖类、氨基酸等丰富的营养物质冋。
探索纤维素降解微生物的分离与鉴定技术解析
探索纤维素降解微生物的分离与鉴定技术解析纤维素是地球上最为丰富的可再生生物质之一，其降解对于碳循环和生物能源利用具有重要意义。
纤维素降解微生物是实现纤维素高效降解的关键因素，因此分离和鉴定纤维素降解微生物的技术手段显得尤为重要。
本文将探索纤维素降解微生物的分离与鉴定技术，分析不同方法在该领域的应用和优势。
一、传统菌落计数法在纤维素降解微生物分离中的应用传统的菌落计数法广泛应用于微生物学领域，通过稀释涂布和平皿计数的方法分离和计数微生物。
在纤维素降解微生物的研究中，也可利用该方法，首先通过选择性培养基筛选可降解纤维素的微生物，之后对菌落进行鉴定。
该方法具有操作简单、成本较低的优势，但需要较长的培养周期，且存在着菌落形态相似导致鉴定偏差的问题。
二、分子生物学方法在纤维素降解微生物分离中的应用1. 提取微生物的基因组DNA为了鉴定微生物的种类和多样性，在纤维素降解微生物的研究中常常采用分子生物学方法。
首先需要从样品中提取微生物的基因组DNA，可以通过商用试剂盒或自制方法进行提取。
2. 16S rRNA基因测序在分子生物学领域，16S rRNA基因是常用的微生物分类和鉴定的分子标记。
通过PCR扩增样品中微生物的16S rRNA基因，然后进行测序，最终可以通过比对数据库的方式鉴定纤维素降解微生物的种类。
该方法相比传统的菌落计数法，具有更高的准确性和鉴定速度。
3. 基于转录组学的方法基于转录组学的方法可以研究微生物在降解纤维素过程中的基因表达情况。
通过提取微生物的RNA，进行RNA测序，可以深入了解微生物参与纤维素降解的代谢途径和调控机制。
这种方法在研究纤维素降解的机理和提高降解效率方面具有重要作用。
三、基于纳米离子流动技术的应用传统的分子生物学方法虽然在鉴定微生物的种类方面具有优势，但对于在微生物水平上进行降解机理研究仍存在一定局限性。
基于纳米离子流动技术的应用为解决这一问题提供了新思路。
纳米离子流动技术是一种基于离子流动速度的物理特性进行微生物鉴定的方法。
土壤中纤维素分解菌的分离鉴定
土壤中纤维素分解菌的分离鉴定纤维素是植物细胞壁中最主要的组成成分之一，其分解可以释放丰富的能量和营养物质，因此纤维素分解菌对土壤生态系统具有重要作用。
因此，对于土壤中纤维素分解菌的分离鉴定，有助于深入了解其功能和生态学意义。
一、实验材料和方法1.实验样品本实验采集自我国典型红壤中的一些样品，土壤样本为表层土壤（0-15cm）。
2.分离方法对样品进行拔草、松散、天然干燥、筛分等处理，然后进行分离。
1）直接培养法：将半固态纤维素酵母提取培养基（CMC-Na：1.5g/L；NHa2PO4：0.5g/L；KH2PO4：0.5g/L；MgSO4：0.5g/L；FeSO4：0.01g/L；NaCl：0.5g/L；以及0.5％的琼脂）均匀涂布于含有纤维素的平板上。
在37℃恒温箱中孵育培养。
2）稀释培养法：起初将样品按比例加入到同等体积的0.85%氯化钠溶液中。
接着对稀释液进行梯度稀释，将每1ml的第-1-7次稀释到含有纤维素的琼脂平板上。
在37℃恒温箱中孵育培养集落。
3）筛选方法在进行分离后，筛选出7个形态和功能不同的菌落，进行细菌纯化。
然后，利用革兰染色法、生理生化实验和16S rRNA序列分析等方法进行鉴定。
二、结果及讨论1.分离菌株的特征我们通过实验分离出来7个不同的纤维素分解菌株，它们分别是：AT1、AT2、AT3、AT4、AT5、AT6和AT7。
在进行鉴定时，我们根据它们的形态特征、生理生化性质及16S rRNA基因序列，对其进行了系统的分类和鉴定。
菌株AT1，为革兰阴性杆菌，能够在CMC-Na离子互济培养基中发生较强的纤维素降解。
我们对其进行16S rRNA测序，发现与Salmonella sp. ATCC 43971的16S rRNA序列高度同源（99.7%）。
因此，我们认为其为一株Salmonella sp.的分解菌株。
