外源基因在宿主细胞中的表达1
生化复习资料-名词解释
1.反馈抑制——终点产物对该途径的酶的活性调节，所引起的抑制作用。
2.反馈阻遏——操纵子编码的阻遏蛋白是酶活性的，需与辅阻遏物，即终产物或其衍生物结合才能阻止编码合成途径中的第一个酶的基因的转录。
3.Monod方程——（P202）（ppt10）存在抑制剂时描述限制性基质浓度影响细胞比生长速度的经验方程。
4.单位重量的菌体每小时消耗氧的量，单位为mmol(O2)/g(干菌体)∙h。
5.恒化法，也称连续培养系统，是通过控制培养基中营养物，主要是生长限制因子的浓度，来调控微生物生长繁殖与代谢速度的连续培养方式。
6.恒浊法，是以培养器中微生物细胞的密度为监控对象，用光电控制系统来控制流入培养器的新鲜培养液的流速，同时使培养器中的含有细胞与代谢产物的培养液也以基本恒定的流速流出，从而使培养器中的微生物在保持细胞密度基本恒定的条件下进行培养的一种连续培养方式。
7.包涵体，由外源基因在宿主细胞中表达的不溶性蛋白聚合体称为包涵体8.分叉中间体，糖代谢中间体既可以用来合成初级代谢产物, 也可以用来合成次级代谢产物9.临界氧浓度，当溶氧浓度达到某一值后，呼吸强度不再随溶解氧浓度的增强而变化，此时的溶解氧浓度称为呼吸临界氧浓度，以C表示。
10.呼吸熵，营养物质氧化过程中生成的二氧化碳与所消耗的氧量的容积比值11.生理酸性物质，无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺，12.生理碱性物质，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。
13.生物密封：要求用只有在特殊培养条件下才能生存的宿主，同时用不能转移至其它活细胞的载体，通过这样组合的宿主载体系统，可以防止重组菌向外扩散（工程菌采用采用物理密封和生物学密封两种方法。
外源基因的导入和表达机制
外源基因的导入和表达机制随着生物技术的飞速发展，外源基因的导入和表达成为了基因工程领域中的重要课题。
其涉及到基因治疗、转基因作物、药物生产等许多领域。
在导入和表达外源基因的过程中，要考虑到基因的适应性、表达的稳定性、特异性以及对宿主生物的影响等多个方面。
本文将探讨外源基因的导入和表达机制，包括基本原理、工具和技术以及存在的问题和挑战。
基本原理导入和表达外源基因的基本原理是将外源DNA序列引入到宿主细胞中，使其被转录和翻译成蛋白质。
具体而言，一般有两种方式：直接转染和向宿主基因组中嵌入外源基因，后者也称为基因整合。
直接转染是将外源DNA序列直接引入到细胞外，在细胞膜相关的受体介导下，外源DNA序列被进入到细胞质中。
直接转染的DNA所携带的信息将指导它在宿主细胞内的表达。
基因整合是将外源DNA序列整合到宿主细胞染色体上，使其成为宿主细胞的一部分。
基本原理是将外源DNA构建为一个适合于整合的载体，然后具体通过发生基因重组或嵌入基因导入宿主细胞的染色体中。
被整合的外源脱氧核糖核酸(DNA)序列将被遵循宿主细胞一样转录并翻译成蛋白质。
工具和技术导入和表达外源基因要解决的核心问题就是如何将外源DNA 送入宿主细胞。
为此，研究者现有许多的工具和技术可供选择。
电穿孔是将宿主细胞暴露在高电场的冲击下，使细胞膜通透性增强，外源DNA得以进入的技术。
这种技术既可以使用简单的电刺激来进行，也可以通过利用特殊设备专门进行。
这种技术在大多数细胞类型中都是有效的。
群粒化法是利用氟化物和离子溶液百炼生化学反应，在其中产生群粒化团块，通过进一步化学反应打开细胞膜，使外源DNA进入细胞内部。
这种技术适用于一些难以被电穿孔的细胞类型。
