560484人TH1TH2TH17细胞因子CBA分析试剂盒原理及方法

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为了满足不同用户的实际需要，BD 公司 2005 年初推出了可以自由组合的 CBA Flex set。它改变了 CBA KIT 的固定形式，成为自由组合、灵活搭配的自助餐。 CBA Flex set 的原理与 KIT 相似，捕获微球用来定性目的蛋白，检测抗体的荧光强 度来定量目的蛋白。与 KIT 不同的是，Flex set 微球是带有两种荧光，分别在流式 细胞仪的 FL3 和 FL4 通道检测，通过这两个二维矩阵来对捕获微球定性。PE 检测 抗体在 FL2 通道来对目的蛋白定量。(如下图)
3. 缓冲液： 分析稀释液（G）：30mL 蛋白缓冲液（1），用于 Human TH1/TH2/TH17 细胞因子标准品的复溶和稀释，还用于待测样本的稀释。4C 保存。 洗液（F）：130mL 磷酸盐缓冲液（PBS），含有蛋白和表面活性剂，用于 CBA 分析中微球的洗涤和重悬。4C 保存。 富集血清（H）:10ml 血清缓冲液（1），用于检测血清或血浆样品时，稀 释捕获微球 实验用具 Human TH1/TH2/TH17 细胞因子 CBA 分析试剂盒 I（货号：550749）或 II（货 号：551809） 流式细胞仪（如 FACScan、FACSort、FACSCalibur）和 BD CellQuest 软件 1275mm FALCON 进样管（货号：352008） BD CBA 分析软件（货号：550065） BD CaliBRITE 三色微球（货号：340486）
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2. Human TH1/TH2/TH17 细胞因子捕获微球混悬液的制备 捕获微球分为（A1）-（A7）七瓶，制备捕获微球混悬液之后应立即进行下 一步操作，加入 PE 信号抗体、标准品和待测样本。 1) 计算分析实验管数（包括标准品和质控品），例如分析 8 个待测样本，加 9 个标准管和 1 个阴性质控管，共计 18 管； 2) 充分摇匀各捕获微球试剂瓶（A1）-（A7）； 3) 每个测试需加入（A1）-（A7）捕获微球各 10L，制成捕获微球混悬液， 例如 18 管实验需要（A1）-（A7）捕获微球各 180L； 4) 如果是血清或血浆，先 300g 离心混匀的捕获微球，轻轻吸出上清，加入等 量的 H 富集血清，室温避光 30 分钟。
分析试剂 1. CBA 微球： 人类细胞因子捕获微球（A1-A7）：七种特异性捕获微球的 FL3 荧光强度不 同，从强到弱依此为：（A1）IL-2；（A2）IL-4；（A3）IL-5（Kit I）或 IL-6（Kit II）；（A4）IL-10；（A5）TNF-；（A6）IFN- 和(A7)IL17A。4C 保存，勿冷冻。使用前注意混匀 3-5 秒。 流式细胞仪 CBA 仪器调整微球（D）：调整仪器 PMT 电压和荧光补偿，用 量为 50L/test。 2. 抗体和标准品： Human TH1/TH2/TH17（I 或 II）PE 信号抗体试剂（B）：PE 标记的抗人 IL-2、IL-4、IL-5（Kit I）或 IL-6（Kit II）、IL-10、TNF-、IFN-和 IL17A 特异抗体，用量为 50L/test。4C 保存，勿冷冻。 PE 阳性质控（E1）：PE 标记抗体质控品，流式细胞仪调整仪器补偿时使 用。4C 保存，勿冷冻。
1) 各管加入 50L 捕获微球混悬液，注意加样之前混匀微球； 2) 各管加入 50L 的 Human TH1/TH2/TH17（I 或 II）PE 信号抗体（B）； 3) 各管加入 50L 相应的 Human TH1/TH2/TH17 细胞因子标准品稀释液； 4) 各管加入 50L 检测样本； 5) 室温避光孵育 3 小时；