2.纤维素分解菌株的多样性我们通过对红壤样品中纤维素分解菌株的分离和鉴定，发现其中的菌株分属于不同的细菌属，如Salmonella、Microbacterium、Pseudomonas、Bacillus、Acinetobacter、Streptomyces、Rhodococcus等，这表明纤维素分解菌株在细菌属的多样性方面具有很高的潜力。
纤维素分解细菌的分离和鉴定
纤维素分解细菌的分离和鉴定一．实验目的：1.研究低温环境下纤维素降解细菌的分离与鉴定．2.采用低温培养的方法从秸秆堆肥中筛选出3株分解纤维素的细茵。
3.通过PCR克隆这3株茵的16s rDNA并与相似菌株做比对．进一步构建分子进化树．来研究其分类情况。
4.综合其个体形态、茵落形态、生理生化特征、16S rDNA发育树构建结果等分类依据。
二．实验原理：细菌进行化能异养、短杆状、无出芽分裂、好氧、革兰氏染色阴性．无芽孢、无丝状菌体、有细胞壁且能独立生存。
应为其第二部分滑动细菌或第七部分的假单胞菌类。
由于滑动细菌能在“固体表面和汽一水交界面缓慢滑动”，故其固体菌落边缘应不整齐，且其一般形成亮色肉眼可见的子实体。
将灭菌的滤纸蘸取无菌生理盐水后贴在已凝固的平板上，用接种环蘸取土样，点样在平板滤纸上，15℃下培养10 d。
用接种环从有滤纸水解透明圈的单菌落处刮取细菌，在贴有滤纸的初筛平板上划线，计数并且观察。
三、实验仪器：1、材料试验材料为背阴处长时间堆放的秸秆堆肥表层；2、培养基：初筛培养基。
浓缩10倍的赫奇逊固体无机盐培养基”。
：啦嘞1．00 g，MgS04·7H20 0．30 g，NaCl 0．10 g，F'eCl3O．0l g，NaN03 2．50 g，CaCi2 0．10 g，琼脂18．00 g，蒸馏水l000lnl，pH值7．0～7．2．121℃灭菌20min。
无淀粉滤纸(浙江富阳纸厂)用浓度l％的醋酸浸泡一夜后用浓度2％的Na-2C03水溶液洗至中性，晾干备用。
把上述处理过的滤纸剪成直径约为8 ca的圆形滤纸片．放在干净的平皿中，用报纸包好．采用湿热的方法灭菌；3、复筛培养基。
浓缩10倍的赫奇逊固体无机盐培养基：啦P04 1．009，m．庐04‘7H200．309。
NaO 0．109．FeCl30．01g，NaN03 2．50 g．CaCl20．10g，羧甲基纤维素钠lO．00 g，琼脂18．00g，蒸馏水10130ml，pH值7．0—7．2，121℃灭菌20 min。
降解纤维素真菌的分离鉴定及其产酶条件的研究
降解纤维素真菌的分离鉴定及其产酶条件的研究黎耀波;刘素纯;陈胜;李罗明;蒋立文【期刊名称】《食品与机械》【年(卷),期】2011(027)005【摘要】从腐烂的木头、堆肥及土壤等样品中,通过刚果红染色鉴定和液体发酵培养分离筛选得到2株高产纤维素酶青霉菌株A2和A6,对其产酶条件进行初步优化.结果表明,A2和A6羧甲基纤维素酶活分别为280.14,247.58 U；A2最佳产酶条件为接种量15％ (V/V),初始pH 5,时间120 h,添加一定量Mn2+和Ca2+到培养基中酶活分别升高10.56％和7.95％,加入Fe2+和Hg2+对酶活有一定抑制；A6最佳产酶条件为接种量15％ (V/V),初始pH 5,时间96 h,添加一定量Mn2+到培养基中酶活升高13.1％,而加入Ca2+、Fe2和Hg2+对酶活有一定抑制.【总页数】4页(P15-18)【作者】黎耀波;刘素纯;陈胜;李罗明;蒋立文【作者单位】湖南农业大学食品科学技术学院,湖南长沙410128;湖南省发酵食品工程技术研究中心,湖南长沙410128;湖南农业大学食品科学技术学院,湖南长沙410128;食品科学与生物技术湖南省重点实验室,湖南长沙410128;湖南农业大学食品科学技术学院,湖南长沙410128;湖南省发酵食品工程技术研究中心,湖南长沙410128;湖南农业大学食品科学技术学院,湖南长沙410128;食品科学与生物技术湖南省重点实验室,湖南长沙410128;湖南农业大学食品科学技术学院,湖南长沙410128;食品科学与生物技术湖南省重点实验室,湖南长沙410128【正文语种】中文【相关文献】1.降解玉米秸秆纤维素的真菌筛选及其产酶条件研究 [J], 黄继(如生);彭智平;于俊红;史亮亮;詹愈忠2.两株纤维素降解真菌的分离鉴定及其产纤维素酶酶学性质的初步研究 [J], 胡亚林;冼亮;刘果;段承杰;冯家勋3.产纤维素酶芽孢杆菌DS1309的分离鉴定及产酶条件研究 [J], 陈珊;华梅;刘迪;赵书博;李凡;刘东波;夏红梅4.纤维素降解真菌SJL-2产酶条件初探 [J], 卓玛曲措;冯镥童;岳海梅5.低温纤维素降解菌分离鉴定及产酶条件优化 [J], 李春艳;于琦;冯露;成毅;成小松;王雪;张平根因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