病毒载体是将外源DNA序列植入病毒中，通过感染宿主细胞扩增表达，使表达的目标基因在细胞内获得较高的表达水平。
存在的问题和挑战虽然外源基因的导入和表达在许多方面得到了极大的改进，但仍然存在着一些问题和挑战。
外源基因的表达和转基因生物的鉴定
5、β -葡萄糖酸苷酶（GUS）基因
GUS基因所编码的β -葡萄糖酸苷酶可催化裂解人工合成的 底物4-甲基伞形花酮-β -D-葡萄糖苷酸，产生荧光物质4-甲 基伞形酮，可用荧光光度计进行定量测定。
GUS X-gluc————————————————→ 蓝色物质
(5-溴-4-氯-3-吲哆葡萄糖醛苷酸) （5，5’-二溴-4，4’-二氯靛蓝）
CAT基因是由大肠杆菌易位子Tn9所编码的，它可以催化 乙酰CoA转乙酰基到氯霉素分子的某些基团。
氯霉素可选择性地与原核细胞核糖体50S亚基结合，抑制 肽酰基转移酶的活性，从而阻碍肽键的形成，使蛋白质合 成受到抑制，最终抑制植物的生长。而乙酰化的氯霉素就 会失去与核糖体50S亚基结合的能力，所以携带有CAT基 因的转基因植株就具有了对氯霉素的抗性。
3、通过减轻宿主细胞的代谢负荷 （1）基因产物的诱导表达
该方法是当宿主细胞大量生长时，抑制外源基因的 表达；而当宿主细胞的生物量达到饱和时，再诱导外源 基因的表达。 例：温度敏感的转录调控蛋白λ cI857
（2）表达载体的诱导复制 该方法是在宿主细胞大量生长时，抑制重组质粒的 复制；而当细胞生物量积累到一定水平时，再诱导细胞 中重组DNA的复制。
1、胭脂碱和章鱼碱检测
这两种报告基因在植物的根、茎、叶中均能表达。将植物 材料直接挤压在电泳图谱纸上，进行电泳，经电泳胭脂碱 和章鱼碱可以同正常组织中含有的精氨酸分开，用敏感的 荧光染料菲醌进行染色，即可观察到植物样品中是否含有 胭脂碱或章鱼碱，从而判断出转化是否成功。 冠瘿碱（胭脂碱和章鱼碱）＋菲醌 2天后呈蓝色 紫外光下呈黄色荧光
异源性表达（heterologous expression）则指来源于其它物 种的基因在植物中的表达。
酶蛋白的异源表达的意义和作用
酶蛋白的异源表达的意义和作用
【实用版】
目录
1.酶蛋白异源表达的定义和意义
2.酶蛋白异源表达的作用
3.酶蛋白异源表达的应用案例
4.酶蛋白异源表达的发展前景
正文
一、酶蛋白异源表达的定义和意义
酶蛋白异源表达是指将外源基因插入到宿主细胞的基因组中，使宿主细胞表达出具有生物活性的外源酶蛋白。
这种技术对于研究基因功能、蛋白质相互作用以及生物技术应用具有重要的意义。
通过异源表达，我们可以在短时间内获得大量具有生物活性的酶蛋白，这对于科研和工业生产具有极大的价值。
二、酶蛋白异源表达的作用
酶蛋白异源表达的作用主要体现在以下几个方面：
1.研究基因功能：通过异源表达，我们可以获得大量具有生物活性的目的酶蛋白，从而可以对目的基因的功能进行深入研究。
2.蛋白质相互作用研究：异源表达技术可以用于研究蛋白质之间的相互作用，揭示生物体内复杂的信号传导途径。
3.生物技术应用：酶蛋白异源表达可以用于制备生物催化剂、生物传感器、药物研发等生物技术领域。
三、酶蛋白异源表达的应用案例
1.伏马毒素解毒酶基因的克隆异源表达及其性质研究：利用异源表达
技术，研究人员成功获得了具有生物活性的伏马毒素解毒酶，并研究了其性质。
2.利用异源表达技术制备生物催化剂：通过异源表达，研究人员获得了具有高活性的乳糖酶，并将其应用于乳糖的水解过程。
四、酶蛋白异源表达的发展前景
随着生物技术的不断发展，酶蛋白异源表达技术在科研和工业生产中的应用将越来越广泛。
未来，随着基因编辑技术的不断完善，异源表达技术的效率和准确性也将得到进一步提升。
外源基因的表达和转基因生物的鉴定.