细胞因子捕获微球、PE 标记的信号抗体和标准品或待测样本共孵育，形成 双抗夹心复合物。在流式细胞仪上获取数据，并使用 BD CBA 分析软件得到各分 析参量的标准曲线和各样本中七种细胞因子的分析结果。 与传统 ELISA 方法相比较，BD CBA 的优点是： 一个样本可以做七种细胞因子的分析，与 ELISA 方法相比较，大大节省 了样本用量 只需要做一组标准品，七种细胞因子的标准曲线同时得到 用传统 ELISA 方法，需要做七种不同细胞因子的实验，而 CBA 实验一 次就可以得到七种细胞因子的分析结果，大大节省了操作时间 BD CBA Flex set 试剂
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图3
Human TH1/TH2/TH17 细胞因子标准品的倍比稀释
稀释后的细胞因子标准品浓度：
蛋白(pg/ml) 原倍 标准 1:2 稀释 1:4 稀释 1:8 稀释 1:16 稀释 1:32 稀释 1:64 稀释 1:128 稀释 1:256 稀释
Human IL-2 Human IL-4 Human IL-5 Human IL-6 Human IL-10 Human TNF- Human IFN- Human IL-17A
Human TH1/TH2/TH17 细胞因子 CBA 分析试剂盒操作步骤
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图2
Human TH1/TH2/TH17 细胞因子 CBA 分析试剂盒操作步骤示意图
1. Human TH1/TH2/TH17 细胞因子标准品的制备 Human TH1/TH2/TH17 细胞因子标准品冻干粉需要复溶并倍比稀释后使用。 1) 一瓶 Human TH1/TH2/TH17 细胞因子标准品（C）用 0.2mL 分析稀释液 （G）复溶成为 10标准品。充分混匀溶解，放置至少 15 分钟； 2) 1275mm FALCON 进样管顺序标记：原倍标准品、1:2 稀释、1:4 稀释、1:8 稀释、1:16 稀释、1:32 稀释、1:64 稀释、1:126 稀释、1:256 稀释； 3) 在原倍标准品管内加入 900L 分析稀释液； 4) 在其余管内各加入 300L 分析稀释液； 5) 在原倍标准品管内加入 100L 的 10标准品，充分混匀； 6) 倍比稀释：取原倍标准品 300L，加入到 1:2 稀释管中，充分混匀；取 1:2 稀释液 300L，加入到 1:4 稀释管中，充分混匀；依此类推，直至 1:256 稀 释管，充分混匀；分析稀释液为阴性标准管。
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312.5 312.5 312.5 312.5 312.5 312.5 312.5 312.5
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FITC 阳性质控（E2）：FITC 标记抗体质控品，流式细胞仪调整仪器补偿 时使用。4C 保存，勿冷冻。 Human TH1/TH2/TH17 细胞因子标准品（C）：为人类细胞因子重组蛋白 冻干品。一瓶用 0.2mL 分析稀释液稀释，成为 10标准品（人 IL-2、IL-4、 IL-5 (Kit I)或 IL-6 (Kit II)、IL-10、TNF-、IFN-和 IL-17A 蛋白各含 50ng/mL）。4C 保存。 Human TH1/TH2/TH17 细胞因子标准品可以存放至有效期。复溶后的 10标 准品在 2-8C 保存，可存放 12 个小时。
BD CBA 流式细胞仪微球捕获芯片技术
例：人 TH1/TH2/TH17 细胞因子 CBA 分析试剂盒