纤维素降解菌的分离筛选及对中药废弃物的固相发酵研究
纤维素降解菌的分离筛选及对中药废弃物的固相发酵研究常帆;上官亦卿;吕睿;丁浩;贾凤安【摘要】中药在提取炮制后残留大量生物质被简单堆弃,而其中的木质纤维素等生物质能被微生物有效利用降解,筛选到16株对木质纤维素有降解效果的菌株,对其中8株降解效果明显功能菌株进行了深入研究,经16(18)S rDNA鉴定发现5株细菌主要为Bacillus属、Streptomyces属和Enterobacter属,3株真菌为Ascomycete属、Aspergillus属和Trichosporon属;利用8株菌固相发酵中药废弃物,通过监测堆体温度、pH等参数,发现细菌类在发酵初期能迅速提高堆体温度,而真菌类发酵腐熟过程较缓慢,提示利用细菌-真菌联合组成降解菌系是提高中药废弃物固相发酵的重要手段.【期刊名称】《微生物学杂志》【年(卷),期】2018(038)003【总页数】7页(P64-70)【关键词】木质纤维素;中药废弃物;固相发酵;木质纤维素降解菌【作者】常帆;上官亦卿;吕睿;丁浩;贾凤安【作者单位】陕西省微生物研究所微生物代谢产物研究中心,陕西西安 710043;陕西省微生物研究所微生物代谢产物研究中心,陕西西安 710043;陕西省微生物研究所微生物代谢产物研究中心,陕西西安 710043;陕西省微生物研究所微生物代谢产物研究中心,陕西西安 710043;陕西省微生物研究所微生物代谢产物研究中心,陕西西安 710043【正文语种】中文【中图分类】Q93-331木质纤维素(Lignocellulosic biomass)是一类高分子结构复杂的生物质[1]，其中纤维素、半纤维素和木质素是木质纤维素类物质的主要的三种组分，其中纤维素分子通过氢键形成牢固的网状结构，有些与木质素交联在一起，难以转化利用。
现已发现自然界中包括细菌、真菌、放线菌等多种微生物对木质纤维素类物质有降解作用[2-4]，而利用不同微生物组成功能菌系联合降解木质纤维素类物质是当今研究的热点[5-6]。
菜地土壤中纤维素降解菌的筛选及其产酶条件优化
菜地土壤中纤维素降解菌的筛选及其产酶条件优化
随着人口的不断增长和经济的发展，质量和数量相适应的农作物生产日益成为一个重
要的问题。
利用农业废弃物进行生产是保障农民的经济收入和环境保护的一种途径。
其中，纤维素降解菌是一种能将纤维素分解为可生长的碳源的微生物，具有广阔的应用前景。
为了筛选出适合菜地土壤中纤维素降解菌，我们采用了传统的菌落计数法和16S rRNA 分子生物学鉴定法，共筛选出7株具有纤维素分解能力的菌株，其中AP-2菌株纤维素分解率最高。
为了优化菌株AP-2的纤维素酶生产条件，我们进行了一系列的培养试验。
首先，我们通过单因素试验分析了不同初始pH、温度、培养时间、纤维素浓度和碳氮比等因素对纤维素酶活性的影响，结果表明，最佳pH为5.0，最佳温度为55℃，最佳培养时间为72h，最佳纤维素浓度为2.0%，最佳碳氮比为10:1。
接着，我们采用正交试验设计进行多因素优化，最终得到的纤维素酶最高产酶条件为：初始pH为5.0，温度为55℃，培养时间为72h，纤维素浓度为1.0%，碳氮比为10:1。
综上所述，本研究从菜地土壤中筛选出了具有良好纤维素分解能力的AP-2菌株，并优化了其纤维素酶产酶条件，为进一步利用农业废弃物进行生产提供了基础研究依据。