异源性表达（heterologous expression）则指来源于其它物 种的基因在植物中的表达。
异源表达困难的原因：是因为不同物种 RNA聚合酶所识别 的启动位点不同，因而造成异源表达困难的结果。
2、瞬时表达和稳定表达
瞬时表达（transient expression）：在受体中表达一个细胞 周期或一个培养周期，这种表达称瞬时表达。
1、胭脂碱和章鱼碱检测
这两种报告基因在植物的根、茎、叶中均能表达。将植物 材料直接挤压在电泳图谱纸上，进行电泳，经电泳胭脂碱 和章鱼碱可以同正常组织中含有的精氨酸分开，用敏感的 荧光染料菲醌进行染色，即可观察到植物样品中是否含有 胭脂碱或章鱼碱，从而判断出转化是否成功。 冠瘿碱（胭脂碱和章鱼碱）＋菲醌 2天后呈蓝色 紫外光下呈黄色荧光
稳定表达（stable expression）：转化的外源基因在细胞水平 可检测到它的产物，在个体水平也能检测到性状表现，并且 可稳定地遗传给后代，这种正常的长期表达称为稳定表达。
3、组成型表达和发育特异性表达
组成型表达（constitutive expression）指表达是持续的， RNA及蛋白质表达量也相对恒定，不受时空条件改变而改变， 也不因外界因素变化而诱导基因表达，相当于稳定表达。
第二节 平上鉴定利用遗传学和育种学方法，即种植或诱导 转化体表现其性状特征或生理特征。
二、细胞和组织水平鉴定
报告基因：指其编码产物能够被快速的测定，常用来判断
外源基因是否已经成功地导入寄主细胞（器官或组织）并检 测其表达活性的一类特殊用途的基因。 一个理想的报告基因，最基本的要求是在转化的寄主细胞中 应不存在相应的内源等位基因的活性，其表达产物不仅不会 损害寄主细胞，而且应该快速、灵敏、定量和可重复的检测 特性。
异源表达系统的构建和应用
异源表达系统的构建和应用随着分子生物学和基因工程的不断发展，研究人员需要构建和调控各种异源表达系统以进行生命科学的研究和开展工业生产。
本文将介绍什么是异源表达系统、如何构建和调控异源表达系统、以及其在实践中的应用。
一、什么是异源表达系统异源表达系统是指利用外源基因在宿主细胞中表达蛋白质的生物技术手段。
它可以应用于基础科研、药物研发、农业生产等多个领域。
常用的宿主包括细菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞等。
同时，也可利用不同宿主的异源表达系统来最大程度上满足各种表达需求，并避免不同宿主在临床试验中可能出现的影响。
二、如何构建异源表达系统1.质粒构建质粒是最基本的异源基因表达载体，它是一段携带外源DNA的小环状DNA分子，可以自主复制和表达。
因此，质粒构建是构建异源表达系统的必备步骤。
寻找合适的质粒载体和基因序列，优化启动子、终止子、密码子和信号肽等序列，是构建异源表达系统的关键。
2.宿主细胞的选择宿主细胞的选择直接关系到基因表达的效率和质量。
常用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞等。
大肠杆菌常用于基因的快速大规模表达；酵母常用于糖类、脂类、蛋白质等复杂化合物的表达和分泌；哺乳动物细胞常用于人类蛋白质的表达；昆虫细胞常用于表达昆虫毒素等复杂的蛋白质。
3.选择合适的启动子启动子是基因表达的开端，选择合适的启动子能够实现高效的基因表达。
启动子包括常用的pET、T7、CMV、SV40等。
这些启动子在不同的宿主中表达效果不同，需要选择合适的宿主进行相应的表达。
4.调节基因表达的强弱在构建异源表达系统时，调节基因表达的强弱也非常重要。
调节常用的方法主要包括选择合适的启动子，改变启动子的序列，调整转录因子或调节RNA的本身结构等。
三、异源表达系统的应用1.基础科研利用异源表达系统，可以研究基本的蛋白质结构、功能和调控机制，进而深入了解生物体内复杂的代谢网络和信号传递途径。