Human TH1/TH2/TH17 Cytokine CBA Kit （货号：560484，80 Tests/Kit）：检测 人血清、血浆或培养上清液中的 IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、TNF-、IFN-和 TH17。 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 B C D E1 E2 F G H 概述 流式细胞仪可以通过细胞大小和荧光信号的不同将各种细胞群体区分开来。 另外，在流式细胞仪上还可以使用单管多色分析的技术。利用流式细胞仪的特点， BD 推出了流式细胞仪微球捕获芯片技术 CBA（Cytometric Bead Array），使用标 有不同荧光强度的一系列微球，同时检测多种可溶性蛋白，极大提高了检测效率。 BD CBA 系统利用流式细胞仪荧光检测灵敏度高的特点，通过微球表面免疫 分析，达到检测可溶性蛋白的目的。在微球上包被有捕获抗体，提供了类似 ELISA 包被微孔板的捕获表面。这样，只需很小体积的样本两，就可以用 CBA 捕 Human IL-2 捕获微球； Human IL-4 捕获微球； Human IL-5 捕获微球； Human IL-10 捕获微球； Human TNF-捕获微球； Human IFN-捕获微球； Human IL-17A 捕获微球； Human TH1/TH2/TH17 PE 信号抗体； Human TH1/TH2/TH17 细胞因子标准品； 流式细胞仪校正微球； PE 阳性质控品 FITC 阳性质控品 洗液 分析稀释液 细胞因子富集血清
6Βιβλιοθήκη Baidu
5) 捕获微球混悬液充分混匀，待用。 实验时每测试管需要 Human TH1/TH2/TH17 细胞因子捕获微球混悬液 50L。详见第 4 部分——Human TH1/TH2/TH17 细胞因子 CBA 操作步骤。 3. 待测样本制备 标准曲线的检测范围是 20-5000 pg/mL。如果待测样本细胞因子的含量超过 了检测范围，则样本需要稀释。稀释步骤如下： 1) 使用分析稀释液（G）按照理想浓度稀释样本（如 1:2、1:10、1:100）； 2) 在加样前充分混匀稀释样本。 4. Human TH1/TH2/TH17 细胞因子 CBA 操作步骤 准备好标准品倍比稀释液、捕获微球混悬液和待测样本，就可以按照以下步 骤进行 CBA 分析样本制备和分析了。为了保证流式细胞仪的定量分析结果，要求 每次实验时都要运行仪器调整程序，并定标。 标准管试剂用量一缆表： 管 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 号 20 pg/mL 40 pg/mL 80 pg/mL 156 pg/Ml 312 pg/mL 625 pg/mL 1250 pg/mL 2500 pg/mL 5000 pg/mL 试 剂 组 成 （所 有 试 剂 用 量 均 为 50 L） 阴性 0 pg/mL 捕获微球混悬液、PE 检测试剂、分析稀释液 捕获微球混悬液、PE 检测试剂、细胞因子标准品 1:256 稀释液 捕获微球混悬液、PE 检测试剂、细胞因子标准品 1:128 稀释液 捕获微球混悬液、PE 检测试剂、细胞因子标准品 1:64 稀释液 捕获微球混悬液、PE 检测试剂、细胞因子标准品 1:32 稀释液 捕获微球混悬液、PE 检测试剂、细胞因子标准品 1:16 稀释液 捕获微球混悬液、PE 检测试剂、细胞因子标准品 1:8 稀释液 捕获微球混悬液、PE 检测试剂、细胞因子标准品 1:4 稀释液 捕获微球混悬液、PE 检测试剂、细胞因子标准品 1:2 稀释液 捕获微球混悬液、PE 检测试剂、细胞因子原倍标准品
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获微球的混悬液检测多种可溶性蛋白了。与传统 ELISA 方法相比，CBA 有许多优 越性：检测范围广，CBA 微球捕获蛋白效率高，减少样本稀释，节省检测时间。 BD Human TH1/TH2/TH17 Cytokine CBA Kit I 和 Kit II 用于定量检测一类和 二类细胞因子，如白细胞介素、肿瘤坏死因子和干扰素水平，一份样本可以分析 6 种细胞因子。样本可以使用组织培养上清液、血清和 EDTA 抗凝血浆。 实验原理 七组荧光强度不同的捕获微球上分别包被 IL-2、IL-4、IL-5（IL-6）、IL10、TNF-、IFN-和 IL-17A 特异抗体。这七种不同的捕获微球构成了 CBA 分析 基础。在 BD FACS 流式细胞仪上，通过 FL3 的差别来区分七种不同的捕获微球。