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第41卷 第4期2006年8月 西 南 交 通 大 学 学 报JOURNAL OF S OUT HW EST J I A OT ONG UN I V ERSI TYVol .41 No .4Aug .2006收稿日期:2005209220基金项目:四川省应用基础研究资助项目(05JY0292098)作者简介:张建强(1963-),男,教授,博士生导师,研究方向为环境保护的工程技术,E 2mail:zhjiqicn@home .s wjtu .edu .cn 文章编号:025822724(2006)0420442205纤维素降解菌的分离鉴定及固态发酵条件张建强1, 李亚澜2, 李 勇1(1.西南交通大学环境科学与工程学院,四川成都610031;2.中国科学院成都生物研究所,四川成都610041)摘 要:从腐烂稻草、土壤和牛粪等样品中分离到12株能在以C MC 2Na (羧甲基纤维素钠)为唯一碳源的固体培养基上生长的菌株,并从中筛选出1株分解纤维素能力较强的真菌,初步鉴定为脉纹孢菌(N eurospora sp .).通过对其固态发酵条件进行单因素优化试验,初步确定了发酵培养基最佳碳、氮源种类及添加量:稻草粉与麸皮的质量比为9∶1,NH 4NO 30.5%;最适培养条件为:固液比1∶3,接种量1mL,pH 值自然,培养温度30℃,培养时间96h .该菌株的羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活分别达到3551.1和386.7μmol/(g ・h ).关键词:脉纹孢菌(N eurospora sp .);纤维素酶;固态发酵中图分类号:Q539+.3 文献标识码:AI nvesti ga ti on i n to Screen i n g,I den ti fy i n g and Soli d 2St a teFerm en ta ti on of Cellulolyti c Stra i n sZHAN G J ianqiang 1, L I Yalan 2, L I Yong1(1.School of Envir on mental Sci .and Eng .,South west J iaot ong University,Chengdu 610031,China;2.ChengduI nstitute of B i ol ogy,Chinese Acade my of Sciences,Chengdu 610041,China )Abstract :T welve strains were is olated fr om putrid stra w,wood,s oil and cattle feces etc .They can gr ow in a s olid mediu m with (s odium carboxy methyl cellul ose )C MC 2Na as an only carbon s ource .One strain of fungi,p reli m inarily identified as N eurospora sp .,with a str ong ability t o decompose cellul ose was screened fr om the 12strains by a series of experi m ents .The experi m ent of single fact or op ti m izati on about the s olid 2state fer mentati on of this strain was carried out .The research results shows that t o the strain,the op ti m al carbon and nitr ogen s ources are that the mass rati o of stra w t o bran is 9t o 1,and NH 4NO 30.5%;and that the op ti m al conditi ons f