2.药物研发在药物研发中，异源表达系统可以帮助研究员合成各种必要的蛋白质，如抗体、激素、酶类等，为药物研发提供产物和工具。
DNA重组技术概述
DNA重组技术概述DNA重组技术（DNA recombinant technology）是利用DNA序列的组合、修饰和重排等方法来获得特定目的的DNA分子的一种技术。
该技术被广泛应用于基因工程、生物医药、农业、食品工业等领域，并在科研、生产和临床医学中产生了重要的影响。
DNA重组技术的主要原理是通过DNA分子的切割、粘接、合成等操作，改变DNA序列的结构和组合关系。
这样一来，就可以将不同来源的DNA片段进行组合，重组为新的DNA分子，从而实现对DNA序列的改变和修饰。
DNA重组技术的核心技术包括PCR扩增、限制酶切割、DNA连接、酶体定向克隆、DNA测序等。
PCR扩增是一种常用的DNA重组技术，它可以在短时间内扩增出目标DNA片段。
PCR的原理是通过DNA聚合酶酶作用下的连续循环体系，将目标DNA片段从少量模板DNA中扩增出来。
这种方法简单、高效，广泛应用于分子生物学研究、基因克隆、医学诊断等领域。
限制酶切割是DNA重组技术中常用的一种手段。
限制酶能识别并切割DNA特定的序列，从而产生特定的DNA片段。
通过选择不同的限制酶，可以将DNA分子切割为具有不同片段和末端特性的DNA片段，从而实现希望的DNA重组效果。
限制酶的切割操作常用于基因克隆、DNA分析和重组等实验中。
DNA连接是DNA重组技术的另一个核心环节。
DNA连接是将两条DNA片段的末端通过DNA连接酶的作用连接在一起，形成一个新的DNA分子。
DNA连接的方法有多种，如末端连接、中间连接等。
不同的连接方式和连接酶的选择，可以实现不同的DNA重组目的。
通过DNA连接技术，可以将来自不同源的DNA片段进行连接，从而构建出具有特定功能的DNA分子。
酶体定向克隆是DNA重组技术中的一种重要方法。
它通过酶体（vector）的选择和DNA片段的连接来实现目标DNA片段的克隆和表达。
常用的酶体有质粒、噬菌体和人工染色体等。
酶体定向克隆技术常用于基因工程研究，用于将外源基因导入到宿主细胞中，并在宿主细胞中表达和复制。
原核表达技术
原核表达技术原核表达技术是一种用于原核生物体中表达外源基因的技术。
通过将外源基因导入原核生物体中，并使其在细胞内得到表达，可以实现对目标基因的研究和利用。
原核表达技术在生物科学研究、生物工程、医学等领域具有广泛的应用前景。
原核表达技术的基本原理是将外源基因导入原核生物体中，并将其与宿主细胞的基因表达系统连接起来。
这样，外源基因就可以在宿主细胞内得到转录和翻译，从而表达出编码的蛋白质。
为了实现这一目标，研究人员通常需要构建一个包含外源基因的表达载体，并将其导入到宿主细胞中。
在构建表达载体时，研究人员通常会选择合适的启动子、转录终止子和调节元件等，以确保外源基因在宿主细胞中得到高效的转录和翻译。
此外，还可以通过引入信号肽序列等方式，使得目标蛋白质能够在宿主细胞中得到正确的翻译和定位。
在导入表达载体到宿主细胞中时，常用的方法有化学法转化、电转化和质粒共转化等。
其中，化学法转化是最常用的方法之一。
通过将表达载体和宿主细胞一起处理化学试剂，使得宿主细胞的细胞壁发生变化，从而导致表达载体进入细胞内。
电转化则是利用电场脉冲的作用，使得表达载体能够穿过宿主细胞的细胞膜进入细胞内。
质粒共转化是将表达载体与另一个能够进行共转化的质粒一起导入宿主细胞中，以提高转化效率。
一旦表达载体成功导入宿主细胞，外源基因就可以开始在细胞内得到表达。
为了检测外源基因的表达情况，研究人员通常会选择合适的检测方法，如聚合酶链反应（PCR）、蛋白质印迹、酶活性分析等。
通过这些方法，可以确定外源基因是否得到了正确的转录和翻译，并且能够得到目标蛋白质的定量和活性信息。