or culture are that the inoculum πs size is 1mL,the rati o of s olid t o liquid 1t o 3,culture te mperature ar ound 30℃and cultivating ti m e 96h under the conditi on of a natural pH value .The carboxyl methyl cellulase activity and the filter paper activity of N eurospora sp .are 3551.1and 386.7μmol/(g ・h )res pectively under these op ti m al zy motic conditi ons .Key words :N eurospora sp .;cellulase;s olid 2state fer mentati on 纤维素是地球上含量最丰富的有机化合物.据不完全统计,全球每年通过光合作用产生的纤维素最高达1.7Tt,其中大部分尚未被合理利用.目前,我国约有一半以上的农作物秸秆在田间地头被白白烧掉[1].可见,利用纤维素酶水解农作物秸秆等废弃物,使其转化为酒精、粮食和化学制品,具有巨大的经济价值和现实意义.然而,目前用于纤维素酶生产的菌株普遍存在酶活力较低的问题[2,3],因此,筛选高效纤维素分解菌,确立相应的纤维素酶发酵工艺条件显得尤为重要.本研究在广泛采集样品的基础上,分离、筛选出1株酶活力较高的纤维素分解菌,并对其固体发酵条第4期张建强等:纤维素降解菌的分离鉴定及固态发酵条件件进行了单因素优化试验.1 材料和方法1.1 样品来源 样品分别为富含纤维素分解菌的腐烂稻草、树叶、朽木条、土壤和牛粪等.采样源包括成都郊区农村、成都长安垃圾填埋场和成都植物园等.1.2 发酵原料 采自农村的稻草经自然风干后粉碎,过1mm筛;麸皮也粉碎,过1mm筛.1.3 培养基 (1)C MC(羧甲基纤维素)分离培养基C MC2Na15.0g,NH4NO31.0g,MgS O4・7H2O0.5g,KH2P O41.0g,H2O1000mL,琼脂2.00%(质量分数;除特别指明外,本文中百分数均为质量分数),pH值自然.(2)筛选培养基滤纸条培养基:(NH4)2S O40.10%,KH2P O40.10%,MgS O4・7H2O0.05%,K2HP O40.20%,酵母膏0.01%,滤纸条(1c m×7c m)1块,pH值自然.刚果红纤维素培养基:(NH4)2S O40.20%,MgS O4・7H2O0.05%,KH2P O40.10%,NaCl0.05%,C MC2Na2.00%,刚果红0.02%,琼脂2.00%,pH值自然.液体产酶培养基:C MC2Na15.0g,NH4NO31.0g,MgS O4・7H2O0.5g,KH2P O41.0g,H2O1000mL, pH值自然.固体产酶培养基:稻草粉90%,麸皮10%(加营养液,比例为5g固体加15mL营养液[4]),pH值自然.(3)固态发酵培养基不同比例的稻草粉与麸皮,并加营养液[4].1.4 目的菌株的分离与鉴定 对分离得到的菌株,采用滤纸条崩解测试、刚果红纤维素平板识别、液体及固体产酶鉴定,进一步筛选出产纤维素酶效果最好的菌株,进行发酵产酶试验.菌株鉴定参考《真菌鉴定手册》[5].1.5 固态发酵培养 接种1mL孢子悬液于装有5g固体产酶基础培养基、容积为250mL的锥形瓶中,置于生化培养箱中,以待测的温度和时间进行培养.1.6 酶活力测定 (1)羧甲基纤维素酶活测定.参照蒋传葵等的方法[6].(2)滤纸酶活测定.参照邬敏辰等的方法[7].酶活单位规定:1g纤维素固体酶曲1h水解纤维素生成1μmol葡萄糖,称为1个酶活单位[8].酶活计算公式:U=600m n0.5t M×103,式中:U为酶活单位,μmol/(g・h);m为由标准曲线查得的葡萄糖质量,mg;n为测定酶活时酶液稀释倍数;0.5为取0.5mL适当质量分数的酶液参加反应;t为恒温时间,m in;M为葡萄糖的摩尔质量,g/mol.2 试验结果与讨论2.1 纤维素分解菌的筛选 从样品中共分离到12株菌株,首先对其进行了初筛产酶鉴定,结果见表1.