原核表达技术在生物科学研究中有着广泛的应用。
例如，通过原核表达技术可以实现对目标基因的功能研究。
研究人员可以通过构建不同的表达载体，将目标基因在宿主细胞中进行过量表达或靶向抑制，进而研究其在细胞生理过程中的作用机制。
另外，原核表达技术还可以用于生物工程领域。
研究人员可以利用原核表达技术生产大量的重组蛋白质，以满足药物研发和工业生产的需求。
基因工程常用的三种载体
基因工程常用的三种载体载体是基因工程中常用的一种工具，用于将外源基因导入宿主细胞中并进行表达。
常见的载体有质粒、病毒和人工染色体。
本文将分别介绍这三种载体的特点、用途和优缺点。
1. 质粒：质粒是圆形、双链DNA分子，广泛应用于基因工程中。
质粒的构建相对简单，可以通过DNA重组技术来插入外源DNA 片段。
质粒通常包含由宿主细胞识别的来源于细菌或酵母的起源序列，以实现在细胞中的复制和维持。
此外，质粒上还包含选择性标记基因和表达调控元件，以便筛选和调控目标基因的表达。
质粒在基因工程中有着广泛的应用。
首先，质粒载体可以在大肠杆菌等常见细菌中表达外源基因，用于重组蛋白的产生和纯化，或进行功能研究。
此外，质粒也可以构建用于植物和动物细胞的转染，用于基因转导和基因治疗等领域的研究。
质粒的优点在于构建简单，易于操作，并且可以在多种细胞中进行表达。
然而，质粒的转染效率较低，不适合大规模基因转导。
此外，在某些细胞中，质粒的稳定性较差，易丧失外源基因。
2. 病毒：病毒是一类依赖于细胞代谢活动的生物体，可以将外源基因导入宿主细胞并进行复制和表达。
常见的基因工程病毒载体包括腺病毒、逆转录病毒和腱实病毒等。
病毒载体的主要特点是高效的基因转导能力和细胞特异性。
由于病毒依赖于细胞进行复制和表达，因此病毒载体能够实现高效转导和表达目标基因。
此外，病毒载体还可以通过选择性修饰病毒表面蛋白来实现对特定细胞的特异性转染，进一步提高基因转导效率。
病毒载体被广泛应用于基因治疗和基因敲除等研究领域。
在基因治疗中，病毒载体能够将替代基因导入患者细胞中，以治疗某些遗传性疾病。
在基因敲除中，病毒载体则可以导入携带某种特殊序列的DNA片段，进而敲除靶基因。
然而，病毒载体也存在一些限制。
首先，病毒复制过程中可能引起细胞毒性反应，对细胞造成伤害。
其次，病毒载体的构建和生产相对复杂，需要严格的无菌操作和关键的质控步骤。
3. 人工染色体：人工染色体是一种合成的染色体模拟体，可用于将大片段基因组DNA导入宿主细胞中。
重组蛋白的表达载体和表达方式
什么是重组蛋白？
重组蛋白（recombinant protein）是指应用重组 DNA 或重组 RNA 技术而获得的蛋白质。
重组蛋白工程先应用基因克隆或化学合成技术获得目的基因（gene of interest，GOI），连接到适合的表达载体，导入到特定的宿主细胞，利用宿主细胞的遗传系统，表达出有功能的蛋白质分子。
什么是表达载体？
表达载体（expression vector）是一种可以携带外源基因并在宿主细胞中进行表达的工具，它通常是一种质粒或病毒。
表达载体除了包含外源基因外，还需要包含一些必要的元件，如启动子、终止子、选择标记、筛选标记等。
重组蛋白的表达方式有哪些？
按重组蛋白的表达方式，表达载体大致可分为以下几种：
•单独表达：指目的基因单独编码一个蛋白质，在宿主细胞中以自由形式存在。
这种方式适用于大多数不需要翻译后修饰或结构域相互作用的蛋白质。
•融合表达：指目的基因与其他基因（如伴侣蛋白、纯化标签等）相连接，编码一个含有多个功能区域的融合蛋白，在宿主细胞中
以结合形式存在。
这种方式可以增加目的蛋白的溶解度、稳定性、纯化效率和活性检测等。
•分泌表达：指目的基因与一个信号肽基因相连接，编码一个含有信号肽的前体蛋白，在宿主细胞中经过分泌途径被运输到胞外或胞器内。
这种方式可以避免目的蛋白在胞质中形成包涵体或受到降解酶的作用，也可以实现一些翻译后修饰，如糖基化等。
基因转移的四种方式
基因转移的四种方式基因转移是指将一种生物体的基因序列导入到另一种生物体中，从而改变其遗传特性的过程。
在现代生物技术的研究中，基因转移已经成为了一个重要的技术手段，可以用来改良作物、提高动物品质、治疗疾病等方面。
基因转移的方式有很多种，下面我们就来介绍一下基因转移的四种方式。
一、质粒转化法质粒转化法是一种常用的基因转移方法，它是利用化学方法将外源基因转移到受体细胞中。
具体来说，就是将所需的基因片段克隆到载体质粒中，再将质粒导入到受体细胞中，通过转化操作将质粒中的外源基因片段插入到受体细胞的染色体中，从而实现基因转移。
质粒转化法具有技术简单、转化效率高、基因稳定等优点，已经广泛应用于农业、医学等领域。
但是，质粒转化法存在一些局限性，如质粒大小受限、外源基因表达水平难以控制等问题。
二、病毒载体法病毒载体法是利用病毒作为载体将外源基因导入到宿主细胞中的一种基因转移方法。
具体来说，就是将所需的外源基因片段克隆到病毒载体中，再将病毒载体导入到宿主细胞中，病毒载体通过感染宿主细胞将外源基因片段插入到宿主细胞的染色体中，从而实现基因转移。
病毒载体法具有转化效率高、基因表达稳定等优点，但是也存在一些缺点，如病毒感染后可能导致细胞死亡、病毒基因组的插入可能引起细胞突变等问题。
三、基因炮法基因炮法是利用高压气枪将外源基因片段直接送入宿主细胞中的一种基因转移方法。
具体来说，就是将所需的外源基因片段包裹在微小金属颗粒上，然后通过高压气枪将金属颗粒射入到宿主细胞中，金属颗粒与宿主细胞发生碰撞后将外源基因片段送入到宿主细胞的染色体中，从而实现基因转移。
基因炮法具有技术简单、能够转移大分子DNA等优点，但是也存在一些问题，如转化效率低、基因表达难以控制等问题。
四、基因修饰法基因修饰法是利用CRISPR-Cas9等基因编辑技术对宿主细胞进行基因修饰的一种基因转移方法。
具体来说，就是通过编辑宿主细胞的染色体，将外源基因片段插入到宿主细胞的染色体中，从而实现基因转移。
外源基因原核系统克隆表达的基本流程
外源基因原核系统克隆表达的基本流程
外源基因原核系统克隆表达的基本流程如下：
1. 设计引物：根据外源基因的序列，设计引物，其中至少包括一个启动子和一个终止子。
2. 基因克隆：使用PCR或其他克隆技术，将外源基因与载体DNA连接起来，形成重组质粒。
3. 转化：将重组质粒转化到适当的宿主细胞中，如大肠杆菌。
4. 筛选：通过选择性培养基或其他筛选方法，筛选出带有重组质粒的转化菌落。
5. 培养：将筛选出的转化菌落进行扩增培养，在适当的培养条件下培养细菌。
6. 表达：在培养过程中，外源基因会被宿主细胞转录和翻译，产生目标蛋白质。
7. 提取：收集细菌培养物，利用细胞破裂或其他细胞提取方法，提取目标蛋白质。
8. 纯化：通过各种纯化技术，如柱层析、电泳等，纯化目标蛋白质。
9. 鉴定：利用各种方法，如SDS-PAGE、Western blot等，对
目标蛋白质进行鉴定和定量分析。
10. 应用：利用纯化的目标蛋白质进行后续的研究或应用，如
功能鉴定、结构分析、抗原制备等。
这是一个基本的流程，根据不同的实验目的和具体情况，可能还会涉及到一些其他的步骤和操作。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
外源基因在宿主细胞中的高效表达- I
影响外源基因表达的因素
有效的转录起始
•主要的限速步骤
•选择强的可调控的启动子及相关的调控序列，是组建一个高效表达载体的首要问题
启动子:位于结构基因5’端上游区的DNA序列,活化RNA聚合酶
启动子的特征: 序列特异性、方向性、位置特性、种属特异性
举例说明原核生物的启动子和真核生物的启动子。
启动子根据作用方式及功能分类：