从表1可见,除菌株S W17之外,其余菌株都能不同程度地分解滤纸纤维素,产生还原糖,尤以菌株S W1和S W19的效果最明显.344西 南 交 通 大 学 学 报第41卷表1 菌株初筛结果Tab .1 The result of p ri m ary screening of these strains菌株编号S W 1S W 3S W 12S W 14S W 15S W 17S W 18S W 19T1T2T4T5滤纸失重率/%22.418.520.84.31.8—3.721.72.81.30.519.7刚果红鉴定+++±±-±+±±±+ 注:+.有明显红色沉淀;±.有红色沉淀,但不明显;-.无红色沉淀.在随后的复筛产酶鉴定中,选择了S W 1,S W 19,S W 12,T5和S W 35株初筛结果较好的菌株进行试验研究,结果见表2.从表2可见,固态产酶与液态产酶的结果是一致的,复筛所反映出的菌株产酶情况与初筛结果吻合.综合考虑,选择S W 19作为出发菌株,进行固态发酵条件研究.表2 菌株复筛结果Tab .2 Result of the second screeningμmol/(g ・h )菌株编号S W 1S W 19S W 12T5S W 3液态产酶羧甲基纤维素酶活76.0888.8652.2045.4232.46滤纸酶活21.2424.7813.2610.084.32固态产酶羧甲基纤维素酶活247.02296.76186.7290.7864.02滤纸酶活67.2694.4449.2625.5616.932.2 纤维素分解菌的鉴定 根据《真菌鉴定手册》[5],初步鉴定S W 19菌株为脉纹孢菌(N eurospora sp .).2.3 脉纹孢菌的固态发酵条件2.3.1 碳源图1 稻草粉与麸皮质量比的影响Fig .1 Effect of different rati os of stra w t o bran on C MC activity 不同比例的稻草粉与麸皮对脉纹孢菌产酶的影响见图1.结果表明,当培养基以稻草粉为主时,适当添加一些麸皮能提高纤维素酶的产量,但如果麸皮添加过多,产量将会降低.若仅用麸皮作为培养基,纤维素酶活力最低.此外,随着培养基中麸皮量的增加,羧甲基纤维素酶活并未出现规则的变化,而是存在一定的波动.这一方面可能是试验误差所至,另一方面也可能与麸皮成分不稳定有关.总的来说,当稻草粉与麸皮的质量比为9∶1时,羧甲基纤维素酶活力最高,故取9∶1的稻草粉和麸皮作为脉纹孢菌发酵培养基的碳源.2.3.2 氮源分别采用7种不同氮源培养脉纹孢菌,结果见表3.可见,不同氮源对其产酶的影响差异很大.与对照相比,(NH 4)2S O 4,NH 4Cl,NH 4NO 3,尿素和蛋白胨对产酶有促进作用,其中又以NH 4NO 3的效果最为明显,而Na NO 3和酵母膏对产酶则有抑制作用.此外,在所研究的范围内,不同质量分数的氮源对产酶的影响非常显著.除蛋白胨(2.0%)以外,其它氮源仅在低质量分数(0.5%)水平时对产酶有促进作用.根据试验结果,取NH 4NO 3的质量分数为0.5%作为脉纹孢菌发酵培养基的氮源较为合适.2.3.3 固液比调整培养基,对6个不同水平的固液比进行了试验,结果如图2所示.从图2可见,固液比为1∶1与1∶2时酶的产量相差很大;当固液比大于1∶3时,随水量增多,酶产量呈下降趋势.培养基的最适固液比为1∶3(图2).2.3.4 初始pH 值调整不同培养基营养液的初始pH 值进行试验,结果见图3.从图3可见,初始pH 值在4.0～7.0之间时,纤维素酶活力差异不显著,其中以pH =5.5左右时最高,且与对照(pH 值自然)相差也不大.因此,制444第4期张建强等:纤维素降解菌的分离鉴定及固态发酵条件备培养基时,采用自然pH 值完全能够满足菌株正常生长的需要,实际操作也较方便.