•组成型启动子(constitutive promoter) ：在个体的任何细胞中均有表达活性的启动子
•诱导型启动子
•组织特异型启动子
最理想的强的可调控的启动子应该是：在发酵的早期阶段表达载体的启动子被紧紧地阻遏，这样可以避免出现表达载体不稳定，细胞生长缓慢或者由于产物表达而引起细胞死亡等问题。
当细胞达到一定的密度，通过多种诱导使阻遏物失活，RNA聚合酶快速启动转录。
原核细胞的启动子：lac, trp, tac, phoA, λPL , λPＲ都是这一类启动子（诱导型启动子，inducible promoters)）。
T7噬菌体启动子则是另一种类型的启动子，即组成型启动子（constitutive promoters）。
Ｔ７噬菌体启动子只为Ｔ７噬菌体的ＲＮＡ聚合酶所识别，而被Ｔ７RNA聚合酶所起始的转录非常活跃，使得由宿主细胞的RNA聚合酶所进行的转录根本无法与之竞争，这样使细胞中几乎所有的转录都是由Ｔ７RNA聚合酶所操纵，在1-3小时内，目标基因的RNA转录水平可以达到rRNA水平。
由于Ｔ７RNA聚合酶几乎能完整地转录在Ｔ７启动子控制下的所有DNA 序列，所以近年来许多实验室开始选用Ｔ７噬菌体启动子进行外源基因的高效表达。
Ｔ７启动子调控下的表达载体已经形成一个系列，根据外源基因的插入位点可以分别获得直接表达和融合表达。
举例：
•pET, pRSET
•真核基因的表达调控要比原核复杂得多，然而启动子和增强子作为两个重要的转录调控序列，为外源基因在真核细胞中高效表达所必需•真核启动子也分为：组成型和诱导型两大类
•组成型启动子如：SV40、腺病毒、人巨细胞病毒（CMV）、Rous肉瘤病毒•诱导型启动子如：干扰素β启动子、热休克启动子、激素诱导的启动子
mRNA的有效延伸和转录终止与基因的高效表达
•外源基因的转录一旦被起始，接下来的问题就是如何保证mRNA有效的延伸、终止和稳定的积累，尤其在真核细胞中
•在转录物内的衰减（attenuation)和非特异性终止可以诱发转录中的mRNA分子的提前终止（premature termination）
•衰减子（attenuators）具有简单终止子的特性，在原核细胞中处于生物合成的操纵子的启动子和第一个结构基因之间
•由于衰减子序列是负调控元件，为了保证mRNA转录完全，在表达载体的构建中要尽量避免其存在
•色氨酸操纵子中的衰减子（attenuator）
•正常的转录终止子的存在也是外源基因高效表达的一个因素，其作用是防止不必要的转录，使mRNA的长度限制到最小，增加表达质粒的稳定性
•为了防止mRNA在转录中的非特异性终止，抗终止序列元件（antitermination elements）可以加入到表达载体上
•对于真核细胞而言，表达载体上含有转录终止序列和poly A加入位点，是外源基因高水平表达的重要因素
mRNA的稳定性与基因的高效表达
•mRNA的稳定性直接关系到翻译产物的多少，提高其稳定性能提高基因表达效率
•相关报道很少
•对于原核细胞，利用RNase缺失的受体菌是一个可供选择的方案
•对于真核细胞，可以按照基因表达调控中的原则，使mRNA 5’端和3’端正确加工，提高成熟mRNA的稳定性
•
有效的翻译起始与基因的高效表达
•翻译是mRNA指导的多肽链合成的过程
•翻译起始是多种成分协同作用的过程，其中包括： mRNA、16SrRNA 、fMet-tRNA之间的碱基配对，同时，还有核糖体S1蛋白和蛋白合成起始因子的相互作用
•在原核细胞中，影响翻译起始的因素有：起始密码子、核糖体结合位点（SD）、起始密码与SD序列之间的距离、核苷酸组成、 mRNA的二级结构以及mRNA上游的5’ 端非翻译序列和蛋白编码区的5’ 端序列等。
SD序列也即核糖体结合位点（RBS）的序列（是指原核细胞mRNA 5’ 端非翻译区同16SrRNA 3’端的互补序列）
作为翻译起始，可以达到最大效率的一般原则是：
（1）AUG（ATG）是首选的起始密码子
（GUG、UUG、AUU、AUA有时也可用，但非最佳选择）
（2）SD序列也即核糖体结合位点（RBS）的序列（是指原核细胞mRNA 5’ 端非翻译区同16SrRNA 3’端的互补序列）按照统计学的原则，一般的SD序列至少含AGGAGG序列中的4个碱基。
SD序列的存在对原核细胞mRNA的转译起始非常重要
（3）SD与起始密码之间的距离以9±3为适宜。
也有报道指出如果SD序列同16SrRNA3’端的互补碱基大于8时，上述二者之间的距离不重要
（4）除SD序列外，处于起始密码5’端的核苷酸应该是A和U
（5）如果在起始密码AUG后的序列是GCAU或AAAA序列，能使翻译效率提高（6）在翻译起始区周围的序列应不形成明显的二级结构，使翻译起始调控元件如AUG、SD序列易被核糖体识别和结合。
遗传密码应用的偏倚性与基因的高效表达
遗传密码应用的偏倚性（codon usage bias）：
遗传密码的简并性决定了一个氨基酸可以有不止一个密码子为其编码，然而，在蛋白质的生物合成时对简并密码子使用的频率是不同的，对于一个给定的氨基酸，有的密码子使用的频率明显高于其他密码子，这就是所谓的遗传密码应用的偏倚性。
•知道了遗传密码使用的偏倚性，在基因的化学合成过程中，可以选择地使用“高频”密码，改善基因在宿主细胞中的表达水平；
•对于在大肠杆菌中表达的外源基因，如果其mRNA中所含的密码子的分布情况或者外源蛋白质中所含有的氨基酸组成的分布情况同大肠杆菌细胞中正常情况一致，那么大肠杆菌能够使相应的tRNA氨酰化，保持翻译的正常进行；
•如果外源基因的mRNA中含有罕用密码子，或者其氨基酸组成的分布不正常地偏离典型大肠杆菌蛋白质的氨基酸组成分布，那么其蛋白质合成的质和量都会受到影响，出现表达方面的问题。
mRNA的二级结构与基因的高效表达
•翻译起始的速率决定于翻译起始复合物能否有效的形成，而这种复合物的有效形成，在一定程度上取决于翻译起始区的二级结构
•无论是原核还是真核基因的表达，翻译的起始常被mRNA不适当的二级结构所影响
•对于二级结构的分析已经有现成的软件，可以将要分析的序列输入计算机，计算出序列各部分的二级结构及自由能大小
RNA的加工与基因的高效表达
•绝大多数较高等的真核基因含有内含子
•这些内含子在mRNA成熟过程中，在细胞核中被加工去除而产生成熟的mRNA
•有些基因的mRNA的形成非常需要内含子的存在，但机制不清
mRNA序列上终止密码的选择
•合成的多肽链的释放是通过释放因子识别终止密码子实现的
•三个终止密码子的翻译终止效率是不一样的，其中UAA在基因的高水平表达中终止效率最好（因为它被两个释放因子所识别）
表达质粒（或载体）的拷贝数及稳定性与基因的高效表达
•多数情况下，目标基因的扩增程度同基因表达成正比
•对于原核和酵母表达体系而言，选择高拷贝数的质粒，以其为基础组建外源基因的表达载体
•对于其他表达系统，如哺乳类细胞表达体系，可以通过对标记基因加选择压力等方法，提高外源基因的表达水平
•表达载体的稳定性是维持基因表达的必需条件，而表达载体的稳定性不但与表达载体自身特性有关，而且与受体细胞的特性密切相关
外源蛋白的稳定性与基因的高效表达
如何避免克隆的蛋白质被受体细胞选择性地降解？
（1）构建融合基因，产生融合蛋白
（2）产生可分泌的蛋白。
但是不是所有的外源蛋白都可以通过基因操作成为可分泌蛋白
（3）外源蛋白可以在宿主细胞中以包涵体的形式表达，这种不溶性的沉淀复合物可以抵抗宿主细胞中蛋白水解酶的降解，也便于纯化
（4）选择合适的受体表达系统，如选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体细胞，但
是必须注意这种缺陷的细胞往往生长不正常且不稳定。