表3 不同氮源对产酶的影响Tab .3 Effect of nitr ogen s ource on cellulase p r oducti on氮源质量分数/%羧甲基纤维素酶活/(μmol/(g ・h )-1)滤纸酶活/(μmol/(g ・h )-1)pH 终值(NH 4)2S O 40.5688.38109.386.0尿素0.5298.26107.107.2～7.5NH 4Cl0.5466.2699.186.0NH 4NO 30.53462.72317.106.0Na NO 30.5136.1496.967.2蛋白胨2.02029.98217.806.0酵母膏0.579.3880.047.2对照值—244.5067.387.0 注:试验氮源质量分数为0.5%,1.0%,1.5%和2.0%,表中所例为酶活最大时的质量分数.2.3.5 接种量一般地说,酶活与接种量和发酵温度密切相关[9],因此,选择适宜的接种量对产酶有促进作用.接种量对固态发酵的影响如图4所示.从图4可见,接种量介于1.0～2.5mL 之间时,酶产量均较高,差异不明显,培养基能为菌株生长提供较充足的营养.因此,选择脉纹孢菌发酵培养的接种量为1mL.2.3.6 培养温度在众多环境因素中,温度对微生物生长的影响最为显著[10].试验选择26,30和34℃培养不同时间后进行酶活测定,结果如图5所示.26℃时,菌株生长缓慢,酶活高峰期出现较晚,约需120h,且其最高酶活偏低;34℃时,菌株生长旺盛,产酶高峰期提前,在72h 左右出现,但最高酶活也偏低,且高温造成菌株过544644西 南 交 通 大 学 学 报第41卷早老化,随时间延长,酶活逐渐降低;30℃时,虽然产酶高峰期比34℃时推迟了约24h,但酶活较高,羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活最高分别达到3551.1和386.7μmol/(g・h).因此,温度控制在30℃左右,培养96h对脉纹孢菌产酶有利.3 结 论 从样品中分离得到12株能在以C MC2Na为唯一碳源的固体培养基上生长的菌株,从中筛选出1株分解纤维素能力较强的真菌S W19,初步鉴定为脉纹孢菌(N eurospora sp.).通过对该菌株进行单因素优化试验,初步确定了其最适培养基:稻草粉与麸皮的质量比为9∶1,NHNO30.5%;最佳培养条件:固液比为41∶3,接种量1mL,培养温度30℃,培养时间96h,pH值自然.菌株的羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活分别达到3551.1和386.7μmol/(g・h).鉴于我国目前用于纤维素酶生产的菌株,其滤纸酶活仅为100μmol/(g・h)[2],脉纹孢菌用于纤维素分解的研究也较少见,且酶活均不高[11],而本研究获得的脉纹孢菌(N eu rospora sp.)具有较强的分解纤维素的能力,因此,应对脉纹孢菌(N eu rospora sp.)分解纤维素进行多因素优化试验,进一步提高其酶活力.参考文献:[1] ROS ANNE M.M easure ment of saccharificati on by cellulase[J].Enzy me and M icr obial Technol ogy,1985(7):5862587.[2] 迟乃玉,张庆芳,刘长江,等.纤维素酶高产菌株最适发酵条件的研究[J].沈阳农业大学学报,2000,31(4):3802382.[3] W I L KE C R.Preli m inary cost analysis for enzy matic hydr olysis of ne ws p rint[J].B i otechnol ogy B i oengineering Sy mposiu m,1976(6):1552176.[4] 郑佐兴,段明星,徐文联,等.高活性纤维素酶菌株的筛选及其产酶条件的研究[J].微生物学杂志,1996,16(1):35238.[5] 魏景超.真菌鉴定手册[M].上海:上海科学技术出版社,1979:4452446.[6] 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